基于WNT/β-catenin信号通路研究DMBT1调控慢性肾小球肾炎发生发展的作用机制

目的研究DMBT1在人慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis,CGN)中相对表达及甲基化水平,分析DMBT1与WNT/β-catenin信号通路在CGN发生发展中的关联。方法收集30例正常人肾组织(肾癌手术中切除的癌旁正常肾组织)、86例CGN患者肾组织作为研究对象,通过实时定量PCR和免疫蛋白印迹实验验证DMBT1在CGN肾组织中的表达,采用甲基化PCR分析DMBT1在CGN患者中甲基化水平。选取人肾小球足细胞分为两组:DMBT1转染组(进行DMBT1基因过表达)和对照组,采用细胞划痕实验研究两组细胞迁移情况;通过免疫蛋白印迹实验验证DMBT1对WNT/β-catenin信号通路的影响。结果与正常肾组织相比,DMBT1在CGN患者肾组织中表达下调(P0.01);甲基化PCR结果显示CGN患者的DMBT1甲基化程度明显增高;DMBT1基因过表达能抑制细胞迁移和侵袭(P0.01);过表达DMBT1后,WNT/β-catenin信号通路及其下游细胞因子明显受到抑制。结论 DMBT1在CGN中下调,能作为重要的调控因子参与CGN的发生发展。     

MAP4K1促进皮肤黑色素瘤迁移和侵袭的机制研究

目的探讨MAP4K1在黑色素瘤(cutaneous melanoma, CM)细胞和组织中表达及对恶性CM细胞A375迁移、侵袭的影响和机制。方法收集自2010年1月至2015年12月重庆市中医院皮肤科诊治的CM患者54例,采用GEPIA在线分析CM组织中MAP4K1的表达,实时定量聚合酶链法和免疫组织化学法检测CM组织中MAP4K1 m RNA和蛋白的表达水平;以MAP4K1基因表达最高的A375细胞为研究对象,采用脂质体转染法将MAP4K1抑制质粒和对照质粒转染至A375细胞;免疫蛋白印迹实验和实时定量聚合酶链法分别检测MAP4K1的基因敲除;分别通过Transwell实验检测MAP4K1敲除后对细胞侵袭的影响;荧光素酶报告实验检测MAP4K1对YAP/TAZ的调控;GEPIA验证MAP4K1与Hippo-YAP通路下游靶点的表达相关性;免疫蛋白印迹实验验证MAP4K1敲除后对Hippo-YAP信号通路的影响。结果与癌旁组织相比,MAP4K1 m RNA和蛋白在皮肤恶性CM细胞和组织中的表达上调(P0.001);MAP4K1基因敲除A375细胞迁移和侵袭的能力明显受到抑制(P0.001);MAP4K1敲除后YAP/TAZ的转录活性及下游的靶分子下调;MAP4K1基因敲除能抑制Hippo-YAP通路传导。结论 MAP4K1在CM中表达上调,可能作为潜在的癌基因调控Hippo-YAP通路促进CM的发生发展。     

靶向β-catenin的shRNA抑制结肠癌细胞增殖的体外实验研究

目的探讨靶向β-catenin的shRNA对结肠癌细胞Colo205的WNT通路的阻断和该基因沉默效应对结肠癌细胞在体外的生长抑制作用。方法构建靶向β-catenin的shRNA载体质粒和阴性对照载体.然后分别转染人结肠癌细胞Colo205。用RT-PCR和Western印迹法检测β-catenin的mRNA和蛋白的表达情况,细胞免疫荧光染色法检测β-catenin蛋白的表达。噻唑蓝实验评价转染后各组细胞的体外增殖情况。软琼脂集落形成实验检测各组细胞的非锚着依赖性生长的能力。结果成功构建了靶向β-catenin的shRNA和阴性对照质粒载体。特异性靶向β-catenin的shRNA能够明显下调β-catenin mRNA,并抑制β-catenin蛋白的表达,其抑制率分别为47.89％和45.26％（P〈0.05）。转染了特异性shRNA的实验组（CAT组）细胞增殖在转染后呈现随时间延长而进行性抑制的现象。在转染后72h,CAT组的细胞存活率为48.5％。与空白对照组的91.3％相比明显降低（P〈0.05）。在软琼脂里CAT组的细胞克隆数目（9个）明显少于空白对照组（46个）和阴性对照组（43个）（P〈0.05）。结论靶向β-catenin的特异性shRNA对结肠癌Colo205细胞具有沉默β-catenin基因表达从而阻断WNT信号通路的作用,并且能够有效地在体外抑制结肠癌细胞的增殖。     

LncRNA SNHG7通过调控β-catenin蛋白影响乳腺癌细胞的增值、迁移和侵袭

目的探讨长链非编码RNA SNHG7 (LncRNA SNHG7)在乳腺癌细胞系中的功能及其机制。方法 RT-qPCR检测LncRNA SNHG7在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系的表达水平,核浆分离实验检测LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的定位。在MDA-MB-231细胞系中,siRNA沉默LncRNA SNHG7后,利用MTS和平板克隆形成实验研究LncRNA SNHG7对细胞增殖的影响;利用划痕和transwell实验研究LncRNA SNHG7对细胞侵袭迁移的影响。通过Western blot(WB)实验研究LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系中可能参与的分子机制。结果 qPCR结果显示,与癌旁组织相比,LncRNA SNHG7在乳腺癌组织中高表达(P0.05);与乳腺正常上皮MCF-10A相比,LncRNA SNHG7在乳腺癌细胞系中高表达。siRNA沉默LncRNA SNHG7后,细胞增殖能力和平板克隆形成能力被抑制(P0.05),划痕实验显示细胞的愈合能力降低(P0.05),trans well实验显示细胞的迁移和侵袭能力均被抑制(P0.05)。WB结果显示β-catenin、 C-Myc和CyclinD1蛋白的表达下调,磷酸化的β-catenin(p-β-catenin)蛋白降解增加。结论 LncRNA SNHG7在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中高表达。沉默LncRNA SNHG7后,细胞的增殖和侵袭迁移能力均降低。WB结果表明LncRNA SN HG7调控乳腺癌细胞的增殖和侵袭迁移可能与β-catenin蛋白的表达下调和p-β-catenin蛋白降解增加有关。     

新型过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞Wnt-β连环素信号通路的影响

目的 观察新型过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)激动剂DH9对人多囊肾囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)中Wnt-β连环素(catenin)信号通路的影响.方法 予以不同浓度的DH9作用WT9-12细胞72 h,MTT法检测细胞增殖情况;RT-PCR技术检测DH9干预后β-catenin mRNA水平.予GSK3β抑制剂(SB216763)或PPARγ抑制剂GW9662预处理WT9-12细胞后,再予以60 μmol/L DH9或单给DH9干预,Western印迹分别分析β-catenin、磷酸化β-catenin、GSK3β、磷酸化GSK3β蛋白水平.结果 DH9对WT9-12细胞增殖有抑制作用,60μmol/L DH9干预72 h对细胞的增殖抑制达50％,并随着干预时间延长,抑制率增高.60μmol/L DH9可下调β-catenin的蛋白表达(P＜0.01),上调磷酸化β-catenin的蛋白表达(P＜0.01),具有剂量依赖性.而DH9对β-catenin的mRNA水平无明显改变.DH9可上调磷酸化GSK3β的蛋白表达(P＜0.01),但对GSK3β的表达无明显影响.在SB216763预处理WT9-12细胞与DH9共处理72 h后,发现可逆转DH9对β-catenin的下调作用(P＜0.01),但GW9662对DH9下凋β-catenin的作用无明显改变.结论 DH9抑制WT9-12细胞的增殖具有时间和剂量依赖性,并且这种增殖抑制作用可通过GSK3β依赖的方式下调β-catenin的蛋白表达从而抑制Wnt-β-catenin信号通路实现,与PPARγ途径无关.     

Sonic hedgehog和β-连环蛋白在胰腺癌组织中的表达及其相关性研究

目的 研究胚胎发育信号通路Sonic hedgehog(SHH)和WNT/β-catenin在胰腺癌组织中的表达及其临床意义.方法 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western印迹法检测胰腺癌组织及癌旁组织中SHH和β-catenin的mRNA和蛋白表达情况.结果 SHH mRNA和蛋白在胰腺癌组织中的阳性率分别为81.6%和79.6%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P＜0.05).β-catenin蛋白在胰腺癌组织中的阳性率为71.4%,与癌旁组织相比,差异有统计学意义(P＜0.05).而β-catenin mRNA在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达水平均较低,差异无统计学意义(P＞0.05).SHH和β-catenin蛋白表达与年龄、肿瘤大小、组织学类型和肿瘤部位等病理因素均无关(P＞0.05),而在不同淋巴结转移状况和TNM分期的病例组中,二者表达差异有统计学意义(P＜0.05).配对资料的Spearman相关分析显示,SHH表达与β-catenin表达呈正相关关系(r=0.352,P＜0.05).结论 SHH和WNT/β-catenin信号通路在胰腺癌组织中呈活化状态,二者之间的交叉对话对胰腺癌的发生发展可能起重要作用.     

Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌发生中的分子机制研究

目的探讨Wnt/β-Catenin信号通路在肝癌细胞增殖、迁移方面的影响和其在肝癌发生发展中的可能作用。方法体外培养HepG2和L02细胞,采用免疫荧光和Western Blot检测Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平。培养的HepG2细胞分别用浓度100ng/ml的Wnt3α和20 ng/ml的DKK1处理,采用CCK-8检测细胞增殖活力,流式细胞实验检测细胞周期,Western Blot检测β-catenin、GSK3β、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平,Trans-well检测HepG2的迁移情况。结果与正常肝细胞L02相比,HepG2细胞高表达β-catenin,cyclin D1和c-myc,低表达GSK3β。Wnt3α能够显著促进HepG2细胞的增殖活力,而DKK1能够显著抑制其增殖。与Wnt3α组相比,DKK1处理组细胞G0/G1期细胞比例增加,(68.6±0.5)%VS(47.5±1.5)%(P0.01),而S期细胞比例减少(17.4±0.5)%VS(28.6±0.5)%,(P0.01)。Western Blot检测结果说明,Wnt3α提高了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达水平,抑制了GSK3β的表达,而DKK1抑制了β-catenin、cyclin D1和c-myc的表达。迁移实验透膜细胞数对照组为(176.40±12.98)、Wnt3α组为(238.20±18.38)、DKK1组为(110.40±9.46),P0.05。结论 Wnt/β-catenin信号通路在促进HepG2细胞的增殖和迁移方面起重要作用,在肝癌的发生发展和转移中起着重要的作用,是肝癌发生的重要分子机制。     

内质网应激蛋白ATF4调控STAT3信号通路促进黑色素瘤细胞生长及转移的研究

目的:探索内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤发生发展中的作用和机制。方法:运用荧光定量PCR技术分析对比黑色素瘤细胞系和黑色素细胞系内ATF4表达的差异,运用CCK-8染色以及Brd U染色检测细胞生长及增殖能力,运用Tranwell技术检测细胞转移能力,运用免疫印迹技术检测细胞内STAT3磷酸化水平。结果:ATF4 m RNA在黑色素瘤细胞中的表达水平显著高于黑色素细胞,显示肿瘤细胞中含有更高水平的ATF4 m RNA;在A375细胞中过表达ATF4后,细胞生长增殖速率提高,转移能力增强,而降低内源ATF4后,MM200细胞的增殖速度和转移能力都出现明显降低。同时,A375细胞内ATF4含量的增加也引起了细胞内STAT3磷酸化水平以及细胞内IL-6表达的显著升高。结论:内质网应激蛋白ATF4在黑色素瘤的发生发展中具有重要的调控作用,细胞内ATF4可能是参与调控了IL-6-STAT3信号通路,从而促进黑色素瘤细胞增殖和迁移。     

Cathepsin B影响肝细胞肝癌增殖与凋亡的实验研究

目的:探讨组织蛋白酶B(Cat B)对肝细胞肝癌增殖和凋亡的影响及其相关作用机制。方法:将pcDNA3-Cat B过表达质粒转染肝细胞肝癌细胞系BEL-7402,RT-PCR及免疫印迹法分别检测Cat B mRNA及蛋白的表达,CCK-8、流式细胞法观察Cat B的过表达对BEL-7402细胞系增殖和凋亡的影响;将Cat B siRNA转染肝细胞肝癌细胞系HepG2,RT-PCR及免疫印迹法分别检测Cat B mRNA及蛋白的表达,CCK-8、流式细胞法观察Cat B的低表达对HepG2细胞系增殖和凋亡的影响;针对转染了Cat B siRNA的HepG2细胞系及经整合素αvβ3抗体预处理的过表达Cat B的BEL-7402细胞系,应用免疫印迹法检测Akt和p-Akt的表达情况。结果:CCK-8法发现,Cat B表达上调能够显著促进肝癌细胞的增殖,相反Cat B的表达下调能够显著抑制肝癌细胞的增殖(P0.001),流式细胞法发现,Cat B表达上调能够抑制肝癌细胞的凋亡,而Cat B表达下调能够促进肝癌细胞的凋亡(P0.05);Cat B能显著促进p-Akt的表达,而经过整合素αvβ3抗体预处理的过表达Cat B的肝癌细胞系中,p-Akt的表达情况显著下降。结论:Cat B显著促进肝癌细胞的增殖并且抑制细胞凋亡,这种作用可能是通过整合素αvβ3/PI3K/p-Akt信号通路来实现的。     

冬凌草甲素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制人骨肉瘤细胞143B生长的机制研究

[目的]研究冬凌草甲素(oridonin,ORI)对人骨肉瘤143B细胞增殖的抑制作用与Wnt/β-catenin信号的关系。[方法]结晶紫染色法及Western blot研究ORI对143B细胞增殖的抑制作用;流式细胞术及Western blot检测ORI诱导143B细胞凋亡的作用;通过β-catenin/Tcf4荧光素酶报告质粒检测ORI对Wnt/β-catenin信号活性的影响;Western blot和RT-PCR分析ORI对Wnt/β-catenin信号相关因子β-catenin、Dickkopf1(Dkk1)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)及p-GSK3β表达水平的影响;最后,采用外源性过表达β-catenin和Dkk1以及沉默β-catenin研究ORI抑制143B细胞增殖与Wnt/β-catenin的关系。[结果]与对照组比较,ORI能明显抑制143B细胞增殖(P0.05),下调增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白表达;ORI能显著诱导细胞凋亡、上调caspase3表达并将细胞周期阻滞在G1期;ORI能明显抑制细胞中β-catenin/Tcf4的转录活性;ORI对β-catenin的mRNA表达无影响,但能上调Dkk1的mRNA表达;ORI能增加Dkk1和GSK3β蛋白表达,并降低GSK3β磷酸化水平和β-catenin蛋白水平;外源性过表达β-catenin能减弱ORI抑制143B细胞增殖的作用,而过表达Dkk1和沉默β-catenin能增强ORI抑制143B细胞增殖的作用。[结论]ORI能抑制人骨肉瘤143B细胞的增殖并诱导其凋亡,该作用可能与抑制Wnt/β-catenin信号活性相关;而ORI抑制Wnt/β-catenin信号活性则可能与激活GSK3β和Dkk1活性有关。     

Wnt/β-catenin信号通路在多种人前列腺癌细胞系中的表达研究及意义

目的:检测多种不同上皮细胞间质转化(EMT)特性的人前列腺癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键蛋白的表达,对细胞中Wnt/β-catenin信号通路的功能状态进行鉴定,分析其在前列腺癌EMT现象中可能的作用。方法:用Western印迹法鉴定LNCaP及其亚细胞系C4、C4-2、C4-2B和ARCaP亚细胞系IF11、IA8,以及PC-3、DU145细胞中β-连环素(β-catenin),糖原合成酶3β(t-GSK3β),磷酸化糖原合成酶3β(p-GSK3β)的表达差异情况。结果:β-catenin和p-GSK3β在LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、IF11、IA8中表达较高,在PC-3中表达较低,在DU145中表达缺失,t-GSK3β在上述所有细胞中表达无明显差异。p-GSK3β/t-GSK3β比值在LNCaP、C4、C4-2、C4-2B、IF11、IA8中较高,在PC-3和DU145中较低。结论:8种不同EMT特性的前列腺癌细胞系中,Wnt/β-catenin信号通路的功能状态存在差异。     

人结肠癌细胞中高尔基磷蛋白3表达与Wnt信号通路的关系

目的:探讨人结肠癌细胞中高尔基磷蛋白3(GOLPH3)基因表达与Wnt信号通路活性的关系。方法:用RT-PCR方法检测4种人结肠癌细胞(HCT116、HT29、SW480、SW620)中GOLPH3mRNA的表达,选取GOLPH3高表达的细胞株行GOLPH3基因干扰,用RT-PCR检测干扰效果,然后用TOPFlash报告基因、平板克隆实验、Western blot法分别检测干扰后细胞Wnt信号通路活性、增殖活性以及GOLPH3与β-catenin表达的变化。结果:4种结肠癌细胞中SW620细胞的GOLPH3mRNA相对表达量最高;SW620细胞转染GOLPH3siRNA后GOLPH3 mRNA的相对表达量明显降低(P0.001);与未处理的SW620细胞比较,转染GOLPH3siRNA的SW620细胞Wnt通路转录活性明显降低(0.342 vs.1.000,P0.001)、癌细胞集落形成数明显减少(82.333 vs.207.333,P0.001)、GOLPH3与β-catenin蛋白表达均明显降低(0.260 vs.1.00;0.182 vs.1.00,均P0.001)。结论:人结肠癌细胞中GOLPH3的高表达可增加Wnt/β-catenin细胞信号通路活性,从而促进细胞增殖。结肠肿瘤;高尔基磷蛋白3;Wnt信号通路     

Musashi RNA结合蛋白2通过Wnt/β-catenin信号通路对肝癌细胞增殖的影响

目的探究Musashi RNA结合蛋白2(MSI2)如何通过Wnt/β-catenin信号通路发挥调控肝癌细胞增殖的作用。方法通过转染短发夹RNA(shRNA)抑制MSI2表达, 将细胞分为转染对照质粒(sh-Ctrl)组和sh-MSI2组。MSI2过表达实验中将细胞分为对照组(Vector组, 转染空白质粒Vector)和过表达组(MSI2组, 转染MSI2重组质粒)。CCK-8和平板克隆实验检测细胞增殖。蛋白质印迹法检测干预MSI2后β-catenin、转录因子7(TCF7)和淋巴增强因子1(LEF1)的表达。Rescue回复实验中将细胞分为MSI2+sh-Ctrl组(同时转染MSI2重组质粒和sh-Ctrl质粒)和MSI2+sh-β-catenin组(同时转染MSI2重组质粒和sh-β-catenin质粒)。在过表达MSI2的基础上敲低β-catenin进行肝癌细胞增殖能力检测。结果 sh-MSI2组HepG2和MHCC97H细胞的增殖率均低于sh-Ctrl组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。MSI2组的SMMC-7721和MHCC97L细胞增殖率均高于Vector组...     

微小核糖核酸miR-613通过下调E2F5的表达抑制前列腺癌细胞增殖

目的研究微小核糖核酸miR-613在前列腺癌组织及细胞系中的表达及其对前列腺癌细胞增殖的影响。方法实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测前列腺癌组织及细胞系中miR-613的表达情况,并检测各组细胞中E2F5mRNA的表达情况;蛋白质印迹法检测E2F5蛋白的表达;通过细胞增殖实验检测过表达miR-613后细胞的增殖能力;集落形成实验检测单个细胞克隆增殖情况;双荧光素酶报告实验验证miR-613和E2F5是否靶向结合。结果 qPCR结果显示,miR-613在前列腺癌组织和细胞系均显示低表达。与Control组相比,转染miR-613组PC3和LnCap细胞中E2F5蛋白表达水平降低,细胞增殖明显受抑制。而在过表达E2F5后,PC3和LnCap细胞增殖又明显回升,可逆转miR-613的调节作用。双荧光素酶报告实验结果表明,miR-613能够直接靶向E2F5 3′-UTR。结论 miR-613能够通过下调E2F5转录因子的表达而抑制前列腺癌细胞增殖。     

阻断PI3K/AKT/mTOR通路增强顺铂诱导的人皮肤黑素瘤细胞株A375凋亡的机制研究

目的:本实验探讨抑制PI3K/AKT/mTOR通路对顺铂诱导人皮肤黑素瘤细胞株A375细胞凋亡作用及其机制。方法:用顺铂处理人皮肤黑素瘤细胞株A375细胞后Western blot检测细胞凋亡、PI3K/AKT/mTOR通路的活化情况以及细胞增殖-毒性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)。用PI3K的抑制剂LY294002(LY)和mTOR的抑制剂雷帕霉素(Rapamycin,Rap)分别预处理以研究其对顺铂处理后人皮肤黑素瘤细胞株A375细胞凋亡的协同作用。为进一步探索阻断PI3K/AKT/mTOR通路对顺铂处理后人皮肤黑素瘤细胞株A375细胞凋亡的协同作用机制,采用Western blot检测阻断PI3K/AKT/mTOR后联用顺铂处理人皮肤黑素瘤细胞株A375细胞中Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达。结果:顺铂处理后的A375黑素瘤细胞中PARP的活化剪切体表达量水平呈浓度和时间依赖性增加,细胞活力呈浓度和时间依赖性降低(P0.05)。顺铂处理A375黑素瘤细胞后PI3K/AKT/mTOR通路的活化。阻断PI3K/AKT/mTOR通路再用顺铂联合处理A375黑素瘤细胞后PARP的活化剪切体表达量明显上调以及细胞活力明显降低(P0.05)。阻断PI3K/AKT/mTOR通路后再用顺铂联合处理A375黑素瘤细胞发现Bcl-2蛋白和Bcl-xl表达水平下调。结论:阻断PI3K/AKT/mTOR通路对顺铂诱导的细胞凋亡具有协同作用,该协同作用可能与Bcl-2和Bcl-xl蛋白下调有关。     

1,25(OH)2D3对人骨肉瘤MG63细胞基质GLA蛋白及Wnt信号通路的影响

目的观察1,25(OH)_2D_3对人成骨肉瘤MG63细胞株Wnt信号通路及MGP表达的影响,探讨其在骨质疏松发病中可能的新机制。方法分别使用10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3、200 ng/ml Wnt信号通路阻断剂DKK-1、10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3+200 ng/ml DKK-1干预人骨肉瘤细胞MG63细胞株48 h,使用实时荧光定量RT-PCR及western-blot技术测定Wnt/β-catenin信号通路中相关因子β-catenin、Runx2、LRP5及MGP基因及蛋白表达的影响。结果 (1)10-8mol/L 1,25(OH)_2D_3上调MG63细胞中Wnt/β-catenin信号通路中相关因子β-catenin、Runx2、LRP5及MGP的基因表达及蛋白的表达,其中上调基因分别是对照组的2.73倍、3.72倍、1.53倍、2.31倍,差异有统计学意义(P0.05);上调蛋白表达分别是对照组的1.13倍、1.17倍、1.14倍、1.21倍,差异有统计学意义(P0.05)。(2)DKK1下调β-catenin、LRP5、Runx2、MGP的基因及蛋白表达,其中下调基因表达分别是对照组的0.34倍、0.52倍、0.42倍、0.78倍,差异有统计学意义(P0.05)。下调蛋白表达分别是对照组的0.93倍、0.92倍、0.87倍、0.86倍,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 1,25(OH)_2D_3有可能通过Wnt/β-catenin信号通路影响MGP的表达。     

orexin-1受体抑制剂通过Wnt通路促进骨髓间充质干 细胞的成骨分化

目的研究Wnt/β-catenin信号通路对orexin-1受体抑制剂介导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响。方法(1)分离提取SD大鼠股骨、胫骨的BMSCs,用流式细胞仪进行细胞表型鉴定;(2)实验分组:对照组、10-5mol/L、10-6mol/L质量浓度的orexin-1受体抑制剂溶液,于成骨诱导第5天免疫印迹法和实时荧光定量PCR法观察Wnt/β-catenin信号通路关键靶点蛋白Dickkopf-1、Gsk3β、β-catenin以及基因Gsk3β、β-catenin mRNA表达,以观察Wnt信号通路对orexin-1受体抑制剂诱导大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。结果 10~(-5)mol/L、10~(-6)mol/L的orexin-1受体抑制剂处理BMSCs5天后,Dickkopf-1、β-catenin和GSK3β蛋白表达升高,β-catenin和GSK3βmRNA表达升高。结论 orexin-1受体抑制剂促进大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化的作用可能与调控Wnt/β-catenin信号通路有关。     

长链非编码RNA MALAT-1通过EZH2-β-catenin信号通路调控肾癌细胞的增殖、凋亡及侵袭

目的探究长链非编码RNA肺腺癌转移相关转录因子1(LncRNA MALAT-1)在肾癌组织及肾细胞癌(RCC)细胞株中的表达情况及其在调控RCC细胞增殖、凋亡及侵袭过程中的作用机制。方法利用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验检测正常和RCC组织以及HK-2、786-O、ACHN及Caki-1细胞中MALAT-1的表达情况;将786-O细胞随机分为3组,分别转染MALAT-1-siRNA沉默载体(si-MALAT-1组)及MALAT-1-siRNA阴性表达载体(si-NC组),空白对照组加入PBS(Blank组)。采用CCK-8法、流式细胞术法、Transwell法检测细胞增殖、凋亡及侵袭能力;利用Western blot法检测Zeste基因同源物增强子2(EZH2)及β-catenin的蛋白表达水平。结果与正常组织及细胞株HK-2相比,肾癌组织及细胞株786-O、ACHN及Caki-1中MALAT-1的表达水平明显增加(P<0.05);与Blank组和si-NC组相比,si-MALAT-1组RCC细胞活性和侵袭能力明显降低、细胞凋亡率明显增加、EZH2及β-catenin的蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论LncRNA MALAT-1在肾癌组织及RCC细胞中表达上调;抑制MALAT-1的表达能够抑制RCC细胞的增殖和侵袭,促进凋亡,其机制可能与下调EZH2-β-catenin信号通路的表达有关。     

WNT激活剂对人骨髓基质干细胞成脂-成骨分化的影响

目的 观察WNT信号通路激活剂SB-216763对于人骨髓基质于细胞(hBMSCs)成脂-成骨分化的影响.方法 从3例临床股骨头标本中分离培养hBMSCs与5μmol/L SB-216763共同培养,观察hBMSCs表达β-连锁蛋白(β-catenin)的变化,检测hBMSCs增殖能力、成脂分化能力和成骨细胞诱导分化时碱性磷酸酶(ALP)活性的变化.结果 SB-216763可以显著促进hBMSCs表达β-catenin (30.2±2.7比13.3±2.1,P＜0.01)、促进hBMSCs增殖(P＜0.01)、抑制hBMSCs向脂肪细胞分化[油红O(Oil Red-O)阳性细胞数:27.4±3.2比8.4±2.1,P＜0.01]、降低hBMSCs的ALP活性(P＜0.01).结论 激活WNT信号通路可以促进hBMSCs的增殖,抑制hBMSCs向脂肪细胞分化并且抑制hBMSCs的成骨活性.     

DKK3在慢性肾小球肾炎中表达及诱导肾小球足细胞迁移的机制研究

目的研究DKK3在慢性肾小球肾炎中的表达,分析DKK3在慢性肾小球肾炎发生、发展中的意义。方法选取人正常肾组织20例、慢性肾小球肾炎组织80例为研究材料,通过实时定量PCR和免疫蛋白印迹实验验证DKK3在人正常肾组织、慢性肾小球肾炎组织中的相对表达;实时定量PCR分析β-catenin mRNA在人正常肾组织、慢性肾小球肾炎组织中的相对表达,Pearson相关性分析DKK3与β-catenin在慢性肾小球肾炎组织中的表达相关性;选取肾小球足细胞MPC5进行DKK3基因过表达,transwell实验验证实验组和对照组中细胞迁移和侵袭的影响;免疫蛋白印迹实验验证DKK3对细胞迁移和侵袭的影响机制。结果与正常肾组织相比,DKK3在慢性肾小球肾炎组织中表达上调(P0.01),同时DKK3的表达与β-catenin呈正相关性,并参与慢性肾小球肾炎的进展(P=0.0002,r~2=0.1651);DKK3基因过表达后能明显促进细胞迁移和侵袭(P0.01);免疫蛋白印迹实验显示DKK3基因过表达后能上调Vimentin、N-cadherin、MMP7、β-catenin蛋白的表达,下调E-cadherin蛋白的表达水平(P0.01)。结论 DKK3在慢性肾小球肾炎组织中表达上调,可能是重要的调控因子参与慢性肾小球肾炎的进展。