ssp411基因siRNA表达载体的构建与有效干扰质粒的筛选

目的 为探索精子细胞特异表达的新基因ssp411在受精及早胚发育中的功能,设计并构建了以ssp411基因为靶点的RNA干扰表达载体siRNA-ssp411s,筛选其中对ssp411基因有显著干扰作用的表达质粒.方法 根据已知的ssp411 mRNA序列,选择设计三条带发卡结构的核苷酸序列,克隆到含有U6启动子的载体pRNAT-U6.1中并测序分析.用脂质体转染的方法将干扰质粒与表达质粒ssp411-pDsRed共转染293T细胞,24h后,荧光倒置显微镜观察转染效率,并收集细胞,通过实时定量PCR方法检测不同干扰质粒对ssp411 mRNA的干扰效果.结果 3个ssp411的siRNA片断被成功克隆到pRNAT-U6.1质粒载体中,插入片段测序结果与设计的序列完全一致.实时定量PCR结果表明,针对ssp411基因蛋白编码区3-22序列构建的干扰质粒效果最好,干扰效率可达71%.结论 成功构建了能表达ssp411 shRNA(small hairpin RNA)的重组质粒,同时通过共转染技术,筛选到一个干扰效果达70%以上的干扰片断,为建立转基因RNA干扰小鼠模型,在体内研究ssp411基因及蛋白的生殖生物学功能打好基础.     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

质粒介导的RNA干扰对AD293细胞中HBcAg表达的抑制作用

目的:研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用.方法:设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果.结果:构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76%,实时荧光定量PCR 法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6%.结论:质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法.     

髓系触发受体-1基因RNAi 慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建髓系触发受体-1(TREM-1)基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反?khgr;械淖饔谩７椒?根据小鼠TREM-1 mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNA oligo, 其两端含酶切位点黏端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,经PCR及测序鉴定后,将以上质粒分别与包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用real-time PCR和ELISA检测TREM-1 mRNA和蛋白表达水平。实时定量PCR和ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后均可以显著抑制TREM-1的表达,以pGCSIL-GFP/Lenti-1组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。 结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体,所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌内毒素所诱导的TREM-1的表达。     

SHARP-2特异的RNA干扰腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的 构建转录SHARP-2 基因特异性的小发夹RNA(SHARP-2-shRNA)的重组腺病毒(Rad-hSHARP),并观察其对正常大鼠肾细胞(NRK cell)SHARP-2基因的表达影响.方法 设计带有SHAPR-2特异性干扰序列的PDC316-SHARP-shRNA穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre 共转染293 细胞,并在293 细胞内进行同源重组,构建Rad-hSHARP.并使用实时定量RT-PCR在NRK细胞中对重组腺病毒干扰效果进行鉴定.结果 成功构建了特异性SHARP-2基因RNA 干扰的腺病毒载体系统,并有效抑制NRK 细胞中SHARP-2 基因的表达.结论 成功构建SHARP-2-shRNA 的Rad-hSHARP,为利用特异性沉默SHARP-2基因的腺病毒载体抑制T细胞增殖活化研究奠定基础.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒.方法 利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hHlneo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定.重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3.实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2 mRNA和蛋白表达(P＜0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率＞80%.结论 构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达.实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础.     

连环蛋白p120 shRNA重组慢病毒载体构建及鉴定

目的构建连环蛋白p120特异性shRNA重组慢病毒载体,感染胰腺癌PANC-1细胞,鉴定干扰效果。方法针对p120ctn mRNA设计合成3对shRNA序列,连接入酶切线性化的慢病毒载体pGCSIL-GFP,PCR鉴定及测序正确后与构建成功的含p120ctn基因的载体pGC-FU-p120ctn-3FLAG共转染293T细胞,蛋白质印迹分析筛选有效shRNA序列,包装慢病毒,测定病毒滴度。重组慢病毒感染胰腺癌PANC-1细胞,实时定量PCR及蛋白质印迹分析鉴定干扰效果。结果 PCR及测序证实成功构建出p120ctn-shRNA-LV慢病毒载体,病毒滴度达到3×109TU/ml。重组慢病毒感染PANC-1细胞后,实时定量PCR提示PANC-1细胞p120ctn mRNA表达下降82.6%(P0.05),蛋白质印迹分析提示p120ctn蛋白表达较转染前显著下降。结论成功构建出p120ctn基因shRNA慢病毒载体,为进一步研究p120ctn在胰腺癌浸润及转移中的作用奠定了基础。     

ABCE1特异性siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建并鉴定ABCE1基因短发夹状干扰RNA（shRNA）慢病毒载体,以便进一步研究ABCE1的功能。方法针对已经筛选确定的ABCE1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/GFP载体连接、转化,产生pLV-sh-ABCE1慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用pLV-sh-ABCE1、pHelper 1.0和pHelper 2.0 3种质粒共转染包装细胞人胚肾293T细胞,包装产生重组慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果PCR和测序证实,成功构建ABCE1shRNA的慢病毒载体pLV-sh-ABCE1。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×108TU/ML。结论成功构建ABCE1基因shRNA慢病毒载体,为应用RNAi研究ABCE1功能奠定基础。     

NELL2基因真核表达载体和microRNA干扰质粒的构建及其体外干预效应的研究

目的 构建大鼠NELL2基因真核表达载体peDNA3.1(-)-NELL2的mieroRNA(miRNA)干扰质粒,观察其转染体外细胞系后对NELL2 mRNA表达的干预效应.方法 从SD大鼠下丘脑组织中提取总RNA,设计特异性引物,采用RT-PCR技术扩增NELL2基因全长cDNA,利用T载体将目的 片段克隆至表达载体peDNA3.1(-),得到重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2.针对NELL2基因分别设计4对pre-miRNA序列,通过T4连接酶克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体构建干扰质粒(p-NELL2-miRNA1～4).将p-NELL2-miRNA1～4分别与pcDNA3.1(-)-NELL2共转染人胚肾细胞系(HEK293)(p-NELL2-miRNA1～4干预组).采用Real-Time PCR技术检测转染后48 h细胞NELL2 mRNA表达;以转染peDNA3.1(-)-NELL2细胞作为阳性对照组,以共转染pcDNA3.1(-)-NELL2和阴性对照干扰质粒pre-miRNA-neg细胞作为阴性对照组.结果 酶切和测序鉴定结果表明:重组质粒pcDNA3.1(-)-NELL2和干扰质粒p-NELL2-miRNA的片段大小与预计相符,且克隆序列正确.Real-Time PCR结果显示:干预组细胞NELL2 mRNA表达显著低于阳性和阴性对照组(P＜0.05或P＜0.01).结论 成功构建NELL2基因真核表达载体及其microRNA干扰质粒.证实干扰质粒对HEK293细胞NELL2 mRNA表达具有特异性的抑制效应.     

核干细胞因子基因siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体.方法 根据GenBartk提供的NS基因AY825265 mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144 nt,199-217 nt和487-505 nt 3个19 bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆.转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况.结果 PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致.RT-PCR和Western blot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NS mRNA和蛋白水平的表达.结论 成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础.     

抑制HBV复制的小干扰RNA的重组腺病毒构建与鉴定

目的构建可同时表达绿荧光蛋白（GFP）和针对HBVS区基因的小干扰RNA（siRNA）的重组腺病毒,并研究该siRNA在体外对HBV的抑制作用。方法采用PCR技术自质粒pEGFP-C1中扩增含CMV启动子的GFP表达框,自质粒pAVU6＋4sh579中扩增含U6启动子的针对HBV S 区579-597位基因的siRNA表达框,分别将两个表达框克隆至穿梭载体质粒pShuttle内,与质粒pADEasy-1在大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,将阳性重组体DNA转染至人胚肾细胞株HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中初步观察其对HBV复制的抑制疗效。结果构建了可同时表达GFP和siRNA的重组腺病毒,其可在HEK293细胞中进行包装、扩增,并在HepG2.2.15细胞中对HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的表达具有抑制作用。结论成功构建了可同时表达GFP和针对HBV的siRNA的重组腺病毒,并在体外实验中证实了其对HBV复制具有抑制作用。     

瞬时转染和稳定转染对RNAi抑制乙型肝炎病毒S基因表达的影响

目的:构建针对乙型肝炎病毒(HBV)S基因的siRNA表达载体Psuper-S1和Psuper-S2,观察瞬时转染及稳定转染对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.方法:设计并合成针对HBV S基因的siRNA寡核苷酸,经退火形成双链后克隆入Psuper载体,构建成功的siRNA表达载体分别瞬时转染和稳定转染表达HBV的2.2.15细胞,对所得细胞上清中的HBsAg和HBeAg进行定量检测,RT-PCR检测siRNA对靶基因Mrna的抑制效果,并比较两种转染方式对RNAi抑制HBV基因表达作用的影响.结果:在稳定转染并经潮霉素筛选所得的单克隆细胞株中,Psuper-S1和Psuper-S2均能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌(P<0.01),抑制率分别为83%和78%,RT-PCR结果证实HBV的Mrna明显降低,而瞬时转染细胞在蛋白质水平上及Mrna水平上的结果则比稳定转染的结果逊色.结论:针对HBV S基因的siRNA能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达,转染效率对于靶基因的RNA干涉作用有明显的影响.     

人抗肌萎缩蛋白Dp71 shRNA载体构建与检测

目的：构建有效针对人Dystrophin Dp71基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体，并验
证其干扰效果。方法：设计合成3对针对人Dystrophin Dp71基因的和1对无同源性的siRNA片段，在两端和中间加上酶
切位点和Loop环。将合成的DNA片段插入到干扰载体pRNAT-U6.1/Neo中，经过酶切和测序验证，成功构建人Dp71基
因的shRNA和空白对照载体。将各干扰载体和空白载体转染人正常胃黏膜上皮细胞(gastric epithelial cells，GES-1)和人
支气管上皮细胞(human bronchial epithelium，HBE)，Western印迹检测Dp71 shRNA真核表达载体的干扰效率。结果：酶
切和测序验证均表明各Dp71-shRNA载体构建成功。将空载体及各Dp71 shRNA载体分别转染GES-1和HBEC，和空白细
胞对照及shRNA空白载体组相比，3组Dp71-shRNA能够明显抑制Dp71蛋白表达，但是3组质粒的抑制效率有一定的差
异，以Dp71 shRNA2对Dp71表达的干扰效率最强。结论：成功构建了3个有效针对人Dystrophin Dp71基因的shRNA 干
扰载体，3组质粒都能有效地抑制Dp71在GES-1和HBEC中的表达，其中以Dp71-shRNA2的抑制效率最高。     

CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建CTGF特异性siRNA慢病毒表达载体并观察其介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)对人肝癌细胞CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响?方法:针对已经筛选确定的人CTGF基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与Plk0.1-GFP-SP6载体连接产生shRNA 慢病毒载体,经PCR筛选阳性克隆进行DNA测序鉴定?用脂质体转染法将质粒共转染293T 细胞,将包装产生的慢病毒颗粒感染HepG2细胞,Real-time PCR?Western-blot检测CTGF mRNA和蛋白的表达?结果:PCR与DNA测序证实合成的含CTGF shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确?经RNA干扰后的靶细胞CTGF mRNA以及蛋白表达水平明显降低?结论:成功构建人CTGF基因RNA干扰慢病毒载体,体外感染HepG2细胞可有效降低CTGF mRNA和蛋白的表达,为以CTGF基因为靶点的肝癌基因治疗研究奠定了基础?     

CD151基因RNAi慢病毒载体构建与稳转细胞株建立

目的构建人的CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立A549-CD151i稳定细胞株。方法根据人的CD151基因序列,设计三对RNAi序列,筛选出有效序列,利用此有效序列,合成相对应的Oligo DNA,退火后形成黏性末端的DNA双链,与双酶切后的pshRNA—Lentivector载体连接得到LV—CD151i慢病毒载体,转化TOP10感受态细胞,PCR筛选阳性克隆,并进行测序鉴定。用LV—CD151i和包装质粒共转染慢病毒包装用293T细胞,生产慢病毒并检测获得的病毒滴度。利用所获得的慢病毒感染A549细胞,筛选稳定转染细胞株。结果测序证实,成功构建CD151RNAi的慢病毒载体,并包装慢病毒,检测病毒悬液的滴度为5×10^8ifu,并利用此病毒悬液,成功感染A549细胞,筛选到稳定表达细胞株。结论成功构建人CD151基因RNAi慢病毒载体,并建立稳定的A549-CD151i细胞株。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

UbcH10基因沉默对肺癌NCI-H226细胞增殖及细胞周期的影响

目的：通过脂质体转染siRNA方法沉默人肺鳞癌细胞NCI-H226中UbcH10基因,观察基因沉默后细胞增殖活性的变化及其对细胞周期的影响。方法：设计3条针对UbcH10基因CDS区不同位点的siRNA序列并构建shRNA表达载体,脂质体法转染重组质粒至NCI-H226细胞。转染后48小时,RT-PCR,Western-blot检测细胞内UbcH10 mRNA及蛋白含量。使用有效siRNA序列（pshRNA2）转染细胞,转染后24、48小时CCK-8检测细胞活性。使用有效siRNA序列转染细胞,转染后48小时收集细胞,流式法检测细胞周期。结果：成功构建shRNA重组质粒并转染NCI-H226细胞。转染siRNA 48小时后,3组NCI-H226细胞中UbcH10基因的mRNA及蛋白含量均明显下降;其中2号siRNA序列的沉默效果最好,UbcH10基因剩余表达量为对照组的14%。使用有效序列转染NCI-H226细胞24、48小时,细胞增殖活性明显降低,与基因未干预组比较,差异显著（P＜0.05）。使用有效序列转染NCI-H226细胞48小时,细胞明显阻滞于G2期,与基因未干预组比较有显著差异（P＜0.05）。结论：UbcH10基因沉默,可显著抑制NCI-H226细胞增殖活性,并使肺癌细胞阻滞于细胞G2期。     

SMO特异性siRNA慢病毒载体的筛选构建

目的构建特异性沉默SMO基因的重组慢病毒载体,筛选对T293细胞SMO基因表达抑制效率最高的siRNA。方法根据SMO基因信息,设计了4个小干扰序列和1个阴性对照序列,利用慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP构建了5个重组质粒。用脂质体将重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blot检测沉默效率,从中筛选沉默效率高的质粒载体进行慢病毒颗粒大量包装。结果测序结果证明4个重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-721、pGCSIL-GFP-722、pGCSIL-GFP-723、pGCSIL-GFP-724的插入序列完全正确,重组慢病毒载体转染293T细胞后,Western blotting证实重组慢病毒质粒载体pGCSIL-GFP-723的干扰效率最高。包装获得Lv-SIL-SMO723慢病毒颗粒。结论成功筛选获得特异性抑制SMO的siRNA,成功构建了特异性沉默SMO基因慢病毒载体,其产生的慢病毒颗粒能高效特异地沉默SMO基因,为进一步应用奠定基础。     

siRNA抑制survivin的表达诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的研究

目的筛选能有效抑制survivin基因表达的小干扰RNA(siRNA),探讨survivin基因抑制对人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡的影响。方法设计3段survivin siRNA靶位点,用PCR扩增siRNA表达框,与survivin-绿色荧光蛋白融合基因表达质粒共转染293T细胞,再构建有效siRNA的表达载体,转染卵巢癌SKOV-3细胞,分析sur-vivin基因的表达及细胞凋亡情况。结果筛选出了1段能高效抑制survivin表达的siRNA,能显著下调SKOV-3细胞内的survivin表达,并导致SKOV-3细胞凋亡。结论利用RNA干扰能有效抑制survivin基因表达并诱导人卵巢癌SKOV-3细胞凋亡,为进一步的靶向survivin分子的体内抗肿瘤研究奠定了基础。