离体肝脏低温保存-再灌注期间肝细胞凋亡现象观察

目的 探讨临床肝移植过程中离体供肝低温保存－再灌注损伤与肝细胞凋亡的关系。方法 采用细胞凋亡原位末端标记法并结合电镜观察,检测低温保存时间分别为０、３、６、９小时的４组免肝脏在低温保存－再灌注过程中肝细胞凋亡发生情况。结果 在低温保存后的再灌注期间,４组动物的肝组织内均可见明显的肝实质细胞凋亡现象,而且低温保存时间越长的肝脏,其再灌注后产生的肝实质凋亡细胞数量越多,但各组肝脏于低温保存末,其组织内     

缺血后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨在体条件下缺血后处理对大鼠移植肝缺血再灌注损伤的保护作用及其可能机制。方法采用SD大鼠原位肝移植模型,供肝冷保存时间100min,无肝期控制于18min以内,60只雄性健康SD大鼠随机分为3组,对照组12只,缺血再灌注损伤组和后处理组各24只。对照组开腹后仅游离肝周韧带;缺血再灌注损伤组受体大鼠供肝切除前仅以肝素化生理盐水经门静脉灌注;后处理组供肝植入后完全再灌注前,给予多次短暂复灌复停作为缺血后处理。缺血再灌注损伤组、后处理组受体一半（6只）于再灌注后2h留取血液及肝组织,另一半（6只）于再灌注后6h留取肝组织。对照组于关腹后相应时间留取血液及肝组织。各组分别检测肝功能,采用酶联免疫吸附法测定血清肿瘤坏死因子Or．和中性粒细胞弹性蛋白酶。根据酶促反应原理,利用分光光度仪测定肝脏谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、髓过氧化物酶、超氧化物歧化酶。肝组织HE染色后光镜下观察组织学变化。结果缺血再灌注损伤组和后处理组血清肝功能指标、炎性细胞因子水平及肝组织过氧化物含量均高于对照组（P〈0．05）,而后处理组较缺血再灌注损伤组则明显低（P〈0．05）;缺血再灌注损伤组和后处理组肝组织抗氧化酶活力显著低于对照组（P〈0．05）,而后处理组较缺血再灌注损伤组则明显高（P〈0．05）。结论缺血后处理对大鼠移植肝的缺血再灌注损伤有明显的保护作用。提高组织的抗氧化能力和降低炎性细胞因子水平可能是缺血后处理保护作用的机制之一。     

大鼠热缺血肝脏移植前活力的无损伤性评定

目的研究不同程度热缺血的离体大鼠肝脏加氧低温灌流时ATP的再生能力,判断供肝活力.方法本实验采用18只SD大鼠,按不同热缺血时间随机分成三组A组,0min;B组,30min;C组,60min.每组6只.冷保存2～2.5h,采用31P-NMR测定加氧低温灌流下的离体肝脏频谱.结果灌流30min时A、B、C三组大鼠肝脏ATP(β-NTP/MDP比值,     

诱骗受体3对大鼠移植肝脏的保护作用

目的将重组诱骗受体3（decoy receptor 3，DcR3）腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）感染移植肝，探讨DcR3对移植肝的保护作用。方法实验动物分为同基因肝移植组（G1）、同种异体肝移植组（G2）、AAV空病毒感染的同种异体肝移植组（G3）、重组DcR3／AAV感染的同种异体肝移植组（G4）。常规建立同种异体大鼠肝移植模型；术中取预先制备的浓缩1×10^9IU病毒颗粒感染移植肝；术后观察大鼠的存活时间、肝功能，荧光显微镜及光镜下观察DcR3在肝脏中的表达及肝脏病理改变。结果G4组的平均生存时间比G2、G3组显著延长，G2、G3组的平均生存时间差异无统计学意义。G4组大鼠术后15、20d的肝功能、肝脏病理改变分别与G2、G3组大鼠术后7、10d相似。结论DcR3对大鼠移植肝有显著的保护作用。     

缺血预处理对大鼠小体积供肝的保护作用及机制

目的探讨缺血预处理（IPC）对大鼠小体积供肝的保护作用及其机制。方法120只SD大鼠随机分为3组（每组20对）：无热缺血组（NWI）、缺血再灌注组（WI）和缺血预处理组（IPC）。用双袖套法建立大鼠小体积肝移植模型。各组10只受体大鼠于术前1d、术后1、2、3、5d取血，用自动生化分析仪检测AST和ALT。NWI组于供肝灌注前及植入后0．5、1、2、3h，WI组于热缺血前及植入后0．5、1、2、3h，IPC组于IPC前、IPC后及植入后0．5、1、2、3h取肝组织，用硝酸还原法检测其NO浓度。结果IPC可降低大鼠小体积肝移植术后血清AST和ALT浓度，提高再灌注早期肝脏组织NO的浓度，降低再灌注晚期肝脏组织NO的浓度（P〈0．05）。结论NO在大鼠肝脏的缺血再灌注损伤中可能具有双重作用。IPC对大鼠小体积供肝的缺血再灌注损伤有保护作用。其机制可能是通过促进供肝再灌注后早期NO合成，改善肝脏微循环，同时抑制供肝再灌注后晚期NO合成，减轻过量NO的损伤作用，从而保护移植肝脏功能。     

缺血预处理对大鼠移植肝脏微循环的保护作用

目的：探讨早期再灌注损伤中缺血预处理（IP）对大鼠移植肝脏微循环的保护作用。方法：采用SD大鼠原位肝移植动物模型，供肝冷保存时间100min，无肝期25min。32只SD大鼠随机平均分成两组，每组16只。对照组：获取供肝前仅以肝素生理盐水经门静脉灌注；IP组；获取供肝前阻断肝门血供10min，再灌注10min，然后再以肝素生理盐水经门静脉灌注。移植肝脏再灌注2h后取血及肝脏检测。结果：IP组的肝脏抗氧化酶活力明显高于对照组（P＜0．01），血清丙氨酸转氨酶（ALT）、门冬氨酸转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）及肝组织中的过氧化产物丙二醛（MDA）含量均明显低于对照组（P＜0．001）；肝组织损伤以窦状内皮细胞为主，并且是以凋亡的方式发生死亡，IP组窦状内皮细胞损伤明显轻于对照组（P＜0．001）。结论：IP对大鼠移植肝脏微循环的早期再灌注损伤有保护作用。     

山莨菪碱对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的 探讨山莨菪碱对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。方法 将雄性Wistar大鼠制成肝脏缺血再灌注模型,随机分为正常对照组、缺血再灌注组、生理盐水组和山莨菪碱组,观察肝脏缺血60min再灌注1、3、6、12及24h后血浆和／或肝组织中内皮素－1（ET－1）、透明质酸（HA）、丙氨酸转氨酶（ALT）、丙二醛（MDA）和再灌注1h后肝细胞内游离Ca^2 ([Ca^2 ]i)、ATP含量变化以及肝组织病理学改变。结果 肝脏缺血再灌注后血浆和／或肝细胞中ET－1、HA、ALT、MDA和肝细胞内[Ca^2 ]u含量均显著升高,而肝组织中ATP含量明显降低;肝脏缺血再灌注前应用山莨菪碱2.0mg/kg者,血浆HA和肝细胞内[Ca^2 ]i含量明显降低,肝组织中MDA也有不同程度的降低,而肝组织中ATP含量明显升高,同时肝酶的漏出减少,肝组织病理学损害明显减轻。结论 山莨菪碱对肝脏缺血再灌注损伤具有保护作用。     

间充质干细胞移植对大鼠移植肝脏缺血再灌注损伤的影响

目的 研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植促进大鼠减体积肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤修复及再生的作用.方法 本研究①取同龄健康Wistar大鼠骨髓进行BMSCs体外培养,用第3代细胞制备悬液.②建立同龄健康Wistar大鼠50%减体积肝移植模型,分为实验组(BMSCs经门静脉植入)和对照组(生理盐水经门静脉注射)观察大鼠术后生存状态,术后不同时间留取血清和肝组织标本,采用免疫组化、流式细胞等方法进行检测.结果 成功体外分离培养BMSCs和建立50%减体积肝移植模型;大鼠肝移植术后2 h,自由活动和饮水.实验组丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)不同时间点与相应的对照组相比差异有统计学意义(均P＜0.05).实验组细胞周期:术后第2、3天时肝组织的G0/G1期细胞比例显著低于对照组(分别F=22.061,44.572,均P＜0.01).增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数增高,术后第2、3和7天时比较,差异有统计学意义(分别F=30.716,28.281,8.975,均P＜0.05).结论 移植肝局部植入BMSCs后,可以促进大鼠肝细胞增殖和加快减体积肝移植术后缺血再灌注损伤的修复.     

姜黄素对大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤的保护作用及其机制

目的探讨姜黄素预处理对大鼠肝脏冷缺血再灌注损伤(IRI)的保护作用及其机制。方法将40只Wistar大鼠随机分为:实验组(21只),于术前2 h将60 mg/kg的姜黄素溶于1mL DMSO中静脉注射;对照组(19只),于术前2h静脉注射1 mL DMSO。肝脏冷灌注时间为30 min,恢复血供复流6 h后处死动物,留取血液和肝脏标本,行血清ALT,AST,LDH和组织匀浆SOD,MDA,MPO测定,并进行组织病理和细胞凋亡检测。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肝组织匀浆中TNF-α及MIP-2的水平变化。结果实验组大鼠血清ALT,AST,LDH水平明显低于对照组(P0.01);实验组MDA,MPO,TNF-α和MIP-2水平较对照组明显降低(P0.05),SOD含量较对照组明显增高(P0.05)。并且实验组大鼠肝组织损伤程度和细胞凋亡程度明显轻于对照组。结论姜黄素预处理能减轻大鼠肝脏冷IRI,其保护机制可能与提高肝组织SOD含量,抑制脂质过氧化与细胞凋亡,下调炎性因子TNF-α和MIP-2的表达以及减少中性粒细胞浸润有关。     

白术多糖对缺血再灌注损伤大鼠肝脏的保护作用

目的：探讨白术多糖对大鼠肝脏缺血再灌注（I/R）损伤的保护作用。
方法：成年雄性SD大鼠随机分成3组：假手术组,I/R组,白术多糖预处理缺血再灌注组（PC组）,分别于成模后1,6,24 h 3个时段分别检测3组大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平;检测肝组织中ICAM-1 mRNA含量及IL-1的表达。
结果：PC组及I/R组ALT,AST水平以及ICAM-1 mRNA含量和IL-1表达均高于假手术组（P＜0.05）,但PC组上述4个指标均较I/R组显著降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：白术多糖可能通过降低ICAM-1的含量而减少炎症因子IL-1的生成,从而对肝脏I/R损伤起保护作用。     

持续低温氧合机械灌注对小鼠心脏死亡器官捐献供肝的保护作用

研究体外持续低温氧合机械灌注对小鼠心脏死亡器官捐献(donation after cardiac death,DCD)供肝的保护作用.方法 雄性ICR小鼠根据灌注保存方式不同分为新鲜供肝低温保存组(FC组)、DCD供肝低温保存组(DC组)和DCD供肝低温氧合机械灌注组(DP组),每组6只.低温灌注保存供肝6h后,收集保存过供肝的威斯康星大学保存液(University of Wisconsin solution,UW液),检测丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平.收集3组小鼠肝组织,切片,行常规苏木素-伊红(HE)染色,在光学显微镜下观察病理改变,用原位末端脱氧核苷酸转移酶标记法介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法观察3组小鼠肝细胞凋亡情况.结果 保存6h后,DC组与DP组的UW液中的ALT、AST含量均明显高于FC组(均为P< 0.01);DP组的ALT和AST含量均明显低于DC组(均为P< 0.01).光学显微镜下,FC组未见明显坏死区域,DC组肝细胞损伤严重,DP组肝组织未见明显损伤及坏死.荧光显微镜下,FC、DP两组肝细胞凋亡程度轻微,DC组肝细胞形态极不规则,肝细胞坏死严重.结论 持续低温氧合机械灌注可减轻肝细胞损伤和凋亡,为DCD肝移植的器官保存研究提供了新的方法.     

持续低温机械灌注保存移植肾的作用及其研究进展

公民逝世后器官捐献中不可避免的缺血-再灌注损伤（IRI）往往导致移植物功能延迟恢复（DGF）。利用LifePort对移植肾进行持续低温机械灌注（HMP）在一定程度上降低了DGF的发生率,但移植肾DGF仍然是临床面临的严重问题。肾移植科医师应在充分认识移植肾持续HMP作用的基础上,不断进行更深入的基础与应用研究,以期进一步降低移植肾DGF的发生率。本文主要就持续HMP保存移植肾的作用及其研究进展作一综述。     

Assessing warm ischemic injury of pig livers at hypothermic machine perfusion

Background

Livers originating from donation after circulatory death (DCD) donors are exposed to warm ischemia (WI) before liver transplantation (LTx). Currently, there are no objective tests to evaluate the damage sustained before LTx. This study aims to identify surrogate markers for liver injury that can be assessed during hypothermic machine perfusion (HMP) preservation. In addition, we want to use mathematical equation modeling combining these markers to improve our assessment of DCD livers for transplantation.

Materials and methods

Porcine livers were exposed to incremental periods of WI (0–120 min) and subsequently HMP preserved for 4 h. Biochemical and hemodynamic parameters were repeatedly measured in the perfusate during HMP. Subsequently, to mimic LTx, normothermic isolated-liver perfusion was applied for 2 h and the injury assessed using a morphological score.

Results

With increasing WI periods, the perfusate became more acidotic, and levels of aspartate aminotransferase (AST), liver fatty acid binding protein, redox-active iron, and arterial vascular resistance increased. A damage index, combining AST and pH (damage index = 2 − 37 × β_AST − 257 × β_pH) based on multifactorial analysis of the changing pattern of these markers, had increased sensitivity and specificity to reflect WI and reperfusion injury.

Conclusions

This proof of concept study demonstrated the potential role for objective evaluation of DCD porcine livers during HMP and the advantage to use multifactorial analysis on the markers' changing pattern.     

全肝血液转流及冷灌注下的离体肝切除术：动物实验和病例报告

通过１３头家猪的实验研究建立了离体肝脏切除及自体残肝再植术的技术方法，并发现离体肝切除术所至脏损害主要发生在残肝植入后的再灌流时相，而残肝能量状态的恢复与手术预后有关。在动物实验研究的基础上，采用全肝血液转流及冷灌注下的半离体肝切主成功地切除了１例侵犯主干静脉及肝后段腔静工伴有早期肝硬变的肝门区巨大肝癌。实验研究结果及初步临床经验表明，全肝血液转流及冷灌注下的离体肝切除术是切除常规手术方法难以切除     

两种不同肝脏灌注方法对大鼠肝脏保护作用的比较

目的探讨两种不同的肝脏灌注方法对冷保存的离体大鼠肝脏保护作用的差异,为后期离体大鼠肝脏保存实验提供简单而有效的方法。方法制备两种不同的单纯冷保存的离体大鼠肝脏灌注模型,分为实验组（经门静脉和腹主动脉灌注法,10只）;对照组（经门静脉、腹主动脉及肝动脉灌注法,10只）,灌注后取出肝脏置于4℃威斯康星大学保存液保存,12h后切取肝组织。行苏木素-伊红（HE）染色,观察肝组织病理损伤情况,并且用免疫组织化学染色法检测核因子（NF）-κB（SABC法）的表达情况。结果经12h冷保存后,两组大鼠肝脏组织病理示：肝脏小叶结构紊乱,肝细胞变性、肿胀及空泡形成,肝血窦和中央静脉有不同程度的淤血,部分肝窦内皮细胞坏死并脱落,但两组之间无明显差别。两组之间NF-κB阳性表达率差异无统计学意义（P〉0．05）。结论经门静脉和腹主动脉灌注法与经门静脉、腹主动脉及肝动脉灌注法,对离体大鼠肝脏的保护作用无差异,但前者操作相对简单,更容易在今后研究大鼠离体肝脏的实验中应用。     

肝脏低温保存肝血窦变化的实验观察

目的：探讨低温保存肝血窦超微结构的变化及其在肝微循环障碍中的作用，方法：将63只大鼠肝脏分别在低温UW液中保存0（对照组）、2、8、16、24、32和48h，然后对肝血窦进行电镜观察，结果：肝血窦内皮细胞在保存2、8h后，筛板小孔扩大，融合成许多大洞隙，16、24h细胞胞明显回缩，呈树根状，32，48h似索网状，部分内皮细胞突起，脱落，肝细胞微绒毛在保存8h后出现肿胀并形成膜浆泡从扩大的内皮小孔突入血窦；随着保存时间延长，膜浆泡增多，变大并脱落或破裂，结论：肝血窦内皮细胞的低温保存损伤和膨入血窦内的膜浆泡可引起肝微循环紊乱，导致肝血流和肝功能障碍。     

Hypothermic in situ perfusion of the porcine liver using Celsior or Ringer-lactate solution

Background  Hypothermic perfusion (HP) of the liver is applied during total vascular exclusion (TVE) to reduce ischemic injury during liver resection. No studies have been performed comparing different perfusion solutions for HP. The aim of this experimental study was to compare Ringer-lactate solution (RL) with Celsior solution (Cs) for HP in a pig model of 60-min TVE. Method  Twenty pigs underwent 60-min TVE of the liver. Groups were TVE without HP (no-HP, n = 9), TVE with HP using RL (n = 6), and TVE with HP using Cs (n = 5). Blood and liver tissue samples were taken before TVE and during 24-h reperfusion. Results  In the no-HP group, plasma aspartate aminotransferase values were significantly increased during reperfusion (p < 0.05), while liver tissue pO₂ levels (p < 0.01) were decreased when compared to the HP groups. After 24-h reperfusion, bile production and liver tissue glutathione content were significantly higher (p < 0.05) in the Cs group (42.0 ± 1.7 mL/h and 44.9 ± 2.2 nmol/mg, respectively) as compared to the RL group (31.5 ± 3.5 mL/h and 19.6 ± 1.8 nmol/mg, respectively). Conclusion  The protective effect of HP during TVE was confirmed in this study. HP with Cs was more effective in reducing ischemic injury as compared to HP with RL.     

乌司他丁对大鼠原位肝脏移植供肝的保护作用

目的：探讨乌司他丁对大鼠原位肝脏移植供肝的保护作用及机制。 方法：分别用单纯UW液（模型组）或含乌司他丁（乌司他丁组）、HO-1诱导剂CoPP（CoPP组）、HO-1抑制剂ZnPP（ZnPP组）的UW液灌注切取的供体大鼠肝脏并保留灌注液1 h后,原位移植受体大鼠。移植后24 h取移植肝脏与受体大鼠血标本,行肝脏病理学检查及评分;分别用real-time PCR和Western bolt法检测肝组织HO-1 mRNA与蛋白的表达;用Elisa法检测大鼠血清中IL-2和IL-10的含量。 结果：与模型组比较,乌司他丁组与CoPP组供肝的损伤明显减轻、Suzuki评分降低,而ZnPP组损伤加重、Suzuki评分升高（均P<0.05）;乌司他丁组与CoPP组HO-1 mRNA与蛋白的表达明显上调,而ZnPP组明显下调（均P<0.05）;乌司他丁组与CoPP组大鼠血清中IL-2水平明显降低、IL-10水平明显升高,而ZnPP组IL-2水平明显升高、IL-10水平明显降低（均P<0.05）。 结论：乌司他丁可能通过上调移植大鼠肝脏的HO-1水平,减轻再灌注损伤、抑制排斥反应而发挥保护作用。

     

大鼠卵巢体外低温机械灌注模型的建立

目的建立大鼠卵巢体外低温机械灌注(HMP)模型,并验证其有效性。 方法26只雌性8～10周龄SD大鼠,供体组、受体组、正常对照组和卵巢摘除组各6只,另有2只大鼠HMP结束后留取卵巢标本以备检测。供体组和取材大鼠获取卵巢和肾脏后置于0～4 ℃林格氏液中保存2 h,再行HMP 2 h。供体组大鼠卵巢组织HMP结束后移植至受体组大鼠左肾包膜下,移植7 d后检测血清抗苗勒管激素(AMH)水平,同时获取移植卵巢进行组织病理检查以及Ki67和CD31免疫组织化学染色。采用单因素方差分析比较正常对照组、卵巢摘除组和受体组大鼠血清AMH水平,采用t检验比较正常对照组和受体组卵泡计数以及Ki67和CD31阳性细胞面积百分比。P<0.05为差异有统计学意义。 结果HMP后的卵巢组织血管未见明显扩张,受体组大鼠移植7 d后的卵巢组织卵泡结构完整,成熟卵泡数为(7.0±0.6)个,低于正常对照组(26.3±3.4)个,差异有统计学意义(t＝5.633,P<0.05)。受体组血清AMH为(4.63±0.87)ng/mL,高于卵巢摘除组(2.55±0.16)ng/mL,低于正常对照组(7.39±1.04)ng/mL,但差异均无统计学意义(P均>0.05)。移植7 d后受体组大鼠卵巢组织Ki67和CD31阳性细胞面积百分比分别为(29.0±2.4)%和(12.3±1.0)%,正常对照组分别为(21.9±3.8)%和(12.6±1.2)%,差异均无统计学意义(t＝1.634和0.178,P均>0.05)。 结论本研究构建的大鼠卵巢体外HMP模型,方法简单,可短时间维持卵巢的正常功能,为卵巢器官保存提供了一个新的方式。     

Determination of an adequate perfusion pressure for continuous dual vessel hypothermic machine perfusion of the rat liver

Hypothermic machine perfusion (HMP) provides better protection against ischemic damage of the kidney compared to cold-storage. The required perfusion pressures needed for optimal HMP of the liver are, however, unknown. Rat livers were preserved in University of Wisconsin organ preservation solution enriched with acridine orange (AO) to stain viable cells and propidium iodide (PI) to detect dead cells. Perfusion pressures of 12.5%, 25% or 50% of physiologic perfusion pressures were compared. Intravital fluorescence microscopy was used to assess liver perfusion by measuring the percentage of AO staining. After 1-h, the perfusion pressure of 12.5% revealed 72% +/- 3% perfusion of mainly the acinary zones one and two. The perfusion pressure of 25% and 50% showed complete perfusion. Furthermore, 12.5% showed 14.7 +/- 3.6, 25% showed 3.7 +/- 0.9, and 50% showed 11.2 +/- 1.4 PI positive cells. One hour was followed by another series of experiments comprising 24-h preservation. In comparison with 24-h cold-storage, HMP at 25% showed less PI positive cells and HMP at 50% showed more PI positive cells. In summary, perfusion at 25% showed complete perfusion, demonstrated by AO staining, with minimal cellular injury, shown with PI. This study indicates that fine-tuning of the perfusion pressure is crucial to balance (in)complete perfusion and endothelial injury.