冷冻治疗对C6大鼠脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨大鼠C6脑胶质瘤模型冷冻治疗后细胞凋亡水平和增殖活性的变化。方法借助于立体定位技术,建立大鼠C6皮层脑胶质瘤动物模型,待肿瘤生长至第15天、直径约6mm时,进行冷冻治疗。治疗后15d行细胞凋亡的末端标记法(TUNEL)和流式细胞仪(FCM)检测,以增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学及MRI检查了解肿瘤的增殖活性,测量肿瘤体积和抑瘤率。结果冷冻治疗后凋亡细胞密度及凋亡指数较对照组显著提高[前者分别为(36.73±9.54)/0.0625mm2和(4.87±2.80)/0.0625mm2;后者分别为(16.02±3.87)%和(1.70±1.74)%](P<0.01)。冷冻组肿瘤内PCNA阳性细胞数量较对照组显著下降[分别为(42.37±7.63)%和(73.93±9.60)%](P<0.01);肿瘤体积明显缩小[分别为(139.60±27.28)mm3和(414.40±69.01)mm3](P<0.01),增殖受抑制,抑瘤率为66.31%。结论大鼠C6脑胶质瘤冷冻治疗后除细胞坏死外,肿瘤细胞增殖水平下降和细胞凋亡增多也是冷冻治疗胶质瘤的机理之一。     

X-刀治疗大鼠C6脑胶质瘤诱发的细胞凋亡

目的：观察X-刀治疗胶质瘤的作用，并探讨诱发细胞凋亡效应。方法：采用DNA琼脂糖凝胶电泳、超微结构观察及新兴的DNA片段末端标记方法对各组C6大鼠脑胶质瘤发生的细胞凋亡进行研究。结果：15、20及30Gy各组在治疗后24h内均出现明显的细胞凋亡，DNA末端标记法检测的结果不但与前述方法结果相符，还显示出其准确性高等特性。研究中还发现各治疗组均有坏死同时出现。结论：X-刀治疗后诱发细胞凋亡的同时还致细胞坏死，这种效应随剂量增加渐趋明显，构成SRS治疗胶质瘤发挥作用的两个方面。     

冷冻治疗大鼠C6脑胶质瘤的实验研究

目的研究冷冻治疗对大鼠C6脑胶质瘤的增殖抑制作用及其机制。方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型，60只载瘤大鼠随机均分为对照组和治疗组。治疗组实施冷冻治疗后免疫组化检测P27Kipl蛋白的表达，磁共振检测肿瘤体积变化，并观察动物生存期。对照组未实施冷冻治疗。结果与对照组比较，冷冻治疗可上调P27Kip1蛋白的表达，对照组为（4.81±0.72）％，治疗组为（28.84±3.56）％，P〈0.05；缩小肿瘤体积，对照组为（292.97±19.13）mm^3，治疗组为（76.37±10.22）mm^3，P〈0.05；延长动物生存期，对照组为（37.00±1.55）d。治疗组为（57.00±3.16）d，P〈0.05。P27Kip1蛋白阳性表达率和荷瘤鼠生存期呈正相关（r=0.836，P〈0.05）；同体积呈负相关（r=-0.696，P〈0.05）。结论冷冻治疗可抑制大鼠C6脑胶质瘤的增殖，延长动物生存期，其机制同上调P27Kip1蛋白的表达有关。     

脑胶质瘤与细胞凋亡

细胞凋亡是细胞主动的程序性死亡,并与细胞增生、分化共同维持正常组织的内稳态。近年来发现细胞凋亡与肿瘤发生密切相关。细胞凋亡已成为肿瘤治疗的新模型。本文综述了以细胞凋亡为模型靶,应用化疗、放疗、免疫治疗、基因治疗等诱导脑胶质瘤细胞凋亡的研究进展。     

G422胶质瘤冷冻后细胞凋亡及相关基因表达的研究

目的：探讨冷冻杀伤肿瘤细胞的分子机制。方法；建立小鼠脑胶质瘤动物模型；用末端标记法（TUNEL）原位检测细胞凋亡，DNA琼脂糖电泳观察DNA梯形条带；用免疫组织化学ABC法检查bcl-2和bax表达。结果：不同冻融周期作用于G422胶质瘤后，在不同时间点、冷冻灶周边区的肿瘤细胞出现了形态学和DNA水平上的细胞凋亡变化，其峰值出现在冷冻后24-48h。重复冻融出现更多的凋亡细胞。不同冻融周期均引起冷冻灶周边区细胞bax上调，但对抑凋亡基因bcl-2表达无明显影响。结论：冷冻治疗可以诱导G422胶质瘤细胞凋亡，冷冻诱导的细胞凋亡由bax基因参与介导，而与bcl-2表达无关。诱导细胞凋亡可能 是冷冻杀伤肿瘤细胞的重要机制。     

FLIP蛋白抑制顺铂诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的探讨自杀相关因子（Fas）相关死亡结构域样白介素1（IL-1）β转化酶抑制蛋白（FLIP）对于顺铂（CDDP）诱导大鼠脑胶质瘤细胞（C6细胞株）凋亡的抑制作用,为进一步研究胶质瘤的耐药性奠定分子生物学基础。方法利用由Ad—Max腺病毒包装系统成功构建的携载大鼠FLIP基因的腺病毒表达载体Ad—FLIP感染大鼠C6胶质瘤细胞,24h后经逆转录酶一多聚酶链反应（RT—PCR）及Westernblot检测感染组及对照组细胞中FLIP基因的mRNA及蛋白表达水平;分别给予Ad—FLIP感染组及对照组细胞不同浓度的CDDP（0,1,2,4,8mg／ml）,药物处理48h后,经流式细胞仪（FCM）分析细胞凋亡状况;四唑蓝显色法（MTF）测定并比较两组细胞活力。结果Ad—FLIP感染组细胞与对照组细胞相比,FLIPmRNA和蛋白表达水平明显增高;流式细胞仪检测结果显示Ad—FLIP感染组细胞凋亡率明显低于对照组。MTT法结果提示经CDDP处理后,Ad—FLIP感染组与对照组细胞活力均有下降,但FLIP蛋白具有明显的抑制作用。结论FLIP蛋白在大鼠c6胶质瘤细胞中具有抵抗化疗药物的作用。     

大鼠脑内C6胶质瘤模型的建立

目的建立稳定可靠的大鼠脑内C6胶质瘤模型。方法取20只健康成年SD大鼠,用立体定向技术将含1×106个C6胶质瘤细胞的悬液15μl缓慢接种于大鼠左侧尾状核区;接种后3周时随机挑选其中10只大鼠麻醉后行MRI检查,观察肿瘤影像学表现,随后处死大鼠取出肿瘤组织,行免疫组化及HE染色检测肿瘤生长情况;另外9只(麻醉死亡1只)大鼠继续饲养直至死亡,观察其生存时间。结果1只接种肿瘤细胞后出现短暂体重下降,但未出现明显神经系统体征,饲养60 d后尸检未见肿瘤生长;其余18只大鼠颅内均有肿瘤生长且无颅外转移现象,病理学检查结果显示脑内肿瘤呈浸润生长,可见新生血管,胶质纤维酸性蛋白表达阳性。荷瘤鼠生存时间为25~47 d,平均(32.78±2.34)d。结论采用立体定向方法向大鼠尾状核区种植C6细胞可获得较为稳定、可靠的胶质瘤动物模型,能够满足胶质瘤动物实验研究的需要。     

Celecoxib诱导C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的探讨Celecoxib(塞来昔布)诱导C6胶质瘤细胞凋亡的作用。方法应用吖啶橙、透射电镜和流式细胞仪(FCM)检测方法。结果通过吖啶橙及电镜检查发现Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡明显多于12．5μmol／L组，FCM检测Celecoxib 50μmol／L组细胞凋亡为15．32％，12．5μmol／L组凋亡为5．83％，不同浓度的Celecoxib对C6胶质瘤细胞有增殖抑制及诱导凋亡的作用，凋亡随药物浓度增加而升高。结论Celecoxib对C6胶质瘤细胞呈剂量依赖性抑制及诱导凋亡的作用．对胶质瘤治疗有重要意义。     

冷冻联合全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤增殖的实验研究

目的探讨冷冻联合全反式维甲酸（ATRA）抑制大鼠c6脑胶质瘤细胞的增殖及其机制。方法在120只Wistar大鼠建立c6脑胶质瘤模型,并随机将其平均分为冷冻治疗、ATRA治疗、冷冻联合ATRA治疗及对照组。接种c6细胞第22天MRI检测10只动物的胶质瘤体积的变化,每组并处死10只动物取肿瘤组织,采用免疫组化法检测p27kipl蛋白的表达;观察余下10只荷瘤鼠的生存期。结果各治疗组较对照组肿瘤体积明显缩小（P〈O．05）,大鼠生存期明显延长,p27kipl蛋白的表达水平明显增多,以联合治疗组最为显著（P〈0．05）;p27kipl蛋白的表达与肿瘤体积呈明显负相关（P〈0．05）,与大鼠生存期呈明显正相关（P〈O．05）。结论与单一治疗相比,冷冻联合ATRA治疗能显著抑制大鼠c6胶质瘤细胞增殖,其机制可能与其表达p27kipl蛋白的上调有关。     

HtrA2在大鼠脑胶质瘤细胞中的表达

目的探讨大鼠胶质瘤中HtrA2的表达及意义。方法采用免疫组化方法检测大鼠胶质瘤及正常脑组织中HtrA2的表达。结果 HtrA2蛋白在正常大鼠脑胶质细胞和大鼠脑胶质瘤细胞化学染色均有阳性表达,DAB棕黄色颗粒着色在胞浆中,实验组20例,18例阳性表达,正常对照组20例,1例阳性表达,在脑胶质瘤细胞中表达高于正常脑胶质细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HtrA2在大鼠在脑胶质瘤细胞中表达高于正常脑胶质细胞。     

大鼠C6脑胶质瘤模型的建立

目的通过不同方法建立大鼠脑胶质瘤模型,观察其生长特性,比较各种方法的优劣。方法体外培养大鼠C6胶质瘤细胞,分别取浓度为1.0×105个/10μl、1.0×106个/10μl、1.0×107个/10μl细胞悬液,立体定向接种于Wistar大鼠脑右侧尾状核区,观察不同接种量实验鼠的生存状态、成瘤情况及脏器转移灶,并采用免疫组织化学方法检测其胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果各种接种量的实验组成瘤率均为100%,未见颅外转移病灶,在组织病理学上接近人脑胶质瘤,瘤细胞病理性核分裂像多见,GFAP蛋白呈散在阳性表达,VEGF蛋白呈强阳性表达,瘤组织内有出血和坏死以及丰富的微血管。实验周期短,重复性高。结论C6细胞接种Wistar大鼠脑胶质瘤动物模型,肿瘤成瘤率高,颅内生长稳定,肿瘤组织病理学特性与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。实验范围内部分时段不同接种剂量肿瘤生长速度有显著性差异,可根据病因学、实验治疗或药效学等不同研究需要选择不同接种量。     

p16基因抑制脑胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡

目的：探索p16基因在脑胶质瘤发生过程中的作用及其与脑胶质瘤细胞凋亡的关系。方法：采用脂质体,磷酸钙＋DMSO休克转染的方法,分别将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251,SWO,观察p16基因短暂转染与长期稳定转染对胶质瘤细胞的作用,并筛选阳性克隆。同时以空载体质粒pCDNA3为对照,免疫组化,Northern杂交检测p16基因表达,对转染后细胞生长的抑制,细胞周期,凋亡及裸鼠致瘤能力的变化进行分析,结果：外源p16基因的高水平表达显著抑制了胶质瘤U251,SWO细胞的生长,克隆形成率减少,肿瘤细胞发生了G1期阻滞,p16基因短暂转染可诱导胶质瘤细胞凋亡,而长期稳定转染无明显的凋亡诱导作用。结论：外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖并诱导细胞凋亡,肿瘤细胞的异质性特点与p16基因转染后的“自然选择”作用可能是p16基因长期稳定转染无明显凋亡诱导作用的主要机制。     

p38MAPK基因对胶质瘤细胞C6生长周期的影响

目的 研究p38MAPK基因对大鼠胶质瘤细胞C6生长周期的影响。方法 利用脂质体将p38MAPK基因导入C6细胞中，用免疫细胞化学染色检测其在转染前后的表达，用HE染色、流式细胞仪、TUNEL等研究其对细胞形态、粘着状况和生长周期的影响。结果 pCMV5-p38MAPK组P38MAPK蛋白表达阳性，细胞形态发生变化，贴壁性降低，G1期百分比增加，而S期和G2期百分比减低，并出现凋亡峰。结论 p38MAPK基因可影响C6细胞的生长周期，并诱导C6细胞凋亡。     

全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨全反式维甲酸对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型，腹腔注射全反式维甲酸后．MRI检测胶质瘤的体积变化、流式细胞仪检测细胞增殖时相变化及免疫组化检测p27Kip1蛋白的变化。结果治疗组较对照组肿瘤体积明显减小（P〈0．05）；G1期细胞比例明显增加（P〈0．05），S期细胞比例明显减少（P〈0．05）；p27Kip1蛋白的表达明显增加（P〈0．05）。结论全反式维甲酸通过上调p27Kip1蛋白的表达而抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖。     

局部热化疗诱导鼠C6胶质瘤细胞凋亡的研究

目的研究局部热化疗对大鼠胶质瘤细胞凋亡的作用,探讨其作为胶质瘤辅助治疗的可行性。方法将传代培养的C6细胞接种于大鼠背部皮下熏肿瘤生长至1.5～2cm直径时,分组进行局部热疗、化疗和热化疗。继续观察皮下肿瘤生长情况,测量瘤体体积和重量;用免疫组化s-p法检测bax、bcl-2蛋白表达;用HE染色法、电镜、TUNEL法观察细胞凋亡;电镜观察肿瘤血管的变化。结果肿瘤接种32d后,热疗、化疗及热化疗组肿瘤的重量分别为(1.95±0.34)g,(1.86±0.40)g,(1.09±0.21)g,明显较对照组(2.95±0.36)g轻(P<0.001);各治疗组肿瘤体积也明显小于对照组;各治疗组bax蛋白表达亦明显强于对照组(P<0.001),且热化疗组也强于单纯热疗和化疗组(P<0.001);bcl-2蛋白表达改变不明显(P>0.05);热疗、化疗及热化疗组细胞凋亡指数分别为18.96±2.54、20.05±3.64、36.62±8.96,明显大于对照组的4.68±1.68(P<0.001)。各治疗组肿瘤微血管外径变小,血管壁变厚,血管减少,血管内皮细胞紧密连接增多,细胞连接间隙减小,有的血管甚至只能发现完整的基膜而缺乏内皮细胞。结论①热疗、化疗能抑制肿瘤增殖,且阿霉素与热疗联合使用有协同作用。②热疗、化疗、热化疗能促进bax蛋白表达,使bcl-2/bax比值减小,诱导细胞凋亡。③热疗可直接损伤细胞和周围血管,     

大鼠脑胶质瘤模型建立与生长评估

目的建立SD大鼠脑胶质瘤动物模型,比较其生长评估方法。方法采用立体定向技术,将体外培养的大鼠C6胶质瘤细胞浓缩悬置,调制为浓度5×1011/L的无血清RPMI1640培养液,将20μl悬液接种于SD大鼠右侧尾状核区。接种后分时段观察与评估实验鼠的神经功能缺损、肿瘤的生长特性、MRI检查结果,并做组织病理学和胶质纤维酸性蛋白及S-100蛋白免疫组化检查。结果立体定向技术接种的大鼠脑胶质瘤动物模型具有颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移,实验周期短,可重复性好,组织学上接近人脑胶质瘤等特征。神经功能评分与荷瘤鼠的脑胶质瘤大小及生长进程具有相关性。结论建立的SD大鼠的C6脑尾状核胶质瘤模型,其肿瘤影像及病理特征与人脑胶质瘤相似,神经功能评分可作为其生长的间接评估方法。     

p16基因对脑胶质瘤细胞生长及放射敏感性的影响

目的探索p16基因在脑胶质瘤发生发展过程中的作用及p16基因与肿瘤细胞放射敏感性间的关系.方法将外源野生型p16基因导入胶质瘤细胞株U251、C6,筛选阳性克隆.同时以空载体质粒为对照,免疫组化检测p16基因表达,用MTT法测定细胞生长曲线及肿瘤杀伤率.结果转染p16基因的U251、C6细胞有外源p16基因的整合及表达,克隆形成率减少,生长速度明显减慢,对辐射的敏感性增强.结论导入外源野生型p16基因可抑制胶质瘤细胞恶性增殖,提高胶质瘤细胞对辐射的敏感性.     

p38MAK基因诱导胶质瘤细胞凋亡机制的初步研究

目的 初步探讨p38MAPK基因诱导大鼠胶质瘤细胞C6发生凋亡的机制。方法 利用脂质体介导法将p38MAPK基因导入C6细胞中,用夹心法ELISA检测细胞培养液中sTNF-α水平的变化,用流式细胞仪检测膜TNF-α和膜TNFRI水平的变化。结果 转染pCMV5-p38MAPK后,细胞培养液中sTNF-α水平明显升高,膜TNF-α水平无明显变化,膜TNFRI表达升高。结论 p38MAPK可能通过上调sTNF-α和膜TNFRI水平而诱导C6细胞凋亡。     

大鼠全脑缺血再灌流后脑组织P53及P21蛋白的表达

目的　探讨大鼠全脑缺血再灌流后Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达及其与迟发性神经元死亡（ＤＮＤ）的关系。方法　在４ 血管闭塞法全脑缺血模型上,采用ＨＥ及ＬＳＡＢ染色法,观察脑组织病理改变,检测脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达,以及蛋白合成抑制剂放线菌酮对其的影响。结果　全脑缺血１５ ｍ ｉｎ 再灌流后,脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达增加,且两者分布接近。海马结构、丘脑、下丘脑等白质区（再灌流后６ ｈ）较皮层、海马的神经细胞核（２４ ｈ）先检测到Ｐ５３、Ｐ２１蛋白,７２ ｈ 表达达高峰。并且以缺血损伤最严重的海马ＣＡ１ 区Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达为强。另外,放线菌酮可抑制脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白的表达,并对ＤＮＤ具有一定的保护作用。结论　全脑缺血再灌流损伤后,脑组织Ｐ５３、Ｐ２１蛋白表达增加,放线菌酮可抑制其表达,并对ＤＮＤ起保护作用,提示Ｐ５３、Ｐ２１蛋白参与了全脑缺血后ＤＮＤ的凋亡机制,并对其起促进作用