慢性神经痛大鼠鞘内联合应用吗啡和氯胺酮在脊髓上水平的抗伤害性作用及对吗啡耐受的影响

目的研究鞘内联合应用吗啡和氯胺酮对慢性神经痛大鼠的抗伤害作用机制及对吗啡耐受的影响。方法 40只Wistar大鼠,体质量220～260 g,制备坐骨神经结扎模型并进行鞘内置管,随机分为5组(n=8):B组为空白对照组;C组鞘内注射0.9%盐水10μL;K组鞘内注射氯胺酮50μg;M组鞘内注射吗啡20μg;KM组鞘内注射吗啡10μg和氯胺酮25μg。坐骨神经结扎术后第4天开始鞘内给药,每日1次,连续7 d。用药7d后处死大鼠,取大脑皮质、海马、脑干组织,硝酸还原酶法测定NO浓度和NOS活性。结果与B组比较,C和K组脑干NO浓度升高,M组皮质、海马、脑干中NO浓度均升高;与C组比较,M组皮质、海马NO浓度升高,KM组海马、脑干中NO浓度降低;与M组比较,KM组皮质、海马、脑干NO浓度均降低(P<0.05或0.01)。与B组比较,C、K和M组皮质、海马、脑干中NOS活性均升高;与C和M组比较,KM组皮质、海马、脑干中NOS活性均降低(P<0.05或0.01)。结论神经病理性痛大鼠鞘内联合应用吗啡和氯胺酮可在脊髓上水平产生抗伤害性作用,并可抑制吗啡耐受的形成,这可能与大脑皮质、海马、脑干的NO水平和NOS活性有关。     

自噬在雷帕霉素逆转脊髓吗啡耐受形成机制研究

目的研究鞘内注射雷帕霉素对大鼠吗啡耐受形成的作用。方法选择鞘内置管成功的成年雄性SD大鼠32只,随机分为M组、C组、MR组和R组(n=8),M组2次/d,连续7 d鞘内注射吗啡20μg;C组2次/d,连续7 d鞘内注射生理盐水;M R组2次/d,连续7 d鞘内注射吗啡20μg,并于第3天第2次注射吗啡同时鞘内注射雷帕霉素2.3μg,连续3 d;R组2次/d,连续7 d鞘内注射生理盐水,并于第3天第2次注射生理盐水前鞘内注射雷帕霉素2.3μg,连续3 d。于鞘内注射前及第1、3、5、7天,第2次鞘内注药后30 min,采用电子Von Frey测痛仪测定机械缩足反射阈值(M WT),最后一次M WT测定结束后,随机取4只大鼠L4~6脊髓背角,采用Western blot测定自噬标记蛋白LC3Ⅱ(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ)及自噬调节信号相关蛋白Beclin-1的表达。结果与M组比较,MR组鞘内注射第3、5、7天后,MWT均升高(P<0.05),虽然MR组MWT有降低趋势,但在第7天M WT仅比第1天下降43%,表明第3天后雷帕霉素与吗啡合用能部分逆转吗啡耐受的形成。Western blot结果:与C组比较,M组、R组和MR组第7天脊髓背角Beclin-1、LC3Ⅱ与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均上调(P<0.05)。与M组比较,R组和MR组第7天脊髓背角Beclin-1、LC3Ⅱ与LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达显著上调(P<0.01)。免疫组织化学结果:与M组比较,第7天MR组脊髓背角Beclin-1表达平均光密度值明显升高(P<0.01)。结论吗啡耐受开始形成时合用雷帕霉素可以部分逆转脊髓吗啡耐受的形成。     

鞘内注射硫酸镁和吗啡对切口痛大鼠脊髓背角p-αCaMK Ⅱ表达的影响

目的观察鞘内注射(it)硫酸镁(MgSO4)和吗啡对切口痛大鼠脊髓背角磷酸化钙—钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(p-αCaMKⅡ)表达的影响。方法所有大鼠术前8d鞘内置管,用机械缩足反射阈值、热缩足潜伏期和累计疼痛评分来评价大鼠疼痛行为学变化;用免疫组织化学和Western blot法来测定吗啡和硫酸镁对大鼠脊髓背角p-αCaMKⅡ表达的影响。结果术前或术后30minit吗啡5μg或MgSO4188μg和吗啡2.5μg使术后2h的机械性缩爪阈值(MWT)和热刺激缩爪阈值(TWL)明显延长(P<0.01),累积疼痛评分明显降低(P<0.01);术前30minitMgSO4375μg或吗啡5μg或MgSO4188μg和吗啡2.5μg使大鼠术后2h脊髓背角p-αCaMKⅡ表达明显减少(P<0.05)。结论在大鼠切口痛模型中,it吗啡5μg或MgSO4188μg和吗啡2.5μg具有确切的抗伤害作用,其抗伤害作用可能与抑制脊髓背角p-αCaMKⅡ表达有关。     

慢性关节炎吗啡耐受大鼠脊髓兴奋性氨基酸转运体的变化

目的:以慢性关节炎大鼠模型为基础,通过鞘内给与吗啡时间的不同,观察脊髓背角兴奋性氨基酸转运体(EAAT)水平变化,以阐述阿片耐受的机制。方法:30只SD大鼠随机分为5组(n=6)。盐水组(S组)鞘内注入20ul生理盐水1d;吗啡1d组(M1组),鞘内注入20ug吗啡1d;吗啡3d组(M3组),鞘内注入20ug吗啡3d;吗啡5d组(M5组),鞘内注入20ug吗啡35;吗啡7d组(M7组),鞘内注入20ug吗啡7d。各组于注药后完毕后观察大鼠的行为学并取脊髓腰4-5节段,应用免疫组化法和计算机图象分析技术观察大鼠脊髓背角兴奋性氨基酸转运体。结果:随着吗啡应用时间的延长,大鼠脊髓背角兴奋性氨基酸转运体表达逐渐下降(P<0.05);缩脚潜伏期减少(P<0.05)。结论:形成关节炎吗啡耐受的大鼠脊髓背角兴奋性氨基酸转运体表达变化随着吗啡应用时间增加而减少。     

脊髓星型胶质细胞的JNK介导吗啡耐受

目的观察脊髓JNK在大鼠吗啡镇痛耐受过程中的作用。方法对SD大鼠连续7d鞘内注射吗啡(15μg)建立吗啡耐受的动物模型。采用50℃热水甩尾法观察吗啡的镇痛效果;应用免疫组织化学方法检测吗啡耐受过程中脊髓背角磷酸化JNK(pJNK)的表达情况。结果在慢性鞘内注射吗啡的过程中,大鼠脊髓背角pJNK的表达随着吗啡耐受程度的增加而逐步增加,且pJNK主要存在于脊髓星型胶质细胞。吗啡注射前15min鞘内给予JNK特异性抑制剂SP600125(25μg),不仅可以明显抑制吗啡镇痛耐受还可以部分抑制已形成的吗啡耐受。结论脊髓星型胶质细胞JNK的激活可能是吗啡耐受形成和维持的重要机制之一。     

鞘内注射P物质拮抗氯胺酮的抗伤害作用

目的观察脊髓P物质对氯胺酮抗伤害作用的影响。方法在小鼠福尔马林实验中,结合行为学和Fos蛋白表达,观察鞘内注射(it)不同剂量的P物质对氯胺酮抗伤害作用的影响。结果氯胺酮20、30mg·kg-1ip可剂量依赖性地减少小鼠舔足时间(P<0.05)。P物质0.25、0.5ngit可增加注射氯胺酮小鼠舔足时间(P<0.05)。小鼠注射福尔马林后,注射侧脊髓背角Fos免疫样(Foslikeimmunoreactive,FLI)阳性神经元数量明显增加(P<0.01),预先给于氯胺酮30mg.kg-1ip可以明显减少脊髓背角FLI阳性神经元数量(P<0.01),而P物质0.5ngit能明显削弱氯胺酮对脊髓背角Fos表达的抑制(P<0.01)。结论鞘内注射P物质能拮抗脊髓水平氯胺酮抗伤害作用。     

鞘内注射左旋布比卡因下调甲醛炎性痛大鼠远位触液神经元P物质的表达

目的观察鞘内注射左旋布比卡因对甲醛炎性痛大鼠P物质(substanceP,SP)在脊髓背角及远位触液神经元(thedistal cerebrospinal fluid contacting neuron,dCSF-CN)表达的影响。方法采用CB-HRP大鼠侧脑室注射示踪标记dCSF-CN;48h后先鞘内注射0.5%左旋布比卡因10μl(并以鞘内注射10μl人工脑脊液作对照),大鼠左后掌足跖部皮下注射2.5%福尔马林建立炎性痛模型,记录大鼠舔足时间,1h后测定机械缩足阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)评估机械痛敏;免疫组织化学光镜镜检及免疫电镜镜检P物质在脊髓背角(L4~5)及dCSF-CN的表达。结果鞘内注射左旋布比卡因减少大鼠福尔马林试验的舔足时间(P<0.01),MWT值无变化(与基础值对比,P>0.05),SP在脊髓背角及dCSF-CN的表达弱于对照组(P<0.01)。结论鞘内注射左旋布比卡因减低脊髓伤害性疼痛反应及下调SP在dCSF-CN的表达。     

脊髓c-Jun在NMDA受体NR2B亚基介导的大鼠吗啡镇痛耐受中的作用

目的探讨脊髓c-Jun在N-甲基-D-天冬氨酸(N-meth-yl-D-aspartate,NMDA)受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受中的作用。方法取Sprague-Dawley(SD)成年大鼠连续7 d鞘内注射吗啡10μl(1.5 g.L-1)建立慢性吗啡镇痛耐受模型。应用热水甩尾法测定甩尾潜伏期(疼痛指标)以观察痛反应变化。应用免疫组织化学染色法检测磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和总c-Jun(t-c-Jun)的表达。结果鞘内注射吗啡7 d,可激活大鼠脊髓的c-Jun,表现为神经元内p-c-Jun表达升高;鞘内注射NR2B选择性拮抗剂10μl Ro256981(2 g.L-1)可以抑制慢性吗啡镇痛耐受时脊髓神经元c-Jun的激活,并明显拮抗吗啡镇痛耐受的形成。结论脊髓神经元c-Jun的磷酸化参与NMDA受体NR2B亚基介导的吗啡镇痛耐受。     

鞘内注射氯胺酮对内脏痛大鼠远位触液神经元Fos蛋白表达的影响

目的观察鞘内注射氯胺酮对内脏痛大鼠远位触液神经元(dCSF-CN)Fos蛋白表达的影响。方法 SD大鼠侧脑室注射霍乱毒素亚单位B与辣根过氧化物酶复合物(CB-HRP)示踪标记dCSF-CN。48h后氯胺酮(K)组(n=10)鞘内注射氯胺酮50μg,人工脑脊液(C)组(n=10)鞘内注射等体积人工脑脊液。两组均在乙状结肠壁注射甲醛制作内脏痛模型。进行各时间点疼痛学评分,免疫组织化学法检测Fos蛋白在dCSF-CN中的表达。结果与C组相比,K组大鼠各时间点疼痛学评分降低(P<0.01),dCSF-CN中Fos蛋白表达下降(P<0.01)。K组未见CB-HRP/Fos双标记神经元。结论鞘内注射氯胺酮可以降低大鼠内脏痛反应,减少dCSF-CN中Fos蛋白的表达。     

鞘内注射芬太尼对糖尿病周围神经病变大鼠脊髓TNF-α表达的影响

目的 观察芬太尼对糖尿病周围神经病变模型大鼠脊髓肿瘤坏死因子α（TNF-α）表达的影响,以及其脊髓保护作用,探讨其镇痛机制。方法 成年雌性Wistar大鼠70只,随机取10只设为正常对照组（A组）,腹腔注射0.9%氯化钠溶液3 mL&#8226;kg 1&#8226;d 1;其余大鼠腹腔注射链脲菌素（STZ）建立糖尿病模型,得48只糖尿病模型大鼠。对照组和糖尿病模型大鼠实施鞘内置管,分别成功8只和32只。A组8只鞘内各注射0.9%氯化钠注射液10 μL;将糖尿病大鼠随机等分为2组,糖尿病对照组（B组）16只鞘内注射与A组等体积0.9%氯化钠注射液;芬太尼治疗组（C组）16只鞘内注射芬太尼0.5 μg&#8226;（10 μL）^-1;于给药后第1,2,3,4周分别进行行为学测定,记录机械缩足阈值;取脊髓切片,用尼氏染色法观察脊髓的病理形态学改变;应用免疫组化方法和图象分析系统检测脊髓背角TNF-α的表达。结果 与A组比较,B、C组大鼠机械缩足阈值降低（均P＜0.05）,脊髓背角组织中TNF-α表达显著升高（均P＜0.01）;与B组比较,C组机械缩足阈值升高 （P＜0.05）,TNF-α表达显著降低（P＜0.01）。尼氏染色显示,B组大鼠脊髓尼氏小体呈现破碎和溶解性改变,鞘内注射芬太尼可改善尼氏小体的变化。结论 糖尿病大鼠周围神经病变引起的神经痛与脊髓背角促炎性细胞因子TNF-α有关。鞘内注射芬太尼对脊髓有保护作用,并可明显抑制脊髓背角TNF-α的表达,减轻糖尿病神经痛。     

鞘内注射哌唑嗪对氯胺酮抗伤害作用的影响

目的　探讨脊髓α1 受体和氯胺酮(Ket, 37. 5mg·kg-1,ip)抗伤害作用的关系。方法　用热水甩尾法观察大鼠鞘内预先注射α1 受体拮抗剂哌唑嗪(Pra, 10, 30μg)对Ket抗伤害作用的影响。并用c fos基因免疫组织化学技术,观察Ket对痛刺激诱发的大鼠脊髓c- fos表达的调节作用及鞘内预先注射Pra(30μg)对Ket调节作用的影响。结果　鞘内单独注射各剂量Pra对动物痛阈均无明显影响(P>0 .05), 鞘内预注Pra(10μg)对Ket抗伤害作用无明显影响(P>0 .05)。而鞘内预注Pra(30μg)则可明显减弱Ket抗伤害作用(P<0 .05)。痛刺激前给予Ket明显减少背角各层Fos免疫阳性神经元的数量(P<0 .05),Ket对痛刺激诱发的脊髓ⅠⅣ层c fos表达的抑制作用可被鞘内预注Pra所减弱(P<0 .05)。结论　脊髓α1 受体参与Ket抗伤害作用。     

鞘内注射IL-18中和抗体对大鼠吗啡耐受形成的影响

目的探讨阻断脊髓IL-18对大鼠吗啡耐受形成的影响及可能机制。方法♂SD大鼠40只,随机均分为5组(n=8)。Ⅰ组为生理盐水对照组,Ⅱ组为吗啡耐受组,Ⅲ组为IgG对照组,Ⅳ组、Ⅴ组为IL-18中和抗体(0.4μg、4μg)处理组。所有大鼠均行鞘内置管,手术5 d后确定导管位置(记为第1天)。第3～9天,各组建立吗啡耐受模型并进行相应处理。第2、10天,测定各组大鼠热刺激缩足反应潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)及尾静脉注射吗啡后30 min的PWTL,计算30 min时最大可能镇痛效应比值(%MPE)。第10天行为学测试后,取大鼠脊髓腰膨大,采用免疫印迹法(Western blot)检测ERK与p-ERK蛋白表达水平,免疫荧光法分析星形胶质细胞标记物GFAP表达水平。结果①第2天:各组大鼠给予吗啡后30 min%MPE差异无统计学意义(P>0.05)。第10天:给予吗啡30 min后,与Ⅰ组相比,其余4组%MPE均明显降低(P<0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅲ组、Ⅳ组差异无统计学意义(P>0.05),Ⅴ组%MPE明显升高(P<0.05)。②Western blot结果显示,与Ⅰ组相比,其余各组p-ERK表达量均升高(P<0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅲ组、Ⅳ组p-ERK表达水平无统计学意义(P>0.05),V组明显降低(P<0.05)。③免疫组织荧光染色结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组大鼠腰段脊髓背角GFAP阳性荧光明显增加。而与Ⅱ组相比,Ⅴ组大鼠腰段脊髓背角GFAP免疫荧光强度明显降低。结论 IL-18中和抗体可以缓解吗啡耐受的形成,该效应可能与其抑制脊髓ERK的磷酸化,缓解背角星形胶质细胞的活化有关。     

丙戊茶碱预处理削弱大鼠关节炎痛觉过敏的脊髓机制

目的研究预先鞘内注射丙戊茶碱对大鼠佐剂性关节炎热痛觉过敏的影响及其作用是否与抑制脊髓星形胶质细胞活化相关。方法实验采用大鼠右后爪踝关节外侧皮下注射CFA50μl致炎模型。①SD大鼠48只,随机分为6组(n=8),生理盐水(normal saline,NS)组:鞘内注射(intrathecal injection,it)NS10μl加皮下注射NS50μl;模型组:NSi加皮下注射CFA;单用丙戊茶碱组:10μg/10μl丙戊茶碱i加皮下注射NS;丙戊茶碱治疗组,分别为p2.5、p5、p10组:2.5μg/10μl、5μg/10μl及10μg/10μl丙戊茶碱it加皮下注射CFA。热辐射法测定各组大鼠热缩足反射潜伏期。②SD大鼠30只,随机分为6组(n=5),随机取3组鞘内预先注射生理盐水10μl,30min后注射CFA50μl,并分别于注射CFA5h、3d、7d麻醉;余大鼠预先注射丙戊茶碱(10μg/10μl,it),每天1次,30min后注射CFA50μl制成炎症模型,分别于注射CFA后5h、3d、7d麻醉;灌注,取材,免疫组化分析在炎症的不同阶段,大鼠炎症侧脊髓背角星形胶质细胞标志物GFAP表达。结果①模型组大鼠注射侧d2热缩足反射潜伏期与生理盐水组比较明显缩短(P<0.01),鞘内注射丙戊茶碱(5和10μg/10μl组)5h后大鼠热缩足反射潜伏期明显延长(P<0.01),有效作用时间为d1~d7;2.5μg/10μl组药物有效作用时间为d1~d2;注射对侧肢体大鼠行为学在实验观察期间没有明显变化;②模型组大鼠注射侧脊髓背角星形胶质细胞活化明显,积分光密度值增加(P<0.01)。鞘内注射丙戊茶碱(10μg/10μl组)5h后免疫组织化学染色可看到GFAP染色变浅,星形胶质细胞分支缩短,积分光密度值下降(P<0.01)。结论预先鞘内注射丙戊茶碱可提高大鼠热反射缩足潜伏期,可能通过抑制脊髓部位星形胶质细胞活化发挥抗伤害性作用。     

鞘内注射6-羟多巴胺、α_1受体拮抗剂对氯胺酮脊髓镇痛作用的影响

目的　在体探讨脊髓去甲肾上腺素 (NE)能神经元α1受体和氯胺酮 (Ket)脊髓镇痛的关系。方法　用热水甩尾法观察鞘内注射 (ith)氯胺酮 5 0、10 0、2 0 0 μg对小鼠甩尾潜伏期(TFL)的影响。并观察鞘内分别预先注射 6 羟多巴胺 (6 OH DA ,6 μg)、α1受体拮抗剂哌唑嗪 (Pra,5、15 μg)或特拉唑嗪(Ter,5、15 μg )对Ket(10 0 μg ,ith)脊髓镇痛的影响。 结果　Ket(5 0 μg ,ith)对小鼠TFL无影响 (P >0 0 5 ) ,而Ket(10 0、2 0 0μg ,ith)可剂量依赖性地延长小鼠TFL(P <0 0 5 )。鞘内单独注射 6 OHDA、Pra或Ter对小鼠的痛阈无影响 (P >0 0 5 )。ith 5 μgPra或Ter对Ket脊髓镇痛无影响 (P >0 0 5 ) ,而ith 6 OHDA、15 μgPra或Ter则可明显减弱Ket脊髓镇痛 (P <0 0 5 )。结论　脊髓是Ket的镇痛部位之一 ,Ket脊髓镇痛和脊髓NE神经元α1受体有关     

MK-801对吗啡依赖大鼠戒断症状及中枢cAMP含量的影响

目的观察MK-801对吗啡依赖大鼠戒断症状及脊髓和脑干cAMP含量的影响。方法选择♂性SD大鼠32只,随机分为盐水对照组、吗啡依赖组、吗啡戒断组和MK-801组,每组8只。各组在纳洛酮激发戒断后立即观察戒断症状30min,纳洛酮激发戒断后1h,处死大鼠,分离脊髓和脑干,用放射免疫法检测cAMP的含量。结果MK-801组戒断症状总分为26.06±1.98,低于吗啡戒断组61.15±3.28(P<0.01)。MK-801组脊髓cAMP含量为0.8±0.26μmol.g-1,低于吗啡戒断组(P<0.05),而与吗啡依赖组相近(P>0.05);MK-801组脑干cAMP含量为1.62±0.38μmol.g-1,低于吗啡戒断组(P<0.05),而与吗啡依赖组相近(P>0.05)。结论MK-801减轻吗啡戒断症状的机制可能与其降低大鼠中枢cAMP的水平有关。     

脊髓Cx43通过JNK通路介导大鼠慢性吗啡镇痛耐受

目的探讨脊髓缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)在慢性吗啡镇痛耐受中的作用及其是否通过JNK通路介导慢性吗啡镇痛耐受。方法 Sprague-Dawley(SD)成年♂大鼠连续7 d鞘内注射吗啡10μl(1.5 g.L-1)建立慢性吗啡镇痛耐受模型。采用热辐射甩尾法测定甩尾潜伏期以观察吗啡的镇痛效果。应用Western blot法检测Cx43、磷酸化JNK(p-JNK)、总JNK(t-JNK)、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和总c-Jun(t-c-Jun)的表达;免疫组织荧光染色法检测脊髓Cx43的免疫反应性(immnunoreactivity,IR)。结果吗啡耐受引起大鼠脊髓Cx43的表达明显增多;Gap26(特异性Cx43阻断剂,1.5 g.L-1,10μl)可以拮抗吗啡镇痛耐受,并且明显地抑制慢性吗啡镇痛耐受所致的脊髓JNK及c-Jun的激活。结论脊髓Cx43通过JNK通路介导大鼠慢性吗啡镇痛耐受。     

Antagonism by phenoxybenzamine of the analgesic effect of morphine injected into the nucleus reticularis gigantocellularis of the rat.

Effects of some monoaminergic blockers on the analgesia induced by morphine microinjection into the nucleus reticuloris gigantocellularis were studied in rats. Pretreatment with phenoxybenzamine (0.1–1 mg/kg i.p.), but neither propranolol (5 mg/kg i. p.) nor methysergide (i mg/kg i.p.), suppressed the analgesic effect of morphine. The morphine analgesia was also inhibited by intrathecal administration of phenoxybenzamine (10 μg) at the level of the lumbar spinal cord. These results emphasise the important role of the spinal noradrenergic system, mediated by α-adrenoceptors, in the production of analgesia by morphine injected into the nucleus reticularis gigantocellularis.