MSCs修饰受体胸腺对异种心脏移植免疫排斥反应的作用研究

目的大鼠胸腺以豚鼠骨髓间充质干细胞进行修饰,然后行豚鼠到大鼠的异种心脏移植。研究以间充质干细胞修饰胸腺对异种移植心脏存活时间的影响。方法供体豚鼠和受体SD大鼠各20只随机分成四组,A组(对照组);B组(胸腺修饰IT组);C组(CVF组);D组(IT加CVF组)。观测指标:移植心脏存活时间,病理变化,供受体异种淋巴细胞毒性试验。结果供心平均存活时间:A组(23.20±6.14)min,B组(24.20±9.28)min,C组(335.40±49.23)min,D组(451.00±50.10)min。A与B组两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。C、D组平均存活时间较A、B明显延长,差异有统计学意义(P<0.05)。D组与C组组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。供受体淋巴细胞反应,测得光密度值分别为:D组为(381.20±12.01),A组为(590.20±15.38),胸腺修饰组明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论豚鼠到大鼠心脏异种移植中,豚鼠MSCs修饰大鼠胸腺,当克服HAR后可以延长供心存活时间,但并不能完全克服AVR的发生。     

MSCs共培养抗ARPE-19细胞氧化应激的作用研究

目的探讨MSCs共培养抗ARPE-19细胞的氧化应激作用。方法常规培养人RPE细胞系ARPE-19细胞,分为正常组、H_2O_2组和共培养组;通过检测细胞内超氧化物气化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)水平变化,研究分析MSCs共培养抗ARPE-19细胞氧化应激作用。结果 H_2O_2诱导的氧化应激能显著降低SOD和GSH-Px水平,并提高MDA水平;而MSCs共培养预能显著逆转这种变化,以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 MSCs共培养有抗H_2O_2诱导的人视网膜上皮细胞氧化应激作用。     

阻断共刺激信号在异种小动物心脏移植中诱导免疫耐受的研究

目的在非协调性异种小动物豚鼠-大鼠心脏移植模型当中,通过单克隆抗体阻断T细胞B7/CD28及CD40/CD40L激活通路途径来探讨T细胞在异种移植延迟性免疫排斥中的作用,探索诱导异种移植T细胞外周耐受的可能性。方法将供体三色豚鼠和受体SD大鼠随即分成四组：A组（对照组）,在移植前一天大鼠腹腔内注射CVF 0.4mg/kg;B组（B7mAb组）,在移植当天大鼠腹腔内注射B7单抗0.1mg,余处理同A组;C组（CD40LmAb组）,在移植当天大鼠腹腔内注射CD154单抗0.1mg,余处理同A组;D组（联合组）,在移植当天大鼠腹腔内注射B7单抗0.1mg、CD154单抗0.1mg,余处理同A组。观察各组供心存活的时间,并行移植心脏的常规病理和免疫组化检查。结果对照组移植心脏的存活时间为（19.5±2.7）h,与对照组比较,B7组、CD40L组和联合处理组的移植心脏存活时间均得到了显著的延长,但联合处理组延长最为明显。移植心脏组织病理学检查均呈急性血管排斥反应改变,且以CD8＋T细胞浸润为主。结论联合阻断CD28/B7与CD40/CD40L共刺激通路可延长异种移植心脏存活时间。     

骨髓干细胞诱导大鼠心脏移植免疫耐受的实验研究

目的探讨注射供者的骨髓十细胞对大鼠异位移植心的影响。方法以wistar大鼠为供者．SD大鼠为受者,制作Wistar大鼠的骨髓干细胞．建立大鼠同种异体异位心脏移植模型。心脏移植术前2h经受者阴茎静脉注射骨髓干细胞0．3m1．心脏移植术后分别观察受者注射同一供者和无关供者的骨髓干细胞后移植心脏的存活时间;心脏停跳后取移植心做病理检查及免疫组织化学检测。结果心脏移植术前受者接受同一供者和无关供者的骨髓干细胞后,前者移植心脏存活时间延长,分别为（37．0±16．5）d和（9．5±2．4）d．两组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;且前者心肌出血、坏死程度更轻,心肌组织内IgM和IgG沉积更少。结论注射同一供者的骨髓干细胞能特异性减轻大鼠移植心脏的排斥反应．明显延长其存活时间。     

豚鼠到大鼠异种心脏移植模型的改进

目的 探讨豚鼠到大鼠异种腹腔心脏移植模型建立的技巧.方法 改进了供受体的麻醉、供心的摘取、受体腹腔血管的准备、心肌保护及血管吻合技术,建立66例豚鼠到大鼠异种腹腔心脏移植模型.结果 豚鼠到大鼠异种腹腔心脏移植的成功率达90.91%,缩短了手术时间.结论 通过技术的提高,提高了豚鼠到大鼠异种心脏移植的成功率.     

胸腺内预注射异基因脾细胞使移植心肺存活延长的实验研究

用改良Fox－Lee术式建立大鼠异位心脏、肺叶联合移植模型。受体SD大鼠胸腺内预注射供体Wistar大鼠牌细胞5×107联合一次性腹腔注射抗淋巴细胞血清1ml,3周后接受移植,成功诱导免疫耐受,移植心肺不需免疫抑制剂而长期存活（MST＝78．00±22．66d）;对照组和空白对照组移植心肺均被排斥。其机制有待进一步深入研究。     

鼠异种心脏移植miRNA表达谱分析*

【摘要】 目的 研究小鼠-大鼠异种异位心脏移植后供心miRNA表达谱的变化,为有效控制异种移植排斥反应奠定实验基础。方法 采用改良Cuff袖套法建立小鼠-大鼠异位心脏移植模型,分为同系对照组、异种24h组和异种停跳组。通过miRNA芯片杂交筛选出异种心脏移植排斥反应中显著差异表达的miRNA,选取芯片结果中差异表达显著的miR-146a和miR-451进行相对定量研究,通过TaqMan miRNA Assays技术验证芯片结果。结果 异种24h组与同系对照组比较有24个miRNA差异表达显著,其中11个下调,13个上调。异种停跳组与同系对照组比较有25个miRNA差异表达显著,其中12个下调,13个上调。异种组的miR-146a表达水平高于同系对照组,miR-451表达水平低于同系对照组(F分别为15.530、13431.6,均P<0.05)。结论 在小鼠-大鼠异种心脏移植排斥反应中出现多个miRNA显著差异表达,其中miR-146a高表达,miR-451低表达,提示miRNA在异种心脏移植排斥反应中发挥着重要的调控作用。     

大鼠胸腺内猪胰岛异种移植的实验研究

目的:观察胸腺内和肾包膜下胰岛移植对移植物存活时间的影响。方法:我们应用胰管内注射胶原酶的方法分离出猪胰岛为供体,以W istar糖尿病大鼠为受体,通过移植物的存活期来观察大鼠胸腺内及肾包膜下猪胰岛异种移植的效果。结果:单纯胸腺内移植的存活期(6.0±3.6)d,长于单纯肾包膜下组的(5.3±1.8)d。移植的同时加用抗大鼠胸腺淋巴血清(ATS),胸腺内移植+ATS的存活期为(21.7±9.1)d,明显长于肾包膜下移植+ATS组的(13.7±3.2)d。结论:胸腺可能为胰岛移植的理想部位,而且在诱导免疫耐受中具有重要作用。     

Cx43表达与多发性骨髓瘤细胞耐药的相关性

目的探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)连接蛋白43(Cx43)表达对多发性骨髓瘤(MM)RPMI 8226细胞耐药的影响。方法体外分离、培养BMSCs,采用RT-PCR法检测BMSCs、RPMI 8226细胞Cx43的表达,流式细胞术和多重液相蛋白定量技术分别检测BMSCs与RPMI 8226细胞共培养对RPMI 8226细胞凋亡和细胞因子分泌的影响。结果 BMSCs及RPMI 8226细胞均表达Cx43。BMSCs与RPMI 8226细胞共培养后,上清液中IL-6、IL-10和TGF-β水平增加,硼替佐咪诱导的RPMI 8226细胞凋亡作用减弱;而细胞间隙连接通讯(GJIC)特异性阻断剂18α甘草次酸(18α-GA)能明显逆转上述观察指标的改变过程。结论 BMSCs与RPMI 8226细胞间可形成功能性GJIC,是BMSCs促进MM细胞生存及介导其耐药的重要原因之一。     

骨髓间充质干细胞对大鼠胸腺衰老保护作用的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞对衰老模型大鼠胸腺损伤的保护作用及其机制.方法 采用D-半乳糖建立大鼠免疫衰老模型,造模成功后,随机分为衰老模型组,MSCs细胞治疗组;另取健康大鼠作为对照组,每组大鼠10只.MSCs治疗组给予尾静脉输注3×106个间充质干细胞,同时对照组和模型组给予注射等量生理盐水.采用流式细胞仪检测胸腺中CD4+和CD8+T细胞比例;酶联免疫法(ELISA)检测各组血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM含量;单细胞凝胶电泳技术检测淋巴细胞的DNA损伤.应用实时定量逆转录PCR法检测各组胸腺组织P53 mRNA的表达.结果 与模型组相比,治疗组CD4+和CD8+T细胞比例升高,ELISA实验结果显示免疫球蛋白IgA、IgG和IgM含量明显提高,单细胞凝胶电泳显示凋亡细胞减少,差异均有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,模型组胸腺组织的P53 mRNA表达升高;而与模型组比较,治疗组P53 mRNA表达显著降低(P＜0.05).结论 骨髓间充质干细胞能提高衰老大鼠的胸腺免疫功能,可能与降低P53基因的表达有关.     

骨髓间充质干细胞移植和雷米普利对兔心肌梗死后心功能影响的对照研究

目的　探讨诱导分化后的骨髓间充质干细胞 (MSC)移植和血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)雷米普利在改善兔心肌梗死 (MI)后的心功能方面是否具有协同作用。方法　 4 0只经结扎冠状动脉前降支形成MI的兔随机分为四组 ,两组不予雷米普利 ,MI后 2周心肌内注射培养基 (1组 )或诱导分化后的MSC(2组 ) ;另两组MI后即通过饮水途经给予雷米普利 1mg·kg 1·d 1,持续 8周 ,并在MI后第 2周心肌内分别注射培养基 (3组 )或诱导分化后的MSC(4组 )。MI后 8周 ,结合心脏超声多普勒和血液动力学参数评价心功能。结果　 2、3两组间具有相似的心功能改善 ,即左室射血分数 (LVEF)增加 ,左室舒张末期压 (LVEDP)降低 ;2组左室前壁和间隔收缩速度增大 ,而 3组无明显增加 ;4组与 2组及 3组相比 ,心功能改善更明显 ,表现在LVEF的增加更显著。结论　单用诱导分化的MSC移植与单用ACEI治疗对兔MI后心功能的改善程度相似 ;而两者合用具有协同作用 ,能进一步改善兔MI后的心功能     

磁标记骨髓间充质干细胞的实验研究

目的探讨不同时间及浓度超顺磁性氧化铁(SPIO)标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)标记效率、标记后细胞活力等情况,寻找最佳标记浓度和时间。方法配制含不同浓度SPIO培养基,加入MSCs孵育,于标记后不同时间行铁染色、细胞活力、铁含量测定。结果细胞活力检测显示标记1d和3d时,0μg/ml组与25μg/ml组,0μg/ml组与50μg/ml组,25μg/ml组与50μg/ml组的细胞拒染率差异无统计学意义(P>0.05)。铁含量测定显示标记浓度在50μg/ml,标记时间3d时铁含量最高。结论50μg/ml浓度,标记3d不仅标记效率高对细胞活力无影响,而且细胞内铁含量最多,为最佳标记浓度和时间。     

BMP2、VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达

目的观察转染BMP2和VEGF165双基因共表达质粒在小鼠骨髓基质干细胞的表达情况。方法脂质体介导下将双基因真核表达质粒pIRES-BMP2-VEGF165导入小鼠骨髓基质干细胞,用RT-PCR和免疫组织化学方法观察BMP2和VEGF165双基因在小鼠骨髓基质干细胞内的表达。结果转染BMP2、VEGF165的小鼠骨髓基质干细胞有明显的BMP2和VEGF165 mRNA及其蛋白表达。结论转染BMP2和VEGF165双基因的小鼠骨,髓基质干细胞能同时表达以上两种基因。     

间充质干细胞临床应用的安全性问题

间充质干细胞是干细胞家族的重要成员,起源于中胚层和外胚层,因其具有易分离、趋化性、免疫调节作用、多向分化潜能等生物学特性而日益受到人们的关注,并成为细胞疗法中治疗各种难治性疾病的热门种子细胞,然而细胞疗法所涉及的潜在风险还不确定。本文就间充质干细胞应用所涉及的安全性问题作综述,并强调建立规范化的应用标准更有利于细胞产品在临床上的应用和推广,给广大患者带来真正的福音。     

胎盘间充质干细胞向神经细胞诱导的实验研究

目的间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力的特点,尽管其主要来源骨髓间充质干细胞(BMSCs)已被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。但在严重感染或随着年龄的增长骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下,就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSC,有必要寻找MSC的新来源。方法消化胎盘组织、贴壁培养获得基质细胞;用流式细胞仪检测其细胞表面标志;比较叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole,BHA)、复方丹参注射液、β-巯基乙醇(BME)等对培养的基质细胞向神经细胞分化的作用;采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果胎盘组织中分离出的基质细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志,并可诱导表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolasen,NSE)、神经微丝(neurofilament,NF)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein,GFAP)。结论胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。胎盘间充质干细胞可能是一种可为临床治疗提供丰富新来源的间充质干细胞。     

体外定向诱导脐血间充质干细胞向类肝细胞分化的研究

目的 探讨诱导人脐血间充质干细胞（UBCMSCs）向类肝细胞定向分化的可能性。方法 采用密度梯度离心法与直接贴壁法相结合，从人脐血中分离UBCMSCs；通过流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44，确定UCBMSCs的比例。在UCBMSCs培养体系中，加入人肝细胞株L-02细胞培养上清液或诱导因子（联用HGF和FGF-4）共培养，检测诱导后第7天、14天细胞内细胞角蛋白18（CK18）、白蛋白及糖原的表达。结果 从脐血中分离获得均一贴壁的UBCMSCs；在UBCMSCs培养体系中，无论是添加L-02细胞培养上清液，还是采用诱导因子HGF和FGF-4，均可诱导UCBMSCs细胞内表达中晚期成熟肝细胞表面标志物CK8＆18、白蛋白及糖原。结论 密度梯度离心法和直接贴壁法相结合能够有效分离UCBMSCs；L-02人肝细胞培养上清液或诱导因子HGF、FGF-4均具有诱导UCBMSCs向类肝细胞定向分化的作用。     

重组人生长激素联合骨髓间充质干细胞静脉移植对心力衰竭大鼠心功能的影响

目的探讨重组人生长激素(rGH)联合骨髓间充质干细胞(MSC)静脉移植对阿霉素诱导心肌病心力衰竭(心衰)大鼠的心功能影响。方法①分离纯化MSC进行体外培养,采用流式细胞仪检测其表面标记CD45,CD44和CD71。②将50只Wistar大鼠,选取阿霉素成功诱导的40只心肌病心衰模型,随机分成4组,心衰组,静脉移植组,rGH组,MSC+rGH组,rGH组为皮下注射,静脉移植组为尾静脉注射MSC,心衰组不给予任何干预措施。由彩色超声心动图和血流动力学检查监测心功能参数。结果发现体外培养的第2代MSC均表达CD44和CD71,不表达CD45。在静脉移植4周后,发现治疗组心功能指标(超声心动图和血流动力学指标)均有改善。静脉移植,rGH加静脉移植和rGH组3组之间心功能指标差异无统计学意义,但rGH加静脉移植较静脉移植和rGH两组心功能指标改善更明显,与心衰组相比心功能指标差异均有统计学意义。结论rGH联合MSC静脉移植对阿霉素诱导心肌病心衰大鼠的心功能有明显改善。     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的机制研究

目的体外诱导成人骨髓间充质干细胞(MSCs)向神经元样细胞分化,并探讨分化过程中多效蛋白(PTN)mRNA的表达,以了解MSCs向神经元样细胞分化的特性和机制。方法密度梯度离心加贴壁培养法分离成人MSCs,原代和传代培养。取第6代MSCs设对照和试验组进行诱导,诱导后30 min至3 d,观察细胞形态并计数。免疫细胞化学法和反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法测定分化后细胞神经细胞特异性表面标志神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP)-2,胶原酸性蛋白(GFAP)和诱导前、诱导后12 h PTN mRNA的表达。结果接种24 h后MSCs开始贴壁,呈圆形或椭圆形。3 d后可见梭状细胞呈集落状生长,10～14 d融合。第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。诱导后胞体向胞核收缩;出现双极及多极细胞。12 h变形细胞增多,细长突起相互连接。24 h后变形细胞增多不明显。诱导后12 h大部分细胞表达NSE(64.79±0.07)%、MAP-2(60.05±0.09)%,未检测到GFAP的表达,RT-PCR半定量检测有NSE mRNA的表达(0.66±0.15)。实验组诱导后12 h细胞有PTN mRNA的表达(0.689±0.017)。结论建立了稳定的成人MSCs培养增殖体系,MSCs可体外诱导分化为神经元样细胞,在分化过程中有外观形态变化和特异性标志物NSE和MAP-2的表达,同时有PTN mRNA的表达,提示PTN可能参与调控了MSCs向神经元样细胞的分化。