EB病毒衣壳蛋白P23重组质粒的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的 构建pPICZα A-BLRF2重组表达载体,实现BLRF2重组蛋白在毕赤酵母中高效分泌表达,为进一步研制高效能重组抗原诊断试剂,研发亚单位疫苗奠定基础.方法 以B95-8细胞提取的EBV DNA为模板,采用PCR法扩增出目的基因片段BLRF2,与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,电转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达,表达产物经Western blotting进行鉴定.结果 成功构建pPICZαA-BLRF2重组质粒,并在毕赤酵母菌中成功表达了分泌型BLRF2重组蛋白.结论 在毕赤酵母GS115中高效分泌表达了P23蛋白,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZα A-BLRF2生产酵母工程菌株,为进一步应用研究奠定了基础.     

犬细小病毒VP2基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

目的表达犬细小病毒VP2蛋白(CPV VP2),用于犬细小病毒病的诊断、疫苗研制和VP2蛋白功能研究。方法采用PCR方法对CPV VP2基因进行扩增,将CPV VP2基因克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPICZαA中,构建真核重组表达载体pPICZαA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化毕赤酵母菌GS115中,在甲醇诱导下表达CPV VP2,SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达蛋白。结果成功扩增了CPV VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZαA-VP2在毕赤酵母菌中表达出约64.35 kD蛋白。Western blotting鉴定表明,表达VP2蛋白与犬细小病毒阳性血清有反应性。结论在毕赤酵母中成功地表达了CPV VP2蛋白,能被犬细小病毒阳性血清识别。     

肿瘤相关抗原17-1A在毕赤酵母中的表达与鉴定

目的利用Pichia pastoris酵母表达系统表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A,为进一步设计肿瘤蛋白疫苗提供研究基础。方法通过RT-PCR从小鼠肾组织中扩增17-1A的cDNA,将其定向克隆到pPICZαA质粒上,获得重组质粒pPICZαA-17-1A,测序正确后,重组质粒电转化到Pichia pastoris酵母菌株GS115中,在甲醇诱导下,利用其AOX I基因的α信号肽,分泌表达17-1A抗原糖蛋白,并对获得的蛋白进行SDS-PAGE及Western blot分析鉴定。结果构建了pPICZαA-17-1A重组质粒,通过电转化将目的基因整合人酵母基因组中,重组毕赤酵母表达能够表达17-1A抗原并检测到抗原发生了糖基化。结论能够通过毕赤酵母表达系统稳定表达糖基化的肿瘤相关抗原17-1A。     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.     

人源抗菌肽LL-37表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

目的:构建人源抗菌肽LL-37的表达载体pPIC9-LL-37,将其转化毕赤酵母GS115,诱导LL-37表达.方法:根据抗菌肽LL-37氨基酸序列及毕赤酵母偏爱密码子,应用互补延伸PCR技术扩增抗菌肽LL-37基因,定向克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9上,转化E.coli DH5α,构建重组分泌型酵母表达载体pPIC9-LL-37,PCR鉴定并测序;原生质球法转化毕赤酵母GS115,PCR扩增鉴定;甲醇诱导LL-37表达,筛选最高表达株,检测表达产物对大肠杆菌的抑菌活性,并对其进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹分析.结果: pPIC9-LL-37载体构建成功;转化毕赤酵母后PCR鉴定出LL-37基因;0.5%甲醇能诱导LL-37高表达,筛选出最高表达株,发酵上清约含LL-37 0.5 μg/ml,对E.coli具有较强的抑菌活性,电泳及Western印迹分析证实表达产物为LL-37.结论:成功构建pPIC9-LL-37载体,转化毕赤酵母后,经甲醇诱导能高表达分泌LL-37,表达的LL-37蛋白具有较强的抑菌活性.     

戊型肝炎病毒 ORF2截短蛋白 p154在毕赤酵母中的分泌性表达及其抗原性

目的：利用毕赤酵母系统表达戊型肝炎病毒（HEV）ORF2编码蛋白第452～605氨基酸多肽（p154）,探讨毕赤酵母表达系统用于研发戊型肝炎基因工程疫苗的可能性。方法：采集戊型肝炎患者粪便,进行RT-PCR检测和测序鉴定,并依此为模板扩增ORF2 p154基因,克隆到表达载体pPICZαA上,电转化入毕赤酵母宿主菌GS115,经筛选鉴定后将携带目的基因的重组克隆菌进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹法分析。结果：利用基因重组技术构建了含HEV p154片段的pPICZαA重组质粒,并在毕赤酵母菌株GS115中实现了分泌性表达,表达的目的蛋白p154分子质量约为22 kDa,上清中p154表达量可达到200μg· ml -1。 p154可与HEV感染兔恢复期血清及HEV单克隆抗体6F9进行反应,表明酵母表达的p154具有良好的抗原性。结论：HEV ORF2 p154在毕赤酵母表达系统中得到了成功表达,为进一步研发真核表达的戊型肝炎基因工程疫苗奠定了实验基础。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

人透明带蛋白3真核表达载体的构建

目的 构建人ZP3蛋白(从第23位到348位氨基酸)真核表达载体,用于在毕赤酵母中表达重组人ZP3蛋白.方法 通过PCR方法扩增编码人ZP3蛋白的基因,并将其克隆入毕赤酵母表达载体pPICZ构建真核表达质粒pPICZα-hZP3.结果 经PCR扩增获得的hZP3基因大小为978 bp,其DNA测序结果分析表明:pPIC...     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

人血管抑素K1-3在毕赤酵母胞内表达的研究

目的:构建人血管抑素K1-3的重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3,获得重组目的蛋白.方法:从胎儿肝脏组织用RT-PCR方法扩增人血管抑素K1-3目的基因,克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中,线性化后转化到毕赤酵母GS115胞内,经PCR和Sourthern杂交筛选出阳性转化子,并用甲醇诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE(12%)和Western blot检测,经赖氨酸亲和层析柱纯化后,用Lowry法测定蛋白含量,并进行生物活性测定.结果:SDS-PAGE和Western blot结果显示,表达蛋白质的相对分子量为30kd左右,低糖基化.Lowry法测定蛋白表达量为6.8mg/L.活性测定实验表明重组血管抑素能特异抑制人血管内皮细胞的增殖.结论:在毕赤酵母GS115胞内成功表达了人血管抑素K1-3重组蛋白.     

可溶性GPC3基因的克隆及酵母表达

目的克隆可溶性磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（soluble glypican-3,sGPC3）基因,并分泌表达重组蛋白。方法通过RT-PCR克隆sGPC3 cDNA,利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位点,将sGPC3基因插入酵母表达载体pPICZαA中,构建真核表达质粒pPICZαA-sGPC3,以该表达质粒转染酵母菌株X-33,在含有Zeozin的YPD平板上进行筛选,然后对PCR鉴定为阳性的酵母重组子进行甲醇诱导表达,表达上清经SDSPAGE和Western blot检测。结果使用特异性引物进行RT-PCR,获得约1 600 bp左右与目的基因大小相符的条带,构建的真核表达质粒pPICZαA-sGPC3表达框正确无误,阳性酵母重组子x-33/pPICZαAsGPC3诱导表达上清在60 000处有与预期大小相符的蛋白条带,且该蛋白条带与抗6×His单克隆抗体孵育后呈现特异性反应。结论成功克隆了可溶性GPC3基因,并在毕赤酵母中获得分泌表达,为进一步研究sGPC3对肝细胞癌的作用及作用机制、开发一种生物治疗肝癌的新型药物奠定了基础。     

人前列腺特异性抗原基因重组表达载体pPICZαC-m PSA的构建和表达

目的在毕赤酵母细胞中表达PSA,为临床的检测和治疗提供材料.方法经RT-PCR获得PSA全长cDNA并测序.将编码成熟PSA 237氨基酸的cDNA序列插入毕赤酵母表达载体pPICZα-C,该载体含有AOX1启动子和α-factor信号肽序列,构建表达载体体pPICZαC-m PSA.甲醇诱导X33细胞表达rPSA,ELASA试剂盒筛选高表达rPSA的细胞株.结果获得了人PSA全长序列,构建了表达载体pPICZα-m PSA.获得了高表达rPSA的酵母X33细胞株,表达产量为1.2 mg/L.结论建立了重组人前列腺特异性抗原的毕赤酵母表达体系,规模化的生产有助于PSA的生物学特性的研究和临床检测和治疗的应用.     

结核分枝杆菌ESAT-6基因在毕赤酵母中的构建及其表达

目的在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT-6基因。方法以重组质粒pET23a-ESAT-6为模板,亚克隆目的片段ESAT-6至酵母菌分泌表达载体pPICZaA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法分析。结果成功构建了pPICZaA-ESAT-6毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为18kDa的蛋白。蛋白质印迹（Western blot）显示,18kDa蛋白被活动性肺结核病人血清抗体识别。结论在毕赤酵母菌中成功表达了带有信号肽ESAT-6基因,为进一步研究新型单位疫苗打下坚实的基础。     

人α-防御素5在毕赤酵母中分泌表达的研究

目的 探索人α-防御素5成熟肽(mHD5)在酵母中高效分泌表达的可行性.方法 PCR扩增获得酵母菌偏好的mHD5密码子序列,应用基因重组方法构建表达质粒,电击转化酵母菌株GS115,应用G418浓度梯度、表型和PCR技术筛选高拷贝转化株.经摇瓶发酵和甲醇诱导,Tricine-SDS-PAGE分析重组mHD5(rmHD5)表达量,并采用Western blot鉴定.选用琼脂扩散法检测rmHD5的抑菌活性.结果 构建了pPIC9K-mHD5酵母表达质粒.筛选得到3株His /Mut 表型,且耐受8 mg/ml G418的多拷贝转化酵母菌株,成功获得表达量约120 mg/L的发酵上清.rmHD3对大肠杆菌(EC25922)和金黄色葡萄球菌(SA25923)2种标准菌株均具有明显的抑菌活性.结论 防御素基因可以在毕赤酵母中实现分泌型离表达,此策略可能是抗菌肽工业化开发的有效途径之一.     

人抑瘤素M在毕赤酵母中的高效分泌表达

目的：在毕赤酵母中高效分泌表达重组人抑瘤素M（rhOSM）。方法：以人胚胎组织DNA为模板通过PCR技术获得hOSM基因,构建毕赤酵母真核表达载体pPICZαC-hOSM,电转化毕赤酵母菌株X-33,PCR法筛选阳性克隆,SDS-PAGE和Western blotting方法筛选能够稳定、高效分泌表达rhOSM的酵母工程菌。结果：经PCR法获得了hOSM基因,培养液上清经SDS-PAGE和Western blotting证实获得了相对分子质量约为28 000的rhOSM,表达量为45　mg•L^-1。结论：毕赤酵母表达系统能够稳定、高效分泌表达rhOSM,摇瓶规模表达量为45 mg•L^-1。     

重组人可溶性凋亡素-2配体在Pichia系统中的表达

目的：在甲醇营养型酵母（Pichia)表达系统中表达重组人可溶性肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL,凋亡素－2配体）分子。方法：人可溶性TRAIL编码基因片段插入pIC3.5酵母表达载体,氯化锂转化酵母GS115株,甲醇诱导表达5d,SDS－PAGE和Western-blotting确认表达,L929细胞鉴定活性,结果：发现在酵母细胞中重组表达的TRAIL在SDS－PAGE上占总蛋白的50％以上,用抗人TRAIL多抗可以确认表达了TRAIL重组分子,杀伤肿瘤细胞的比活性较原核表达后复性的TRAIL有明显提高,并能诱导几株肿瘤细胞DNA片段化,说明TRAIL可能已正确折叠并形成活性必需的高级结构。结论：在Pichia系统中正确表达了可溶性TRAIL分子。     

人Endostatin在毕赤酵母菌中的表达及其抑癌活性研究

目的在毕赤酵母中获得有活性的分泌型重组Endostatin.方法一步法抽提胎肝总RNA,RT-PCR扩增endostatin全基因.用T-A克隆技术构建克隆载体;双酶切回收550bp的endostatin基因,亚克隆入酵母表达载体.重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定.电转化法将线形化的重组表达DNA转导入GS¨5感受态细胞,SDS-PAGE电泳筛选阳性重组子,G25及Heprin亲和层析柱初步纯化重组蛋白.MTT法测定重组endosatatin对血管内皮细胞增殖的抑制作用.结果RT-PCR获得550bp的特异扩增条带,T-A克隆后,PCR挑选阳性重组子,测序证实序列正确;亚克隆后的表达载体,PCR可得550bp的特异条带,EcoRI、Not I双酶切获得550bp和3kb的条带,与预期一致,DNA测序证明核苷酸序列100%正确.SDSPAGE证实重组菌较空白有一明显条带,Heparin亲和层析后,1mol/INaCl洗脱的蛋白峰在体外可特异性抑制血管内皮细胞的增殖.结论在毕赤酵母菌中成功地获得了分泌表达的活性endostatin蛋白.     

碳青霉烯酶OXA 72在毕赤酵母中的表达和纯化

目的对我国临床分离的第一株鲍曼不动杆菌产生的碳青霉烯酶OXA 72在毕赤酵母表达系统中进行重组表达及分离纯化。方法提取临床分离的鲍曼不动杆菌菌株40的基因组DNA,PCR扩增oxa 72全基因;将oxa 72基因双酶切回收后与毕赤酵母表达载体连接,重组质粒分别以PCR、酶切及测序鉴定;电转化法将线性化的重组表达DNA转导入GS115感受态细胞,在Zeocin平板上筛选阳性转化子,并通过PCR和Western进行验证;对阳性克隆进行头孢硝噻吩实验,检测表达OXA 72的活性。用镍柱分离纯化OXA 72。结果以该株鲍曼不动杆菌的基因组DNA为模板,用目的引物进行PCR可获得843?bp的特异扩增条带;DNA测序证明核苷酸序列与Genbank公布的oxa 72基因序列100%一致;电转化后经Zeocin平板筛选得到一株阳性克隆,SDS PAGE表明重组蛋白的相对分子量在34～43?kDa之间,Westem blot分析显示,重组蛋白能特异地与抗His Tag抗体结合。头孢硝噻吩试验为阳性。纯化得到纯度为95%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论成功构建了OXA 72的表达载体,在毕赤酵母中成功地表达并分离纯化了具有酶活性的OXA 72。