耶尔森氏菌外膜蛋1（Yop1）的提纯化与鉴定

耶尔森氏菌外膜蛋白在菌体中所占比例甚小，因而提取与纯化均有一定难，国内尚无成功的选例。我们使用了一种盐析加电沪的方法提取了Ｙｏｐ１蛋白。实验结果表明，该法简便，易行且重复性好，回收率高，使用本法提取假结核耶氏菌外膜蛋白１，自每升培基增殖的菌体中（约４．５ｇ湿重），可获得纯品６．３ｍｇ，回收率高于同类研究的６倍以上，一次怀提取的Ｙｏｐ１蛋白在十烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电沪中共显示出三条可辨认的蛋白     

耶尔森氏菌Yop1蛋白的表达及其鉴别诊断意义

利用Ｙｏｐ１－ＭｃＡｂ－ＲＩＨＡ（反向间接血球凝集试验）检测全国１７个生态型１０５株鼠疫耶氏菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）强毒株和４株弱毒标准株、６株不同血清型的假结核耶氏菌,４株小肠结肠炎耶氏菌以及３株其它肠道菌。结果显示,假结核和小肠结肠炎耶氏菌呈现较高滴度的阳性反应（滴度１：２＾７－１：２＾１０）,其余均为阴性,提示：（１）Ｙｏｐ１蛋白为耶尔森氏菌所特有;（２）鼠疫耶氏菌中突变的ｙｏｐ     

耶尔森氏菌外膜蛋白1体外表达条件的观察

使用常规培基孵育耶尔森氏菌一般均能获得满意的增菌效果。有文献报导,不同培基对耶尔森氏菌外膜蛋白(Yops)的表达无显著的影响。然而,我们的实验结果提示,Yop1的体外表达具有严格的培基依赖性,该蛋白仅在只含氨基酸成份的最小培基中才能充分表达,其表达量远高于其他几种常规培基。此外,我们还观测了细菌菌龄对这种蛋白体外表达的影响,结果表明,菌龄也影响着该蛋白的体外表达,但其作用强度不如培基那样显著。转换温度后12小时,膜制剂中Yop1的含量达到高峰,增加孵育时间不能增大含量,反而使其呈明显的下降趋势,温度转换后24小时,表达量仅略高于2.5小时的水平。本文还报导了两种孵育温度(22℃、37℃)以及钙离子对Yop1蛋白表达的作用,所得结论与国外同类研究的结果一致,即与其他Yops不同,yopA基因的表达只受生长温度的控制而与钙离子的存在与否无关。本实验的结果将有助于Yop1蛋白的分析研究,特别是此种蛋白的提取制备。     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属中致病性细菌有3种，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。其中鼠疫耶尔森氏菌是致病性最强的一种。随着分子生物学的研究进展，人们对鼠疫菌有了深入的了解。鼠疫菌外膜蛋白（Yops）是近些年对鼠疫菌的基础研究内容焦点之一。国内在世界上首先发现鼠疫菌锡林郭勒高原型病原体缺少32Kd外膜蛋白和40Kd蛋白位于膜内，     

耶尔森氏菌YadA蛋白单克隆抗体的研制与鉴定

１．以纯化的ＹａｄＡ蛋白免疫普通小鼠４只，获得小鼠ＹａｄＡ多克隆抗血清；２．利用上述免疫血清建立了ＹａｄＡ多克隆缺本的ＥＬＩＳＡ检测技术，并对其最适条件进行了观察；３．用纯化的ＹａｄＡ蛋白免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠２只，以免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞系ＳＰ２／０融合，获得１７株分泌ＹａｄＡ－ＭｃＡｂ杂交瘤细胞株，将其中４株进行了再克隆，经过半年左右的反复传代及冷冻，复苏测试，抗体分泌稳定，４     

鼠疫耶尔森氏菌荚膜抗原（F1）的几种提取方法评价

鼠疫菌荚膜Ｆ１抗原的传统提取方法费时且成本较高，本文参考不同微生物表面蛋白的制备程序，观察了６种不同实验条件下该抗原的提取效果。结果表明，鼠疫菌湿菌用ＫＣＮＳ作为解离剂提取Ｆ１抗原，和传统方法的提取效果基本一致。由于省去了丙酮制备菌粉这一烦锁步骤，从而撮程序大为减化。     

鼠疫菌6MD质粒编码的纤溶活性对假结核菌外膜蛋白1的特异降解作用

将鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒转入假结核耶尔森氏菌中,该质粒决定了杂交菌株中PstI(45kD),Pla蛋白(37kD,35kD)的合成。杂交株膜蛋白制剂的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图形与其亲本株比较,外膜蛋白1(Yop1)确实发生了降解,但这种作用较弱。值得注意的是在与亲本株菌Yop1蛋白完全相同的迁移位置上仍有相当含量的这种蛋白没有发生降解。这一结果与国外同类研究的结论有显著差异。本文就这种现象可能产生的影响进行了分析。     

KCN等试验用于筛选小肠结肠炎耶氏菌的探讨

本文应用KCN、尿素、苯丙氨酸和赖氨酸等四项生化试验对小肠结肠炎耶氏菌进行初步鉴定。对所分离到的肠杆菌科常见的12个属的629株细菌进行试验。小肠结肠炎耶氏菌的反应模式为:KCN(-)、尿素(+)、苯丙氨酸(-)、赖氨酸(-),与肠杆菌科其他属(种)的细菌有明显区别。本文还对KCN试验的条件进行了探讨,发现培养温度以37℃、培养时间以18～24小时所出现的结果准确可靠。     

胶体金免疫层析法与双单克隆抗体夹心ELISA检测鼠疫F1抗原的比较

目的比较胶体金免疫层析法（GICA）和双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（DMcAbS-ELISA）检测鼠疫F1抗原的敏感性和特异性。方法用GICA试纸条和DMcAbS-ELISA平行检测308份强毒鼠疫耶尔森菌感染鼠脏器标本和327份对照鼠标本,用RIHA微量法同时检测作为参照。结果327份对照鼠鼠疫细菌学检验及GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA的F1抗原检测均为阴性,GICA,DMcAbS-ELISA和RIHA在108cfu/mL水平上未发现与近缘假结核耶尔森菌有交叉反应;308只感染鼠样本细菌培养阳性284只,24只样本未分离到鼠疫菌;F1抗原检测GICA阳性287份,DM-cAbS-ELISA阳性280份,RIHA阳性276份,GICA阳性检出率最高93.19%,与DMcAbS-ELISA和RIHA比较,差异均有统计学意义（χ^2=5.14,9.09;P=0.016,0.001）;GICA与DMcAbS-ELISA符合率97.73%（Kappa=0.845）;GICA和DMcAbS-ELISA与RIHA符合率分别是96.43%和98.70%（Kappa=0.774,0.926）;284份细菌培养阳性鼠标本F1抗原检测GICA阳性率是98.59%,高于DMcAbS-ELISA和RIHA,差异有统计学意义（χ^2=4.17,5.14;P=0.031,0.016）;24份细菌培养阴性实验鼠标本F1抗原检测：GICA检出7份阳性,阳性率29.17%,DMcAbS-ELISA检出6份阳性,阳性率25%,RIHA检出3份阳性,阳性率12.5%,GICA高于DMcAbS-ELISA和RIHA,但差异无统计学意义（χ^2=2.25,0;P=0.125,1.000）。结论GICA检测鼠疫F1抗原敏感特异,快速简便,优于DMcAbS-ELISA和RIHA,是鼠疫快速诊断中有应用价值的检测技术。     

NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究

目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A TP5蛋白相互作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

鼠疫耶尔森氏菌F1抗原的表位预测

目的预测F1抗原的B细胞表位,为抗F1单克隆抗体的制备提供理论依据,探索适合我国鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)蛋白B细胞表位研究的可行性方案。方法采用EMBOSS网络平台以及DNAStar Protean软件分析F1蛋白的二级结构、可塑性、亲水性和抗原性指数等参数,进行B细胞表位的预测。结果F1蛋白的B细胞表位可能位于第106~132和141~155等区域内。结论预测结果为后续抗F1单克隆抗体的制备奠定一定理论基础,表位预测法有利于我国鼠疫菌B细胞表位研究平台的建立。     

鼠疫耶尔森菌F1抗原免疫Balb/c小鼠方法的研究

目的 观察鼠疫耶尔森菌F1抗原(F1Ag)单克隆抗体制备过程中,F1Ag免疫Balb/c小鼠的免疫剂量和方法,探索操作性强、用时短和免疫效果好的方法.方法 7～9周龄Balb/c小鼠48只,按体质量随机分成6组:150、100、50、25μg组(第1次接种为皮下多点注射,F1Ag分别为150、100、50、25μg,第2、3次接种分别为皮下多点注射和腹腔注射,F1Ag量均为100 μg)、皮下接种组(3次F1Ag接种均采用皮下多点注射,每次100 μg)、腹腔接种组(3次F1Ag接种均采用腹腔注射,每次100 μg),每组8只.首次免疫接种F1Ag+等量弗氏完全佐剂(CFA)的乳化剂;3周后第2次接种F1Ag+等量弗氏不完全佐剂(IFA)的乳化剂;1周后第3次接种F1Ag(不加佐剂);1周后取小鼠尾血,用双抗原夹心酶联免疫吸附试验(DAgS-ELISA)和间接血球凝集试验(IHA)微量法检测F1抗体.结果 不同剂量(150、100、50、25μg)组小鼠血清F1抗体效价(DAgS--ELISA法:G=12 173.87、13 440.37、15 024.19、4466.72;IHA微量法:G=19 972.32、18 089.40、23 170.47、4871.08)比较,差异有统计学意义(DAgS-ELISA法:F=3.11,P<0.05;IHA微量法:F=4.11,P<0.05).150、100、50 μg组小鼠血清F1抗体效价明显高于25μg组(DAgS-ELISA法:t值分别为2.18、2.39、2.73,P<0.05;IHA法:t值分别为2.54、2.73、3.13,P<0.05).不同接种途径条件下,皮下注射组、腹腔接种组、100μg组小鼠血清F1抗体效价呈渐次增高趋势(DAgS-ELISA法:G=8933.44、9986.16、13 440.37:IHA微量法:G=13 777.25、16 384.00、18 089.40),但差异无统计学意义(F值分别为0.66、0.25,P>0.05).结论 F1Ag免疫小鼠首次皮下多点注射50μg,加强免疫(腹腔注射)100μg,可以缩短整个免疫周期,免疫效果良好,抗体水平较高.     

鼠疫F1McAb酶免疫染色法快速检验鼠疫菌

为缩短检验鼠疫菌的时间 ,建立了酶免疫染色法检验鼠疫菌的方法 ,被检涂片标本用含过氧化物酶底物的固定液 ,固定标本同时 ,内源性过氧化物酶被消耗 ,辣根过氧化物酶标记鼠疫 F1单克隆抗体和鼠疫菌菌体表面的特异性 F1抗原结合 ,底物被酶催化生成有色沉淀物使鼠疫菌着色 ,用普通光学显微镜观察结果 ,常温 1h出结果 ,Kaplow法鼠疫菌被蓝色晶体覆盖 ,DAB法鼠疫菌呈棕黄色 ,不含 F1抗原的 8株细菌均为阴性 ,酶免疫染色法具有特异、快速、简便的特点 ,可用于鼠疫菌的快速检验