瑞香素类抗疟化合物的筛选及其靶分子研究

目的 通过体外试验和鼠疟动物模型筛选瑞香素结构衍生物的抗疟作用,确定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫抗疟作用的靶分子.主要研究内容及方法 (1)在瑞香素基本结构的基础上设计并合成瑞香素的结构衍生物;(2)通过光学显微镜镜检和微量荧光法两种体外筛选系统筛检瑞香素类衍生物对恶性疟原虫的体外抗疟作用;(3)对体外筛检抗疟活性高的化合物,采用WHO推荐的四天抑制试验测定其对鼠伯氏疟原虫(ANKA株)的抗疟作用;(4)以电子自旋共振法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶(ribonucleotide reductase,RNR)活性的影响;(5)采用紫外分光光度法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶(cytochrome c oxidase,COX)活性的影响;(6)对体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素、DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光PCR法测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫的重要生物功能酶,如RNR、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,L,DH)等基因表达的影响.结果 (1)在瑞香素结构的基础上,通过对7、8位羟基或相邻位点的修饰,共合成32种瑞香素结构衍生物.(2)通过体外筛选系统筛选出DA78与DA79两种新型的瑞香素类抗疟化合物,两者的IC50分别为7.6μmol/L、1.4μmoL/L,其体外抗疟活性与瑞香素的差别无统计学意义(P＞0.05);体内试验按D4减虫率评价,瑞香素、DA78与DA79灌胃给药在鼠伯氏疟原虫ANKA株感染小鼠中,DA79在1、10、50、75 ms/(kg·d)×4 d组与对照组1%西黄蓍胶相比较差异有统计学意义(P＜0.01),而DA78在50或75 mg/(kg·d)×4 d的抗疟作用与对照组相比较差异有统计学意义(P＜0.05);另外DA79在10或75 mg/(kg·d)×4 d的抗疟效果要优于同剂量的瑞香素(P＞0.05).(3)体外同步培养的恶性疟原虫经100μmol/L瑞香素2、4、8和12 h作用后,COX活性依次下降了0、6%、、73%和80%,在瑞香素浓度为100 nmoi/L、lμmoL/L、100 μmol/L与l mmol/L作用6 h后,COX活性依次下降了3%、31%、53%和84%(n=3),其活性随着瑞香素浓度的增高基本成线性降低,而当瑞香素的铁鳌合能力饱和后对COX活性的影响几乎消失;100 μmol/L DA78与DA79作用2、4、8和12 h后,COX的活性依次下降了0、2%、11%、9%与7%、13%、17%、32%,在DA78、DA79浓度为100 nmol/L、1 μmol/L、100 μmol/L与1 mmol/L作用6 h后,COX活性依次下降了0、0、4%、13%与1%、4%、15%、29%,其活性随着DA78或DA79浓度的增高基本成线性降低,其中DA79对COX的抑制作用高于DA78,但两者均低于瑞香素对COX的作用(n=3,P＜0.01).(4)体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素、DA78与DA79作用后.以电子自旋共振法测定不同时间恶性疟原虫酪氨酸的量以反映RNR的活性,经100 μmol/L瑞香素作用1、2、3和4 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的93%、49%、31%和25%,在瑞香素浓度为100 nmol/L、1 μmol/L、100 Vanol/L与1 mmoL/L作用6 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的97%、69%、42%和7%;RNR的活性随着瑞香素浓度的增高而降低,但并非呈线性相关.当瑞香索铁鳌合能力饱和后,恶性疟原虫RNR活性几乎未受影响(n=3,P＞0.05).经100μmot/L DA78与DA79作用1、2、3和4 h后,相对于对照组的值恶性疟原虫RNR的活性依次为其值的98%、96%、87%、71%与93%、44%、41%、23%,DA79对RNR活性的抑制作用高于同剂量相同作用时间DA78的作用(n=3,P＞0.01),DA79与瑞香素在体外对恶性疟原虫RNR抑制作用的差别无统计学意义(n=3,P＞0.05);在DA78与DA79浓度为100 nmol/L、1μmol/L、100μmol/L与1 mmol/L.,作用6 h后,相对于对照组的值RNR的活性依次为其值的100%、92%、64%、61%与97%、48%、25%、4%,DA79对RNR活性的抑制作用高于同剂量DA78的作用(n=3,P＜0.01),并且高于同剂量瑞香素对RNR活性的抑制作用(n=3,P＜0.05).(5)恶性疟原虫体外经瑞香素、DA78与DA79作用后,LDH、SOD与RNR 3种基因扩增的标准曲线,在105～109 copies/ml范围内标准曲线呈良好的线性关系,其基因扩增产物的标准曲线的r2依次为0.9907、0.9983、0.9975.根据标准曲线计算各组样品3种基因的原始拷贝数来比较各组3种基因表达量的差异,不同处理组对恶性疟原虫LDH基因的表达无显著性抑制作用(n=3,P＞0.05),而且各组间差异无统计学意义(n=3,P＞0.05);瑞香素、DA78与DA79对恶性疟原虫RNR基因的表达均有抑制作用;只有瑞香素对恶性疟原虫SOD基因表达产生抑制作用,其他各组无显著性抑制作用;但瑞香素的铁螯合能力饱和后,对上述3种基因的表达均未产生显著性抑制作用(n=3,P＞0.05).结论以DA78与DA79为代表的瑞香素类衍生物作为一类新型的抗疟化合物,在体外和体内试验中均显示出一定的抗疟活性;RNR很可能作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的靶分子.本研究首次发现两种瑞香素结构衍生物DA78与DA79具有与瑞香素同一水平的抗疟活性,为寻求更有效的抗疟化合物提供了方向,并利用分子生物学方法对瑞香素抗疟化合物抗疟作用的靶分子进行了筛选与研究,初步确定了RNR作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的靶标,为今后瑞香素类抗疟药物的进一步开发提供了理论依据.     

瑞香素杀疟原虫裂殖体的作用

[目的 ]研究中药瑞香素在体外和体内的杀裂殖体作用。 [方法 ]在恶性疟原虫FCCl株常规体外培养中测试瑞香素杀裂殖体活性 ,并按“四天抑制性试验”在感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠中测定不同剂量瑞香素的体内抗疟活性。 [结果 ]体外试验中瑞香素在 1～ 10 μmol L剂量范围内有明显杀灭裂殖体作用 ,而体内试验中按D4减虫率与感染鼠在 30d内的平均生存天数评价 ,5 0或 10 0mg kg .d- 1 × 4d瑞香素灌胃以及 10 ,5 0或 10 0mg kg.d- 1 × 4d瑞香素腹腔注射给药在伯氏鼠疟原虫ANKA株感染鼠中的抗疟作用与 10mg kg .d- 1 × 4d氯喹 (CQ)灌胃的疗效相似。 [结论 ]瑞香素在体外和体内均有一定的杀裂殖体作用。     

实时荧光定量PCR测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶基因表达的影响

目的测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫核糖核酸还原酶（RNR）基因表达的影响。方法体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素及其衍生物DA78与DA79作用后,抽提总RNA,并合成相应的特异性引物,运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测定瑞香素类抗疟化合物对恶性疟原虫RNR基因表达的影响。结果恶性疟原虫体外经瑞香素及其衍生物作用后的RNR基因扩增标准曲线在10^5～10^9拷贝（copies）/ml范围内呈良好的线性关系,R^2为0.997 52;瑞香素及其衍生物DA78与DA79对恶性疟原虫RNR作用后,其原始拷贝数分别为81 173.23、124 830.83和74 801.35,与对照组比较差异有统计学意义（P〈0.01）,而瑞香素的铁螯合能力被饱和后,对该基因的表达未产生显著抑制（P〉0.01）。结论瑞香素类抗疟化合物体外抑制恶性疟原虫RNR的基因表达,RNR可能作为瑞香素类抗疟化合物抗疟作用的候选靶分子之一。     

蒿甲醚与瑞香素伍用对感染伯氏疟原虫小鼠的治疗作用

目的　研究蒿甲醚与瑞香素伍用(A+D)对感染伯氏疟原虫ANKA株小鼠的疗效及其联合作用方式。　方法　按“四天抑制法”d0 感染,d0 ～d3 给药,每天1次,d4涂薄血膜检查,并计算d4减虫率及各药丰数有效置(ED50),用等效应图解法分析A+D的合并作用。　结果　蒿甲醚0.4mg/(kg·d)× 4d的d4减虫率与对照组相比差异无显著性 ;[A0 .4mg/(kg·d) +D7.7mg/(kg·d) ]× 4d的抗疟效果提高 ,与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。A+D各组的ED50均低于单用药组;不同配伍比例的R值皆大于0.4,小于2.7(0.4     

瑞香素体外抗疟作用与其铁螯合能力的关系

目的　研究瑞香素体外抗疟作用与其铁螯合能力的关系。　方法　在恶性疟原虫FCC1株常规方法体外培养中检测瑞香素和去铁胺杀裂殖体活性。利用荧光探针calcein测定瑞香素和去铁胺的铁螯合能力。　结果　与强铁螯合剂去铁胺相比 ,瑞香素具有中度的铁螯合能力。体外实验中瑞香素在 0～ 12 μmol/L剂量范围内有剂量依赖性的杀裂殖体活性。瑞香素与Fe2 + 按 2∶1混合后 ,抗疟作用明显下降。　结论　瑞香素的抗疟作用与它的铁螯合能力有关。     

瑞香素抗红外期疟原虫作用的研究

目的　研究瑞香素 (DPNT)抗红外期疟原虫的作用。方法　于ICR小鼠腹腔注射约氏疟原虫子孢子后 0 5h灌胃给药 ,连续 4d。不同剂量的DPNT及DPNT伍用伯氨喹 (PQ)的抗疟作用 ,分别以d7ICR小鼠阴性率及d1 1 或d1 2 ICR小鼠每千个红细胞被原虫感染数作评价 ,并观察DPNT对ICR小鼠血红蛋白浓度的影响。结果　DPNT的剂量范围为每天 10～ 10 0mg/kg ,连服 4d ,d7原虫阴性小鼠数及d1 1 红细胞被感染程度与对照组相比其差异均无显著性 ;DPNT每天 5 0mg/kg和每天PQ5mg/kg配伍组的d7小鼠阴性率与PQ每天 10mg/kg组相当。ICR小鼠DPNT每天 5 0mg/kg组与对照组血红蛋白浓度在d8天有差异。结论　DPNT单独用药 ,无明显抗红外期疟原虫作用 ,但DPNT每天 5 0mg/kg与PQ每天 5mg/kg伍用的抗疟效果与PQ每天 10mg/kg相当。DPNT在短期内可致小鼠贫血。     

瑞香素对体外培养恶性疟原虫超氧化物歧化酶活性及DNA合成的影响

目的研究瑞香素(DPNT)对体外培养恶性疟原虫超氧化物歧化酶(SOD)活性及DNA合成的影响。方法在恶性疟原虫FCC1株体外培养体系中,以SOD试剂盒检测瑞香素、瑞香素铁盐及去铁胺(DFO)对疟原虫SOD活性的影响。疟原虫培养同步化,利用荧光素Hoechest33258测定在瑞香素和去铁胺作用下疟原虫不同发育阶段(环状体和滋养体)的DNA合成水平。结果与未加药对照组比较,经瑞香素作用后疟原虫总SOD下降约60％(P<0.01),而相应的经去铁胺作用后,疟原虫的总SOD仅下降约22％(P>0.05)。瑞香素铁螯合能力被遮蔽后,几乎失去对疟原虫SOD的影响。同步培养的滋养体阶段疟原虫,在瑞香素作用下DNA合成率明显低于对照组。结论在体外瑞香素可显著降低疟原虫SOD活性,并影响滋养体阶段疟原虫的DNA合成。     

瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶及核糖核酸还原酶活性的影响

目的 体外测定瑞香素对恶性疟原虫细胞色素C氧化酶（COX）及核糖核酸还原酶（RNR）活性的影响。方法 Trager &; Jensen法体外培养恶性疟原虫FCC1/HN分离株，超声波破碎恶性疟原虫提取总蛋白，用紫外分光光度计检测瑞香素与瑞香素-Fe复合物在不同作用时间和不同作用浓度对恶性疟原虫COX活性的影响，以电子自旋共振法检测经瑞香素与瑞香素-Fe复合物作用1、2、3和4 h后，恶性疟原虫酪氨酸（Tyr）自由基的量以反映恶性疟原虫RNR的活性。 结果 体外同步培养的恶性疟原虫经瑞香素（100 μmol/L）作用2、4、8和12 h后，COX活性分别被抑制了0、6%、73%和80%；在瑞香素浓度为0.1、1、100和1 000 μmol/L，作用6 h后，COX活性分别被抑制3%、31%、53%和84%；而瑞香素-Fe复合物对COX的影响几乎消失。经瑞香素（100 μmol/L）作用1、2、3和4 h后RNR活性分别被抑制7%、51%、69%和75%；在瑞香素浓度为0.1、1、100和1 000 μmol/L，作用6 h后，RNR活性分别被抑制3%、31%、58%和93%；而瑞香素-Fe复合物作用6 h后RNR活性分别被抑制8%、6%、11%和9%。 结论 在体外瑞香素可显著降低恶性疟原虫的细胞色素C氧化酶（COX）及核糖核酸还原酶（RNR）活性。     

伯氏疟原虫氯喹抗性逆转的实验观察

目的 寻找伯氏疟原虫氯喹抗性逆转剂.方法 将健康昆明小鼠72只(雌、雄各半)每只腹腔注射0.2 ml伯氏疟原虫ANKA株氯喹敏感系(chloroquine sensitive,CS)或由其选育的高抗氯喹系(chloroquine resistance,CR),按下述随机分组后灌胃给药治疗,观察各组疗效.(1)小鼠感染CS疟原虫30 min后随机均分为4组,每组6只,给D-6182{(Z,Z)-N,N,N-三甲基-2,3-双[(1-氧代-9-十八碳烯酸)-氧代]-1-丙胺基盐酸盐|、C-2832[胆畄醇-3-N-(二甲胺基乙基)氨甲酸酯]、Ket(酮替酚)、0.1%西黄蓍胶(对照组),连续灌药5 d.于D1至D7每天每鼠取尾血涂片作常规镜检,确定各实验组的原虫血症.(2)小鼠感染CR疟原虫后第3天随机均分为8组,每组6只,给D-6182、C-2832、Ket组、氯喹组、0.1%西黄蓍胶对照组及给予D-6182、C-2832、Ket后2 h再加灌服小剂量12 mg/(kg·d)氯喹(5%ED90),连续5 d.每鼠于D4至D7每天取尾血涂片作常规镜检,确定各实验组的原虫血症,并计算各组的原虫减虫率.结果 (1)感染伯氏疟原虫CS株的小鼠,分别灌服80 mg/(kg·d)D-6182、120 mg/(kg·d)C-2832或10 mg/(kg·d)Ket连续5 d,各给药组与对照组小鼠的原虫感染率自D1至D4逐日上升,至D4达峰值,D5时对照组小鼠原虫感染率继续上升,而各给药组维持在D4的峰值水平.(2)感染伯氏疟原虫CR株的小鼠给适宜剂量的C-2832、D-6182或Ket后2 h加灌服小剂量氯喹12 mg/(kg·d)(5%ED90),此后连续5 d(D3-D7),于D4原虫减虫率可达到97.77%、99.28%或96.73%,而在D7可达到99.81%、98.87%或100.00%.结论 C-2832和D-6182两种化合物对伯氏疟原虫CR株感染小鼠的氯喹抗性具有逆转作用,其逆转能力与Ket相当.     

瑞香素体外抗卡氏肺孢子虫作用的初步研究

目的研究瑞香素在体外抗卡氏肺孢子虫(Pneumocystiscarinii,Pc)的作用。方法建立Wistar大鼠卡氏肺孢子虫肺炎模型;分离、纯化虫体,进行体外培养。测定不同浓度的瑞香素体外抗Pc的作用,观察经FeSO4、MgSO4螯合后的瑞香素对虫体的生长影响情况。用透射电镜观察药物处理后的虫体超微结构改变。结果瑞香素抗Pc作用效应在1～20μmol/L浓度范围呈剂量依赖和时间依赖关系。10μmol/L瑞香素与1.0μg/ml喷他脒对Pc生长影响效果相当。若预先将瑞香素与FeSO4按21比例混合后,瑞香素对Pc的生长抑制作用大大减弱。瑞香素处理后的虫体的超微结构有改变。结论瑞香素在体外对Pc生长有抑制作用。     

青少年高血压的研究进展

随着人们生活和行为方式的改变,高血压发病明显呈年轻化趋势。在青少年时期识别高血压病高危人群有助于早期进行有效干预和治疗,降低未来高血压的发生率及其严重性。现试从青少年高血压的诊断、发病因素、特点、治疗策略等方面的研究进展作一综述。     

Morbidity in cardiovascular diseases in immigrants in Sweden

INTRODUCTION: Although immigration to Sweden has increased in the last few decades, the incidence rates of cardiovascular disease and coronary heart disease in immigrants are unknown. The aim of the present study is to estimate whether place of birth affects the incidence rates of cardiovascular disease and coronary heart disease. MATERIAL AND METHODS: The study was designed as a follow-up study on morbidity in cardiovascular disease and coronary heart disease between 1 January 1997 and 31 December 1998, including three and a half million persons with age range 35-64 years, of whom 550 000 were born abroad, from the database MigMed consisting of the whole Swedish population. Incidence rates and relative risks were estimated by indirect standardization and a proportional hazard model. RESULTS: The age-adjusted risk of coronary heart disease was higher in most foreign-born groups than in Swedes. For example, in nine of 12 male groups, the relative risks varied between 1.1 and 2.2, and in seven of 12 female groups, the relative risks varied between 1.4 and 2.5. When also adjusting for level of education and employment status, the risks were still high, but on a lower level. CONCLUSIONS: Foreign-born people possess an over-risk of cardiovascular or coronary heart disease(CVD/CHD) compared with Swedish-born persons, also when level of education and employment status are taken into account.     

C·肉毒杀鼠素(冻干剂)应用研究

目的为研究C·肉毒杀鼠索对杀灭达乌尔黄鼠(简称黄鼠)的大面积应用情况和对家畜、家禽的毒害作用,进行了C·肉毒杀鼠素的应用研究.方法大面积投毒采用ES-2药饵撒播机[1],间隔约80m进行条投.羊、鸡采用直接灌胃.结果大面积应用的灭鼠率为83.72%.对羊、鸡最高剂量分别为500万MLD、150万MLD,均未出现中毒现象.结论 C·肉毒杀鼠素是较为理想的草原大面积杀灭黄鼠的理想、首选药物.     

Pulmonary sporotrichosis in Oklahoma in susceptibilities in vitro

Six cases of pulmonary sporotichosis were observed in 2 institutions in Oklahoma City, Okla. Three of the patients were treated with iodides with or without surgery. Although one patient required a second course of iodides, the patients have remained well after at least 34 months of follow-up. Three patients treated with amphotericin B, single course as well as multiple courses, and other antifungal agents (hydroxystilbamidine and miconazole) have all relapsed. These cases and a reviewed of more than 40 cases of pulmonary sporotrichosis susceptibilities of Sporothrix schenckii that we observed in vitro suggest that amphotericin B is not an effective agent for the treatment of pulmonary sporotrichosis. It is our opinion that the treatment of choice for pulmonary sporotrichosis is a supersaturated solution of potassium iodide. If the patient is allergic to the medication or fails to respond, then a combination of amphotericin B plus flucytosine may be tried.