茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10-7nmol/L,在10-1~10-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关(P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关(P>0.05)。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达

摘要：目的：建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。 方法：设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。 结果：建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病（P<0.05）,而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降（P<0.05）。 结论：SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类风湿关节炎患者血清miR-146a的表达及意义

目的用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测类风湿关节炎(RA)患者血清miR-146a的表达水平,探讨其在RA诊断中的意义。方法以U6为内参照,用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测RA患者48例(活动期30例、缓解期18例)、骨性关节炎(OA)患者22例和体检健康者25例血清miR-146a的表达水平,并进行ROC曲线分析;对各组进行红细胞沉降率(ESR)检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测结果表明,活动期RA患者血清miR-146a水平为(2.42±0.75),显著高于缓解期RA患者(1.66±0.29)、OA患者(1.12±0.43)和体检健康者(1.01±0.34),差异均有统计学意义(P均0.05);miR-146a诊断活动期RA的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.914(95%CI:0.872~0.926);以1.96为cut off值,敏感性为95.0%、特异性为87.5%、准确性为91.9%。活动期RA组ESR为(37.5±5.2)mm/h,缓解期RA组为(14.4±4.7)mm/h,OA组为(11.6±5.1)mm/h,健康对照组为(9.6±3.9)mm/h,各组间差异有统计学意义(F=177.01,P0.01)。结论建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可用于RA患者血清miR-146a的检测。miR-146a可用于诊断活动期RA。     

SYBR Green实时定量PCR检测胰腺癌中HIF1α、VEGF和bFGF的表达及其临床意义

目的:研究胰腺癌及癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA的表达情况及其临床意义。方法:利用实时荧光定量聚合酶链反应技术对22例胰腺癌细胞及其对应的癌旁组织中HIF-1α、VEGF和bFGFmRNA进行定量检测,并分析其与临床病理特点之间的关系。结果:统计结果显示HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中的表达高于癌旁组织(P<0.01),相关性分析显示肿瘤组织中HIF-lα表达与VEGF、bFGF表达呈显著正相关(P<0.01)。HIF-1α表达与肿瘤大小和淋巴结转移显著相关(P<0.01),与TNM分期有关(P<0.05),与性别、年龄无相关性,VEGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关(P<0.05),bFGF高表达与肿瘤大小、淋巴转移淋巴转移相关(P<0.05),而与TNM分期、性别及年龄无相关性。结论:HIF-1α、VEGF和bFGF在胰腺癌中存在高表达,HIF-1α表达与TNM分期、肿瘤大小和淋巴转移相关,VEGF和bFGF表达与肿瘤大小和淋巴转移相关。实时荧光定量PCR检测HIF-1α、VEGF和bFGF对评估胰腺癌患者预后可能有一定的价值,也为胰腺癌的治疗提供了治疗靶点。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5&#177;0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5&#177;0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

实时荧光定量检测中引物二聚体的优化

实时定量检测中引物二聚体的存在会严重影响检测结果的准确性,本文提出多方面的优化策略,以减少或消除实时定量检测中引物二聚体的集聚。     

SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium,MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插入序列IS1311为检测靶标设计引物,在60℃的退火温度下,建立鉴定MA的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA,检测限为5.6×10-2 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列IS1311为基础建立的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。     

poly(A)加尾的实时荧光定量PCR检测血清miR-124a表达及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清微小RNA(miR)-124a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-124aploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,定量血清中miR-124a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-124a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.999),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-124a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-124a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12

目的 建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，对1份已知HLA—DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA—DRB1*12位点检测和分型。结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析，有3份标本为DRB1*12，产物用离心柱纯化后，直接进行DNA测序，结果证实为DRB1*12阳性。结论 SYBR Green Ⅰ PCR操作简便，结果准确，可成为一种HLA基因分型的新方法。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。     

实时荧光定量RT—PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域，本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题，以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的 建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值.方法 应用SYBR GreenⅠ作为荧光染料,以GAPDH作为内对照,建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法,并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测.结果 56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为1.07±2.99,阳性表达率为66.1%(37/56),30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性,表达水平为0.13±0.07,阳性表达率为6.7%(2/30),30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性;结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化(P＞0.05),但在Dukes C+D期表达水平(1.73±2.15)及表达阳性率82.8%(24/29)均显著高于Dukes A+B期表达水平(0.39±0.87)及表达阳性率48.1%(13/27)(P＜0.01).结论 该FQ-PCR方法简便、特异、可靠;检测外周血CEA mRNA表达水平,对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性,可提高早期结直肠癌诊断符合率;在发生转移的Dukes C+D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A+B期,可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一,动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值.     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR方法检测白血病患者RbAp46基因的表达

目的探讨白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.方法建立实时定量RT-PCR方法,利用SYBR Green Ⅰ染料检测140例急性白血病(AL)、13例慢性粒细胞白血病(CML)慢性期和7例CML急变期患者以及32例非白血病患者骨髓细胞RbAp46基因的表达水平.结果初诊与复发AL患者骨髓中RbAp46基因表达水平的M估计值分别为178.23和213.65,明显高于完全缓解组和对照组(分别为85.89和88.08);CML慢性期组M估计值为58.27,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),而CML急变期组M估计值为173.24,明显高于CML慢性期组和对照组.98例初诊AL中除M2、M4亚型M估计值(62.63,130.67)与对照组相比差异无统计学意义外,余均明显高于对照组.初诊AL中RbAp46基因表达水平与bcr/abl、PML-RARα、mdrl基因的表达无相关性,但与WT1基因的表达水平呈正相关,与AML1/ETO融合基因表达呈负相关.结论RbAp46在AL初诊、复发及CML急变期患者骨髓细胞中高表达,可能参与白血病的发生.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量方法检测结直肠癌患者外周血CEA-mRNA表达研究

目的建立检测CEA mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（VQ-PCR）方法，探讨外周血CEA mRNA表达在结直肠癌患者中的应用价值。方法应用SYBR Green J作为荧光染料，以GAPDH作为内对照，建立检测CEA mRNA的FQ-PCR方法，并对56例结直肠癌患者外周血中CEA mRNA的表达水平进行了检测。结果56例结直肠癌患者中有33例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为1．07±2．99，阳性表达率为66．1％（37／56），30例结直肠良性疾病患者中有2例外周血CEA mRNA表达为阳性，表达水平为0．13±0．07，阳性表达率为6．7％（2／30），30例健康成人外周血CEA mRNA表达均为阴性；结直肠癌患者外周血CEA mRNA在不同病理分化程度中表达水平无明显变化（P〉0．05），但在Dukes C＋D期表达水平（1．73±2．15）及表达阳性率82．8％（24／29）均显著高于Dukes A＋B期表达水平（0．39±0．87）及表达阳性率48．1％（13／27）（P〈0．01）。结论该VQ-PCR方法简便、特异、可靠；检测外周血CEA mRNA表达水平，对诊断结直肠肿瘤病变比血清CEA蛋白具有更高的敏感性，可提高早期结直肠癌诊断符合率；在发生转移的Dukes C＋D期其表达水平及表达阳性率均显著高于未发生转移的Dukes A＋B期，可作为鉴别结直肠癌患者发生微转移的有力证据之一，动态观察其水平变化对判断结直肠癌患者的预后有重要价值。     

SYBR Green实时定量PCR检测SDF-1α基因在乳腺癌中的表达

目的 探讨SDF-1α基因在人乳腺癌中的表达及其与肿瘤恶性程度之间的关系.方法 SYBR Green实时定量PCR方法定量检测SDF-1α mRNA在63例乳腺癌（TNM分期：I期9例,IIA期25例,IIB期13例,IIIA期16例）和20例正常乳腺组织中的表达;采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验等分析SDF-1α mRNA表达在不同临床参数间的表达差异.结果 乳腺癌中SDF-1α mRNA表达水平（1.41±1.18）低于正常乳腺组织（2.02±0.71）,P=0.031.SDF-1α mRNA在乳腺癌中表达下调与淋巴结转移数目（〉3个腋窝淋巴结转移）、ER表达情况（0,1＋,2＋）密切相关（P值分别为0.017、0.047）.但SDF-1α mRNA在不同年龄、绝经情况、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及其他免疫组化指标（PR、Her-2、p53和Ki-67）组间的差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论 趋化因子SDF-1α表达下调参与乳腺癌的转移,有望成为乳腺癌治疗的新靶点.     

乙型肝炎病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的 建立SYBR Green I实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法 根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR Green I实时荧光定量PCR检出限范围为5×10²copies/ml～5×10⁸copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

RT-PCR与SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒的比较

目的:比较RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒(JEV)的敏感性、特异性和时效性.方法:采用RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法对连续10倍稀释的JEV核酸样品平行检测,比较两种方法的敏感性.同时以登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸进行两种方法的特异性测试.结果:SYBRGreen Ⅰ实时RT-PCR方法可检测出 40 copies/μL的核酸分子水平,与普通RT-PCR方法相比,敏感度提高了10倍,检测时间节省2 h.两种检测方法在检测JEV方面,与登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸均无交叉反应.结论:与普通RT-PCR相比,SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR是一种更敏感、快速检测JEV的方法.     

实时荧光定量RT-PCR技术在疾病相关mRNA定量检测方面的应用进展

实时荧光定量逆转录多聚酶联反应（RT—PCR）技术作为一项高度敏感、程序结束无需后处理和可高通量检测的新型技术已广泛用于基因表达的定量检测。为了更好地将这一技术应用于临床研究的各领域,本文就荧光定量RT—PCR检测基因表达的原理、绝对定量与相对定量的区别、实时荧光定量RT-PCR技术检测核糖核酸（mRNA）存在的几个问题,以及目前该技术在临床研究方面的应用进展作一综述。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。