豚鼠耳蜗一氧化氮合酶异型体的定位

目的研究一氧化氮合酶(NOS)的异型体在豚鼠耳蜗的定位分布,以探讨一氧化氮(NO)在内耳听觉生理和病理生理机制中的作用。方法使用特异性NOS异型体抗体,采用ABC免疫组化染色法,观察NOS异型体在正常豚鼠耳蜗的定位表达。结果NOS Ⅰ主要分布在内骨膜、螺旋神经节的核周体、螺旋韧带和Corti's器的细胞。NOSⅢ是耳蜗的主要NOS异型体免疫染色,其主要免疫染色分布于耳蜗神经、螺旋神经节核周体、螺旋韧带和耳蜗毛细血管球的内皮细胞,也见于Corti's器的细胞和神经纤维。NOS Ⅱ在正常豚鼠耳蜗内不表达。 结论结构型NOS(cNOS)表达在耳蜗的多个部位,表明NO参与内耳的正常生理功能,包括神经突触的神经传导、耳蜗血流的调节和耳蜗的骨代谢。     

一氧化氮合酶和心钠素在豚鼠耳蜗的分布

目的 观察豚鼠耳蜗局部心钠素（atral natruretc peptde，ANP）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）免疫组化反应产物的分布，为研究ANP和NOS在豚鼠耳蜗局部血流、淋巴以及神经调节中的相互作用提供形态学依据。方法 采用免疫组织化学双标法检测ANP和NOS在正常豚鼠耳蜗的分布特征。结果 在耳蜗各转螺旋动脉和血管纹．螺旋缘、螺旋韧带和Corti器显示双阳性染色，螺旋神经节细胞及囊斑神经上皮细胞膜及轴突NOS阳性染色，胞质ANP阳性染色；盖膜、前庭膜阴性染色。结论 ANP和NOS在内耳血 流调节，内、外淋巴平衡调节以及神经信号传递等方面可能具有重要作用，二者之间可能存在密切的相互作用机制，其分布特点与功能密切相关。     

实验性微栓塞缺血豚鼠耳蜗cNOS的表达变化

目的 探究一氧化氮（nitricoxide，NO）在一过性微栓塞耳蜗缺血性损伤中的作用。方法 20只豚鼠随机分为实验组和对照组各10只，实验组动物通过磁微粒栓塞造成实验性耳蜗缺血模型；以扫描电镜观察缺血耳蜗听纤毛变化；以免疫组织化学方法观察原生型一氧化氮合酶（constitutive nitric oxide synthase，cNOS）在两组耳蜗的表达变化。结果 实验性耳蜗缺血造成内外毛细胞听纤毛散在的粘结、倒伏或缺失，内毛细胞听纤毛病变明显；内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）表达分布于蜗轴及内侧螺旋板内神经纤维、螺旋神经节、内侧螺旋缘、Corti器细胞及血管纹／螺旋韧带区；神经型一氧化氮合酶（neuron NOS，nNOS）主要分布于蜗轴及内侧螺旋板内神经纤维、螺旋神经节细胞，在Corti器细胞、血管纹细胞及内侧螺旋缘上皮细胞有较弱的表达；实验性缺血组豚鼠耳蜗与正常对照组耳蜗原生型一氧化氮合酶的表达无差异。结论 微栓塞耳蜗缺血引起散在听毛细胞损伤；两种原生型NOS在耳蜗固有表达，分布有交叉，功能存在相互代偿，但未发现因微栓塞缺血而引起变化。     

正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义

目的检测正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白（aquaporins,AQPs）的表达,探讨其机理和意义。方法 20只健康豚鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组（膜迷路积水模型组）豚鼠腹腔注射醋酸去氨加压素,4μg·kg-1·d-1,共1周,诱导其内耳膜迷路积水,对照组豚鼠腹腔注射等量生理盐水。用免疫组化方法检测两组豚鼠内耳水通道蛋白的表达,并进行比较。结果对照组豚鼠内耳中有AQP0、1、2、3、5、7、8的表达,其中AQP0仅在血管纹和螺旋神经节细胞有较弱的表达;AQP1分布于包绕骨迷路、内淋巴囊、内淋巴管的纤维细胞,基底膜鼓阶面细胞、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘纤维细胞、Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、椭圆囊壁、球囊壁、螺旋神经节等;AQP2表达在血管纹、Corti’s器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中;AQP3、7、8三者的分布类似,在螺旋神经节和包绕膜迷路的组织中表达,包括Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘、椭圆囊壁、球囊壁、内淋巴囊等;AQP5则表达在Corti’s器、内外螺旋沟、螺旋神经节、螺旋韧带纤维细胞。实验组豚鼠内耳中,血管纹AQP2的表达与对照组较正常豚鼠表达增加,其它亚型AQPs的表达与对照组无明显差异。结论正常豚鼠内耳中有多种AQPs表达,膜迷路积水后豚鼠内耳中AQP2的表达增强,提示膜迷路积水可能与AQP2表达上调有关。     

正常豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义

目的：检测正常豚鼠内耳组织中水通道蛋白（aquaporins,AQPs）的表达,探讨其在内耳液体平衡中的意义.方法：用免疫组织化学方法,以兔抗大鼠AQP0、1、2、3、5、7、8的多克隆抗体,检测正常豚鼠内耳组织中水通道蛋白亚型0、1、2、3、5、7、8的表达.结果：水通道蛋白亚型0、1、2、3、5、7、8在豚鼠内耳有不同程度、不同模式的表达,其中AQP0仅在血管纹上皮细胞、螺旋神经节细胞有较弱的表达,AQP1的分布见于包绕骨迷路、内淋巴囊、内淋巴管的纤维细胞,基底膜鼓阶面细胞、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘纤维细胞、Corti器、内外螺旋沟、血管纹、椭圆囊壁、球囊壁、螺旋神经节细胞等.AQP2表达在血管纹、Corti器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中.AQP3、7、8的分布类似,在螺旋神经节和包绕膜迷路的组织中均有表达,其中Corti器、内外螺旋沟、血管纹、螺旋神经节表达较强,在螺旋韧带、螺旋缘纤维细胞表达较弱.AQP5则在Corti器、内外螺旋沟、螺旋神经节细胞表达较强,在螺旋韧带纤维细胞表达稍弱.结论：在正常豚鼠内耳中,尤其是膜迷路中有多种水通道蛋白亚型,以不同的方式表达,他们可能在维持膜迷路液体平衡中起着协同作用.     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl-2和Bax的表达情况。方法选用雌性白色豚鼠16只，随机分为实验组和对照组各8只，以钥孔蛾血蓝蛋白全身免疫后，实验组以相同抗原进行内耳免疫，对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水，在内耳免疫7d后处死动物，取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)检测内耳凋亡细胞，免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl-2和Bax的表达。结果透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变，而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞，血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞，TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征，对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性，而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达，FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl-2蛋白表达阴性，对照组的Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bcl-2蛋白表达阳性。实验组Corti器、侧壁和螺旋神经节细胞Bax蛋白表达阳性，对照组只有螺旋神经节细胞Bax蛋白表达弱阳性，Corti器、侧壁表达阴性。结论内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生，Fas-FasL是此过程的信号转导途径之一，Bcl-2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

豚鼠耳蜗和内淋巴囊上皮钠通道的表达

目的 研究豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)α、β、γ亚基的表达及其意义.方法 用兔抗大鼠ENaC α、β和γ亚基的多克隆抗体,采用免疫组化SP法观察豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中α、β、γ-ENaC的表达模式.另用α-ENaC cDNA质粒合成探针,原位杂交法检测豚鼠耳蜗和内淋巴囊组织中α-ENaC mRNA的表达.结果 免疫组化显示,在豚鼠耳蜗中,α-ENaC蛋白强烈表达于螺旋缘,而螺旋韧带、Corti器、Reissner膜等处的表达较弱;β-ENaC蛋白在螺旋韧带、螺旋缘和螺旋神经节、Corti器、Reissner膜等处的表达均呈弱阳性;γ-ENaC蛋白则在螺旋韧带的上半部、螺旋缘和螺旋神经节等处的表达呈强阳性,Corti器、Reissner膜等处也有阳性表达.三个亚基在血管纹中均呈阴性表达.在内淋巴囊中,α、β和γ亚基均较明显地表达于上皮细胞和上皮下纤维组织.原位杂交显示,α-ENaC mRNA除了表达于螺旋缘、螺旋韧带下部外,还表达于血管纹,而在内淋巴囊的上皮细胞和上皮下纤维组织也均呈阳性表达.结论 ENaC的各个亚基以不同的模式分布于豚鼠耳蜗和内淋巴囊的各个区域,形成功能性通道参与内淋巴的调节,从而保持内耳内环境的稳定.     

卡那霉素耳中毒后豚鼠耳蜗热休克蛋白的表达

目的　观察卡那霉素对热休克蛋白 70 (HSP70 )在豚鼠耳蜗中表达的影响。方法　取听力正常豚鼠随机分为实验组和对照组各 5只 ,分别给予 2 5 0mg·kg-1·d-1卡那霉素和生理盐水肌注 ,10天后处死。左耳铺片 ,右耳石蜡包埋切片。用免疫组织化学方法检测各组石蜡切片HSP70表达情况 ,通过计算机图像分析系统分析HSP70表达强度。结果　对照组中Corti器、血管纹、螺旋韧带、内螺旋缘、螺旋神经节HSP70表达呈弱阳性 ;耳蜗铺片显示内 ,外毛细胞正常。实验组中Corti器、血管纹、螺旋韧带、内螺旋缘HSP70表达呈强阳性 ,而在螺旋神经节呈弱阳性 ;耳蜗铺片显示外毛细胞大部分缺损。结论　卡那霉素能够诱导HSP70在豚鼠耳蜗中表达     

水通道蛋白-1,3在豚鼠耳蜗及内淋巴囊的表达

目的:检测水通道蛋白(AQP)-1,3在豚鼠耳蜗及内淋巴囊中的表达情况。方法:运用免疫组织化学二步法及免疫荧光染色检测豚鼠耳蜗及内淋巴囊中AQP-1,3的表达。结果:AQP-1主要表达于耳蜗螺旋韧带基底部、Corti器基底膜及鼓阶内侧上皮面及内淋巴囊上皮细胞下的基质组织中;AQP-3主要表达于血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节细胞及内淋巴囊的上皮细胞及其下的基质成分中。结论:AQP-1,3在豚鼠耳蜗及内淋巴囊中存在广泛表达,但其功能仍未明确。     

豚鼠corti器和脑干下部听觉通路CGRP的免疫组化定位研究

采用ABC-葡萄糖氧化酶-DAB-镍(ABC-GDN)免疫组化技术研究了降钙素基因相关肽免疫反应(CGRP-IR)在豚鼠Corti器和脑干下部听觉通路的分布,发现内、外毛细胞区均可见大量的阳性神经末梢,后者越向顶转、越向外排毛细胞越少。螺旋神经节内可见阳性神经束,而神经节细胞呈阴性反应。耳蜗背侧和腹侧核内有CGRP-IR阳性纤维;内侧和外侧上橄榄核均有CGRP-IR阳性神经元胞体。结果提示Corti器含CGRP神经为耳蜗传出神经,CGRP可能参与神经信息的传递。     

内耳免疫反应中细胞凋亡的研究

目的　探讨内耳免疫反应过程是否引起细胞凋亡以及Fas和FasL、Bcl 2和Bax的表达情况。方法　选用雌性白色豚鼠 16只 ,随机分为实验组和对照组各 8只 ,以钥孔血蓝蛋白全身免疫后 ,实验组以相同抗原进行内耳免疫 ,对照组内耳注射等量的磷酸盐缓冲生理盐水 ,在内耳免疫 7d后处死动物 ,取内耳免疫侧耳蜗做石蜡切片。通过电镜和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术 (terminal deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling ,TUNEL)检测内耳凋亡细胞 ,免疫组化检测内耳Fas和FasL以及Bcl 2和Bax的表达。结果　透射电镜观察发现实验组术后7d内耳外毛细胞、血管纹细胞及螺旋神经节细胞都出现了凋亡细胞的特征性改变 ,而对照组未发现具有上述特征的细胞。实验组内耳Corti器毛细胞 ,血管纹的缘细胞和螺旋神经节细胞存在TUNEL染色阳性细胞 ,TUNEL染色阳性细胞具有凋亡细胞的典型形态学特征 ,对照组内耳的任何结构中都没发现TUNEL染色阳性细胞。免疫组化染色实验组Corti器、螺旋神经节细胞、血管纹和螺旋韧带Fas和FasL蛋白表达阳性 ,而对照组只有螺旋神经节细胞和血管纹有较弱的Fas蛋白表达 ,FasL蛋白表达阴性。实验组Corti器、螺旋神经节细胞、侧壁Bcl 2蛋白表达阴性 ,对照组的Corti器、侧壁和     

Dot1l在正常豚鼠耳蜗中的表达

目的研究组蛋白H3K79甲基化转移酶Dot1l在豚鼠耳蜗中的表达情况。方法将6只听力正常的豚鼠取材,运用免疫组织化学技术检测Dot1l在豚鼠耳蜗各转中的表达差异。结果 Dot1l表达于豚鼠耳蜗的血管纹、螺旋韧带、前庭膜、螺旋神经节、Corti器、螺旋缘、外螺旋沟细胞,在螺旋韧带的表达由底转向顶转减少(F=8.29,P=0.0091),在螺旋神经节中的表达由底转向顶转逐渐增多(F=6.22,P=0.0201),差异具有统计学意义。结论:豚鼠耳蜗中存在与ENa C表达相关的组蛋白H3K79甲基化转移酶Dot1l,其可能参与内淋巴循环。     

重组杆状病毒载体介导新生大鼠耳蜗Corti器体外模型基因转染研究

目的建立新生大鼠耳蜗Corti器体外培养模型,探讨重组杆状病毒作为内耳基因转染载体的可行性及其转染特点。方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,建立新生大鼠耳蜗Corti器体外模型,加入携带报告基因的病毒悬液,观察外源基因表达情况。结果耳蜗Corti器体外培养48小时后,培养组织生长良好。Bac-GFP联合丁酸钠可以高效转染毛细胞和螺旋神经节细胞,同时并没有改变Corti器的正常结构。结论新生大鼠离体内耳组织转基因培养法是内耳基因治疗实验研究的一种可行方法。杆状病毒可以在体外高效、安全、快速的转染毛细胞和螺旋神经节细胞,有希望成为内耳基因治疗的新型载体。     

去氨加压素对耳蜗功能及上皮钠通道表达的调节作用

目的研究去氨加压素DDAVP调节豚鼠耳蜗功能及上皮钠通道蛋白α亚基(α-ENaC)的表达,探讨其在内淋巴积水中的作用。方法将24只豚鼠随机分为3组,分别给予0、5、10天DDAVP,通过耳蜗电图(ECochG)检测耳蜗功能学改变。应用苏木素-伊红染色(HE)确定各组耳蜗组织形态学改变,并用免疫组化法确定α-ENaC蛋白在耳蜗定位表达。采用蛋白印迹实验(WesternBlot)分别检测不同给药时间豚鼠耳蜗α-ENaC蛋白表达水平。结果DDAVP注射后,ECochG提示部分豚鼠耳蜗出现内淋巴积水,HE证实豚鼠内淋巴积水。α-ENaC蛋白在耳蜗血管纹、螺旋韧带、Reissner膜、Corti器、螺旋缘、螺旋神经、耳蜗神经表达。与未给予DDAVP相比,10天组豚鼠耳蜗α-ENaC蛋白表达升高(P<0.05);。结论 DDAVP调节豚鼠耳蜗α-ENaC蛋白表达升高,进而调节内淋巴代谢,诱导内淋巴积水,影响内耳功能。     

重组腺病毒构建及转染培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的实验研究

目的构建携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,观察GFP基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的表达。方法通过细菌内同源重组方法构建携带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（Ad-GFP）,观察重组腺病毒转染培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,不同时间内绿色荧光蛋白基因的表达情况、表达部位及病毒对培养耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确;荧光显微镜下观察腺病毒转染体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞后,12 h即开始表达绿色荧光蛋白基因,24 h达到高峰,表达时间可持续1周;倒置显微镜观察转染后的Corti器和螺旋神经节细胞形态结构及生长无明显改变。结论本实验成功构建了携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组腺病毒,通过该方法构建的腺病毒可以介导绿色荧光蛋白（GFP）基因在体外培养的新生大鼠耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞中表达,但腺病毒本身对体外培养的耳蜗Corti器和螺旋神经节细胞生长无明显影响,为通过腺病毒进行内耳基因治疗提供了理论依据。     

豚鼠内耳Na,K-ATP酶α亚基异构体的表达

目的 研究豚鼠内耳组织中Na，K-ATP酶α亚基三种异构体αl、α2、α3的表达及其意义。方法 用小鼠抗大鼠Na，K-ATP酶α亚基异构体特异性单克隆抗体，采用免疫组化SP法观察豚鼠耳蜗、半规管、椭圆囊及球囊组织中Na，K—ATP酶α亚基三种异构体的表达模式。结果 αl亚基异构体广泛分布于内耳组织的各个部位，特别是上皮细胞和螺旋神经节细胞中，α2和α3亚基异构体则主要分布于螺旋神经节细胞、Corti器及血管纹。结论 Na，K—ATP酶亚基异构体在内耳不同部位的表达差异表明不同的内耳细胞转运Na^ 和K^ 的能力不同，它们共同作用参与保持内耳内环境的稳定。     

豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤时IκBα的表达

目的探讨豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤时IκBα变化。方法经颅底径路建立豚鼠椎基底动脉缺血再灌注耳蜗损伤模型,采用石蜡包埋免疫组织化学染色光学显微镜下观察IκBα在耳蜗组织中的表达。结果正常对照组螺旋神经节、血管纹和Corti’s器的细胞浆内可见IκBα强阳性表达。缺血再灌注后各组上述部位表达减弱,再灌注24h最弱,48h及7d的表达有所增强。着色部位主要在胞浆,再灌注24h后可见胞核内亦有表达。正常组与缺血再灌注各组比较灰度值有统计学意义（P〈0．01）。结论耳蜗缺血再灌注损伤时可能存在IκBα的降解和核转位。     

听力学

930486谷氨酸免疫反应在豚鼠低位听觉传人径路上的分布/乔莉…尹中华耳鼻咽喉科杂志一2992,27(增刊)一30~31 采用免疫细胞化学ABC法显示豚鼠Corti器、螺旋神经节及耳蜗核谷氨酸免疫反应(Gl-utamate immunoreaetivity,Glu一IR)。结果发现,正常豚鼠耳蜗各回均可见Glu一IR阳性产物,呈蓝黑色,主要分布在内毛细胞底部,阳性的神经纤维数量较多,粗细不一,膨体不明显,纤维与内毛细胞关系密切。蜗轴四回螺旋神经节(SG)内,均可见Glu一IR阳性的细胞,呈圆形及椭圆形,有大、小两种,并可见由胞体发出的突起。豚鼠耳蜗腹侧核及背侧核均可见Glu一IR…     

水通道蛋白-2在大鼠内耳的定位及其意义

目的：探讨水通道蛋白-2(Aqp-2)在大鼠内耳中的定位，分析其在内耳水代谢中的作用机制。方法：使用正常成年SD大鼠15只，制备颞骨组织标本，采用SP免疫组织化学技术，检测Aqp-2蛋白在大鼠内耳的表达情况。结果：Aqp-2在大鼠的内淋巴囊、血管纹、螺旋神经节有较强表达，在Corti器、基底膜、螺旋缘的前庭唇和鼓唇、盖膜、螺旋凸也有表达。结论：Aqp-2主要分布在与内淋巴代谢有关的结构(内淋巴囊和血管纹)，它在Corti器的表达为膜迷路积水时伴有的听力下降提供了又一解释；Aqp-2在螺旋神经节的表达，提示它可能与正常听觉的维持有关。     

NF-κB p65在豚鼠内耳的表达与分布

目的观察NF-κB p65(nuclear factor-kappa B p65,NF-κB p65)在正常豚鼠内耳的表达与分布.方法健康杂色豚鼠6只,取耳蜗和内淋巴囊组织,石蜡包埋切片,用大鼠NF-κB p65单克隆抗体行免疫组织化学 (SABC法) 常规染色,以正常豚鼠肾脏组织作阳性对照.结果在正常豚鼠内耳中,NF-κB p65主要表达于螺旋韧带和内淋巴囊及其周围组织.细胞内定位主要在胞浆内,仅个别细胞胞核有NF-κB p65表达. 结论螺旋韧带和内淋巴囊在正常情况下含有较多的NF-κB,提示螺旋韧带和内淋巴囊重要的功能之一是产生和分泌细胞因子,它们可能是调控内耳炎性反应的"中枢"部位.