血管活性肠肽对人脐血CD34+细胞增殖分化的影响

目的 探索血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide,VIP)对造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)增殖分化的影响及其可能机制.方法 采用免疫磁珠分选技术纯化人脐血CD34 细胞;VIP孵育人CD34 细胞后,通过体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;流式细胞术检测细胞表面CD13、CD14、CD71、CD41、CD19、CD4/CD8、CD33、CD34等抗原;生物分子相互作用系统检测人CD34 细胞VIP受体;RT-PCR分析其受体亚型.结果 在1×10-7～1×10-12mol/L浓度范围内,VIP抑制人CD34 细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与VIP浓度呈正相关(r=0.925,P＜0.01).VIP(1×10-8mol/L)作用于人CD34 细胞14 d后,粒系(CD13 蓝色)及单核系(CD14 )细胞百分比均明显下降(P＜0.05).VIP增加人CD34 细胞的CD34抗原表达(P＜0.05).VIP作用后CD34 细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加(P＜0.05);人脐血CD34 细胞表达VIPⅠ型受体.结论 VIP通过人脐血CD34 细胞上VIPⅠ型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34 细胞的增殖、维持其干细胞特性,阻止其向粒、单系细胞分化.     

生长抑素对人脐血CD34+细胞增殖能力的影响

目的 探索生长抑素(SST)对造血干/祖细胞增殖能力的影响以及可能机制.方法 采用免疫磁珠分选技术纯化人脐血CD34+细胞;SST孵育人CD34+细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT-PCR分析其受体亚型.结果 在1×10-5～1×10-10mol/L浓度范围内,SST抑制人CD34+细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关(r=0.903,P＜0.01).SST使CD34+细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加(P＜0.05);人脐血CD34+细胞表达SST-3型受体.结论 SST通过人脐血CD34+细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34+细胞的增殖,维持其干细胞特性.     

脐血CD34+细胞巨核系定向诱导分化的研究

目的研究TPO与SCF、IL-11协同在体外促进入脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的效应.方法利用流式细胞仪分离纯化脐血CD34+细胞,在含血清液体培养体系中、细胞因子诱导下培养14 d.采用流式细胞术测定不同时间点培养体系中CD41+细胞的比例;同时采用甲基纤维素半固体集落培养测定CFU-MK的数量.结果经14 d培养,TPO+SCF+IL-11组可使CD41+细胞和CFU-MK数量分别扩增40.83±12.41倍、7.86±2.63倍,明显高于TPO组的28.69±8.27倍、4.48±1.25倍.结论在体外SCF和IL-11可以协同增强TPO诱导脐血CD34+细胞向巨核系增殖分化的作用.     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34 细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型。方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34 单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34 和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达。结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小。CD34 细胞培养3d后有明显集落形成,7d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构。经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%。免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达。而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态。结论MACS法分离脐血CD34 细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达。     

脐血CD34+细胞向内皮细胞定向诱导分化的实验研究

目的探讨人脐血CD34+细胞体外分离、纯化、诱导扩增和分化为内皮细胞的可行性,并检测其表型.方法采集新鲜脐血经抗凝处理及无菌包装,Ficoll密度梯度离心法得单个核细胞,磁珠分选方法(MACS)分离出CD34+单个核细胞,M-199培养基中诱导分化,细胞形态学观察CD34+和CD34-细胞生长情况,流式细胞仪检测内皮细胞CD31表型,免疫组化验证蛋白水平表达.结果细胞形态学观察发现,刚分离的CD34+ 和CD34-单个核细胞呈圆形,形态小.CD34+细胞培养3 d后有明显集落形成,7 d后呈梭行细胞,出现典型线样排列结构.经诱导培养后,内皮细胞表型CD31阳性率为(70.03±10.27)%.免疫组化染色证实了内皮特异性成分ecNOS和flk-1/KDR蛋白水平的表达.而CD34-细胞单独培养,少部分细胞贴壁,呈现出不规则形态.结论 MACS法分离脐血CD34+细胞,体外诱导扩增和分化后贴壁细胞具有内皮细胞形态,通过流式细胞仪和免疫组化验证了贴壁细胞中大部分细胞具有内皮系标志物表达.     

冷应激大鼠血浆及回肠P物质和VIP的变化

采用放免法对冷束缚应激大鼠血浆及回肠始段P物质 (SP)、血管活性肠肽 (VIP)进行测定。发现与正常对照组相比 ,应激组回肠段SP含量无明显改变 ,VIP含量降低 (P <0 .0 5 ) ;应激组血浆中SP质量浓度明显增加 (P <0 .0 1 ) ,VIP质量浓度则明显降低 (P <0 .0 1 )。提示 :应激组大鼠回肠始段及血浆SP、VIP的改变 ,可能与其胃肠功能变化的调节有关。     

脐血CD34+细胞高效分选技术的建立及应用

CD34+细胞包括造血干细胞和早期的祖细胞,在造血干细胞移植、体外扩增培养及基因治疗等方面都有广泛的应用,但其仅占正常成人外周血的0.05%～0.2%、骨髓的0.5%～3%和脐血的0.1%～0.5%,因此CD34+细胞分选技术越来越重要.通过长时期的摸索,本实验室建立了一套高效的脐血CD34+细胞分选富集技术,并成功地分选了180份脐血样本.     

实验性脾虚证平滑肌细胞VIP受体信号传导障碍

[目的]以血管活性肠肽 (VIP)受体为研究对象,在胃肠肽平滑肌细胞受体 (信号接收系统)水平测定实验性脾气虚证大鼠胃肠动力紊乱的信号传导障碍以及香砂六君子汤治疗机制。[方法]逆转录聚和酶链反应 (RT-PCR)法测定胃、空肠和降结肠的VIP两种受体VIPR1和VIPR2mRNA的分布及半定量分析。[结果]在胃窦部,仅有VIPR2表达。与对照组相比,脾气虚组VIPR2mRNA含量降低;治疗组VIPR2含量明显升高。在空肠和降结肠,各组VIPR1和VIPR2均有表达,各组VIPR1mRNA含量均明显高于VIPR2。脾气虚组VIPR1、VIPR2mR NA含量低于对照组;治疗组VIPR1、VIPR2mRNA含量明显高于自然恢复组。[结论]VIP受体在胃肠道不同部位的分布差异可能与脾气虚所致胃与肠道肠动力紊乱表现的截然不同有一定关系,香砂六君子汤在大鼠实验性脾气虚胃肠肽受体水平的异常有调理作用机制之一。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响

目的 探讨人脐带间充质干细胞对脐血CD34~+细胞在NOD/SCID小鼠体内造血重建的影响.方法 将3.5×10~5个脐血CD34~+细胞单独(单移植组)或与5.0×10~6个人脐带间充质干细胞共同(共移植组)输入经~(137)Cs 3.0Gy照射后的NOD/SCID小鼠体内,观察移植后6周内小鼠外周血象的变化情况.于移植后第6周处死小鼠,采用流式细胞术检测小鼠骨髓、脾脏及外周血人源细胞(hCD45~+)含量,并分别检测小鼠骨髓中人源淋巴系(CD3/CD19)、粒系(CD33)、单核系(CD14)、血小板(CD61)、红系(CD235a)等各系血细胞比例,比较间充质干细胞共移植对CD34~+细胞植入率的影响.结果 移植后3周,两组小鼠外周血象开始有不同程度恢复;移植后6周,共移植组外周血白细胞和血小板计数均已达高峰,明显高于单移植组(P<0.05),两组小鼠的红细胞计数差异无统计学意义(P>0.05).移植后6周,共移植组骨髓及外周血中人源细胞hCD45~+CD34~+比例分别为(42.66±2.57)%和(4.74±1.02)%,明显高于单移植组的(25.27±1.67)%和(1.19±0.54)%(P=0.006).移植后6周,共移植组小鼠骨髓内的CD19~+、CD33~+、CD14~+、CD61~+和CD235a~+细胞比例均明显高于单移植组(P<0.05),CD3~+T淋巴细胞比例明显低于单移植组(P=0.003);CD19~+B淋巴细胞得到优势扩增,明显高于其他各系血细胞比例(P<0.05).结论 脐带间充质干细胞与脐血CD34~+细胞共移植可促进造血干细胞的植入,缩短CD34~+细胞移植后造血恢复时间.     

人脐血源肝干/祖细胞体外定向诱导分化

目的 研究具有多分化潜能的脐血单个核细胞,定向诱导分化成肝干／祖细胞的可能性。方法 采集32份足月分娩后的新鲜脐带血,密度梯度离心法分离出单个核细胞,随即分为两组：①对照组8份脐血：培养液中无细胞因子;②实验组24份脐血,随机分为4组,分别在培养的当天、7、14、21天进行实验测定：培养液中加入细胞因子SCF、OSM、HGF、LIF、FGF-1、FGF-2;观察细胞形态学的变化,lit—PCR定量测定hALBmRNA,细胞免疫化学检测ALB、CK18、CK19的表达。结果 观察到实验组中培养的细胞数目随培养时间的延长逐渐增多,体积增大,折光性增强的形态学变化,RT-PCR检测到hALB mRNA表达逐渐增强,细胞免疫化学显示CK18、CK19、ALB呈阳性表达。结论 脐血单个核细胞在定向诱导下有分化为肝干／祖细胞的能力,可以考虑作为肝干／祖细胞和肝细胞新的细胞来源。     

人外周血单核细胞和脐血CD34+细胞来源的树突细胞比较

目的比较从人外周血单核细胞及脐血CD34+细胞诱导树突细胞(DC)的方法及其特性.方法用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞,贴壁法获得单核细胞;经GM-CSF及IL-4诱导获得DC.磁性活化细胞分选系统(MACS)分选脐血CD34+细胞,以GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等细胞因子诱导获得DC.用电镜、普通显微镜观察DC形态;流式细胞仪分析DC表型;同种混合淋巴细胞反应(allo-MLR)观察DC刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果外周血单核细胞在因子GM-CSF、IL-4、TNF-α,脐血CD34+细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α、SCF、FL、TPO等因子作用下,可生成DC,并表达相应的DC分化抗原CD14、CD80、CD83、CD86、HLA-DR.脐血CD34+细胞具有较强的扩增能力,经2周诱导,体系细胞数可增加173.8士26.7倍,两种来源的DC均能刺激同种异体淋巴细胞的增殖反应.结论外周血单核细胞与脐血CD34+细胞,在体外均可诱导成DC,并具有相应的DC分化抗原和功能.     

脐血CD34^＋细胞分离方法比较

目的：比较不同方法分离脐血单个核细胞（MNC）及纯化CD34＋细胞效果。方法：采集脐血48份，在室温下保存12、24、48小时，分别用密度离心法和羟乙基淀粉（HES）沉淀法分离脐血MNC，再用免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞，以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果：脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34^＋细胞数最多．其次为12小时，在24小时分离所得最低（P〈0．05）；HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34^＋细胞数明显增多（P〈0．05）；6组细胞存活率差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞可达（88±5）％的纯度。结论：HES沉淀法优于密度离心法，且48小时分离为优，免疫磁珠法纯化CD34＋细胞可提高纯度：各种方法对细胞存活率无明显影响。     

人骨髓间充质干细胞对脐血干细胞体外扩增支持作用的研究

目的：探讨以人骨髓间充质干细胞(bone nlarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(cord blood stem cells，CBSC)，研究BM—MSC支持造血的功能，以能最终用于临床。方法：用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、fit3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G—CSF)的无血清培养液，比较有或无MSC条件下，体外扩增脐血CD34^ 细胞两周后检测总细胞TC、CD34^ 细胞、集落形成单位(CFU)和长期培养-起始细胞(LTC—IC)增加倍数。结果：在TPO、FL、SCF、和G-CSF的作用下，经两周体外扩增后有MSC组的TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C和LTC—IC数较起始分别增加了427、39、125、104和16倍。单纯用上述4种细胞因子的无MSC组，TC、CD34^ 细胞、CFU—GM、CFU—C数分别增加了62、11、25、24倍，但LTC-IC只有扩增前的0．8倍。结论：以人BM—MSC为基质的无血清体外培养体系可以更有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值。     

低温冷冻对脐血CD＋34细胞和造血祖细胞增殖的影响

采用－８０℃低温冷冻法,观察冷冻前及冷冻后１、２、３周时单个核细胞（ＭＮＣ）的回收率,脐血造血前体细胞在体外的增殖力,并用流式细胞仪检测ＣＤ３４＋细胞的百分率。旨在探讨低温冷冻对脐血造血前体细胞的影响。结果表明：脐血冷冻后１、２、３周时ＭＮＣ的回收率分别为９３．６％,９１．５％和９０．７％（Ｐ＞０．０５）;细胞活力分别为９８％,９７％,９５％和９１％（Ｐ＞０．０５）;ＣＤ３４＋细胞依次为１．２０％、１．１８％、１．１６％和１．１７％;ＣＦＵ－ＧＭ,ＣＦＵ－Ｅ冷冻后１、２周时回收率达９７％和９５％（Ｐ＞０．０５）,第３周时达８９％（Ｐ＞０．０５）。结果提示：长期冷冻可能导致冷冻之脐血祖细胞产率下降,但对代表造血干细胞的ＣＤ３４＋细胞影响则不大。     

多种细胞因子组合对脐血干/祖细胞体外扩增的影响

目的　探讨在体外培养液中不同细胞因子组合对脐血 CD34+ 细胞的扩增作用以及扩增后的 CD34+ 细胞的造血功能。方法　用 FL、SCF、TPO、IL - 3、TL - 6组合成不同的实验组 ,对脐血中分离纯化的 CD34+ 细胞经 6d的短期体外扩增 ,扩增后经流式细胞仪分析 ,L TC- IC、祖细胞集落群计数 ,从而求得较好的细胞因子组合组。结果CD34+ 细胞扩增倍数为 3 .1～ 8.6倍 ,16份脐血 CD34+ 细胞数达到 10× 10 6 以上的细胞总数 ;扩增的 CD34+ 细胞再造血功能与原始 CD34+ 细胞无显著差异。FL是扩增组合中不可缺少的细胞因子 ,同时还证实 TPO与其他细胞因子组合有扩增 CD34+ 细胞的作用 ,但单独使用 TPO稍长时间会使 CD34+ 细胞过多向巨核细胞分化。结论　 FST3 6细胞因子组合能使部份单位体积的脐血 CD34+细胞体外扩增达一定数量 ,为干细胞移植于成人提供了一定的实验依据与方法     

体外培养与扩增对脐血CD34+细胞及HLA抗原表达的影响

采用免疫组织化学方法．观察脐血细胞体外培养与扩增前后ＣＤ３４~＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达。结果表明：脐血ＣＤ３４~＋细胞的百分比以及ＨＬＡ抗原的表达于体外培养前后无显著性变化（Ｐ＞０．０５）,而在细胞因子的联合作用下,经一定时间的扩增后,ＣＤ３４~＋细胞百分比下降（Ｐ＜０．０１）,ＨＬＡ抗原的表达有一定程度的提高。提示：体外扩增对脐血ＣＤ３４~＋细胞的比例以及ＨＬＡ抗原的表达有一定的影响,而未加细胞因子的体外直接培养则不产生明显影响。     

间充质干细胞及其培养上清与融冻产物对脐血CD34+ 细胞扩增及分化的作用

 【目的】 探讨人骨髓间充质干细胞(MSC)及其培养上清&#65380;融冻产物对脐血CD34+ 细胞扩增及分化的作用&#65377;【方法】 分离纯化人骨髓MSC,收集纯化三代的MSC培养上清,采用反复冻融法获得MSC融冻产物,采用免疫磁珠分选系统纯化脐血CD34+ 细胞&#65377;实验分为4组,分别为含MSC滋养层组&#65380;MSC上清组&#65380;MSC融冻产物组及单纯造血生长因子(HGFs)对照组&#65377;流式细胞仪检测人脐血CD34+ 细胞在这四种培养体系中第6天和第12天有核细胞数及CD34+&#65380;CD34+CD38-&#65380;CD41+&#65380;CD19+&#65380;CD3+ 细胞含量&#65377; 【结果】 ①MSC滋养层组对脐血有核细胞和对脐血CD34+&#65380;CD34+ CD38- 的扩增能力最强,MSC培养上清组和MSC滋养层相比具有类似的作用,但其作用强度减弱(P < 0.05)&#65377;②MSC培养上清和MSC均具有抑制脐血CD34+ 细胞分化为CD3+ 和CD19+ 细胞的作用,差异无显著性(P > 0.05)&#65377;③MSC培养上清和MSC均具有促进脐血CD34+ 细胞向CD41+ 细胞分化的作用,MSC滋养层的作用强于MSC培养上清(P < 0.05)&#65377;④MSC融冻产物已完全丧失对脐血CD34+ 细胞扩增和分化作用,与单纯因子对照组相似(P > 0.05)&#65377;【结论】 MSC培养上清对脐血CD34+&#65380;CD34+ CD38- 细胞均具有扩增作用,而且可促进脐血CD34+ 细胞向CD41+ 细胞分化&#65377;