HIV衣壳蛋白P24在临床检测中的研究进展

本文就HIV衣壳蛋白P24的生物学特性、免疫反应．检测手段、临床应用及疫苗研究进展等方面进行了阐述,分析了P24蛋白在对HIV研究中的作用及其优缺点。     

miR-137过表达慢病毒的包装和鉴定

目的：构建miR-137过表达慢病毒载体并进一步包装慢病毒,探讨miR-137在HEK293T细胞中的感染效率和表达水平。方法：化学合成miR-137序列并克隆到慢病毒载体GV209,得到并鉴定含有目的片段的重组质粒,采用Lipofectamine 2000共转miR-137重组质粒与慢病毒辅助包装质粒到HEK293T细胞中生产慢病毒。以感染复数（MOI）值为40感染HEK293T细胞48h后,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达,采用荧光定量PCR法检测HEK293T细胞中miR-137的表达水平。结果：测序结果,目的基因序列与GenBank公布的miR-137基因序列完全一致。在感染的HEK293T细胞中观察到GFP的表达。过表达慢病毒感染细胞中miR-137表达水平是对照细胞的12.74倍。结论：成功包装miR-137过表达慢病毒,并可高效感染HEK293T细胞。     

HEK293T细胞扩增重组腺病毒研究

目的探讨HEK293T细胞扩增重组腺病毒的可行性。方法重组腺病毒保存液稀释后感染HEK293T细胞,观察细胞病变效应,半数组织培养感染量测定扩增病毒的滴度,通过体外感染心肌细胞,成纤维细胞验证其感染活性。结果HEK293T细胞可以扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒,病毒滴度为5×10^6PFU/mL,扩增后的腺病毒可以感染体外培养的心肌细胞和成纤维细胞。结论HEK293T细胞可有效扩增带有绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒。     

HIV早期感染诊断及其对预防的重要意义

HIV抗体检测技术是发现HIV感染者的常规实验室诊断技术。然而,抗体检测不能发现HIV感染至抗体阳转这一早期感染阶段,此阶段感染者体内会出现高病毒血症和高抗原血症,具有极强的传染性。因此,开展HIV早期感染检测具有极其重要的临床意义。现就HIV早期感染检测技术进展以及该技术在血液安全,HIV感染早期干预、治疗以及估计发病率中的应用情况作一综述。     

HIV-1中国流行株假病毒的建立及其初步应用

目的构建中国境内携带荧光素酶报告基因的B、B′C及AE亚型的HIV-1假病毒,研究该假病毒在检测病毒嗜性及中和抗体试验中的初步应用,为HIV-1的研究搭建一个方便、快捷且安全的平台。方法通过RT-PCR将3种亚型膜蛋白全长扩增,转化到表达质粒,构建膜蛋白质粒,与HIV骨架质粒共转染293T细胞,获得假病毒颗粒。假病毒感染GHOST细胞后,通过测定荧光值(RLU)来确定假病毒的感染效率、辅助受体使用情况及评价中和抗体作用。结果携带荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒感染CD4+CCR5+CXCR4+GHOST细胞后,经检测被感染细胞的荧光值显著大于阴性对照组,证明假病毒能够在体外有效地感染GHOST细胞;利用辅助受体抑制剂方法确定了假病毒毒株的嗜性;假病毒感染GHOST细胞可被同亚型血清中和作用所抑制,抑制率随血清稀释度增加而减小。结论获得了携带荧光素酶报告基因的HIV-1假病毒,并初步证实了该假病毒可应用于病毒嗜性及中和抗体试验。     

EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

目的:分别构建EGFP、DsRed1与CIDE-3的融合基因真核表达载体,观察其在人胚肾上皮细胞293T中的表达,确定CIDE-3的亚细胞定位. 方法:分别以质粒pEGFP-C3、pDsRed 1-N1及本实验室克隆得到的质粒pET28a( )-CIDE-3为模板,PCR扩增EGFP、DsRed 1 DNA片段及人CIDE-3基因的CDS序列,再分别将EGFP、CIDE-3及DsRed 1、CIDE-3 克隆人真核表达载体pShuttle-CMV中.酶切、测序鉴定后,经磷酸钙转染人293T细胞,通过荧光显微镜观察其在293T细胞中的表达,并利用荧光染料Bodipy 493/503定位脂滴,探讨CIDE-3与脂滴之间的关系.结果:酶切及DNA测序证实,重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3构建成功.荧光显微镜观察显示,pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3融合蛋白定位于细胞质,pShuttle-CMV-DsRed 1-CIDE-3融合蛋白也定位于细胞质,并与脂滴存在共定位关系. 结论:成功构建了重组质粒pShuttle-CMV-EGFP-CIDE-3和pShutde-CMV-DsRed 1-CIDE-3;两者均可在239T细胞中表达,融合蛋白分布于细胞质,并与脂滴存在共定位关系.     

S1P1真核表达载体的构建及在HEK293细胞膜上的表达

目的构建含人Ⅰ型1-磷酸鞘氨醇受体(SIPI)-全长cDNA序列及HA和/或EGFP标签的真核表达载体,并观察其在HEK293细胞上的表达。方法合成2条HA寡核苷酸,克隆入S1P1-Myc-EGFP-N1载体。以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,用PCR的方法扩增HA-S1P1并克隆入pcDNA3.1(+)载体。限制性酶切消化、PCR、测序的方法鉴定,载体经Polyfect转染入HEK293细胞。G418筛选出稳定细胞株。用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测S1P1在HEK293细胞上的表达。结果限制性酶切消化、PCR、测序结果证实载体构建成功。S1P1表达在HEK293稳定细胞株的表面。结论成功构建带有HA和/或EGFP标签的S1P1真核表达载体,表面表达S1P1的HEK293稳定细胞株可作为我们进一步研究的细胞模型。     

真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Asc12的构建及表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2,并在真核细胞HEK293T细胞中表达,为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础.方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因,连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中,构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒.通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染.Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况.结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法,证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达.结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒,并能在HEK293T细胞中表达,为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础.     

人源GRK2的真核表达、纯化及活性检测

目的 构建人源G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)真核表达系统。方法 设计引物,以pIRES-EGFP-GRK2(全长)基因为模板,PCR扩增His-GRK2目的基因,将His-GRK2目的基因连接在pcDNA3.1-EGFP真核表达载体上;将pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2质粒转染至HEK 293T细胞,48 h后采用Western blot法检测GRK2蛋白表达,通过镍螯合的磁珠法纯化GRK2蛋白,考马斯亮蓝染色和Western blot法检测GRK2蛋白纯化,His pull down检测GRK2蛋白活性。结果 双酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-EGFP-His-GRK2真核表达质粒成功构建;Western blot法检测结果表明,GRK2蛋白的分子量约为80 ku,提示GRK2蛋白在HEK 293T细胞中成功表达(t=6.433,P=0.003);通过镍螯合的磁珠纯化得到GRK2蛋白,His pull down实验结果表明GRK2与前列腺素E2受体4亚型(EP4)结合,提示GRK2蛋白具有生物学活性(t=13.5,P=0.000 2)。结论 pcDNA3.1-...     

RNA干扰作用于HIV-1vpr基因的筛选实验研究

目的 筛选鉴定针对HlV-1vpr基因的小干扰RNA（siRNA）片段。方法 根据siRNA设计要求合成siRNA56、siRNA160和siRNA185寡核苷酸片段,分别转染至含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,并进行总RNA提取,采用Real-timePCR和Westernblotting分别从核酸和蛋白水平对HIV-1vpr基因表达水平进行验证。结果 siRNAs成功转染含HIV-1vpr质粒的HEK293T细胞,降低了HIV-1vpr基因的表达水平,其中在RNA水平siRNA160组干扰抑制作用最强,抑制率为89%;在蛋白水平siRNA56组干扰抑制作用最强,抑制率为96%。结论 3个基因片段的siRNA均可以下调HIV-1vpr的表达水平,但存在差异性,为探索HIV/AIDS基因治疗的可行性和高效性提供了可靠的实验依据。     

苦艾对伯氏疟原虫的抗疟实验研究

目的观察苦艾对感染伯氏疟原虫小鼠的疗效。方法按“四天抑制法”的d0感染，d0～d3给药，每天1次，d4涂薄血膜检查，并计算每天存活率及d4减虫率。结果不同浓度苦艾组疟鼠累积生存率与对照组比较，0、30g／ml组与0．45g／ml组差异有统计学意义（P〈0．05）；苦艾（0．30g／ml和0．45g／ml）组的d4减虫率与对照组相比差异有显著性；苦艾（0．15g／ml）组的d4减虫率与对照组相比差异无显著性。结论苦艾（0．30g／ml与0．45g／ml）能较好抑制伯氏疟原虫的生长，对小鼠的存活状况有改善作用。     

不同材质导尿管对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响研究

目的研究不同材质导尿管对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响及不同物理方法对不同生长时期生物膜的清除效应.方法体外用平板法,经过7d孵育在4种导尿管材质膜片上均培养出生物膜模型.采用乳胶镀膜、硅胶镀膜、纯硅胶和红橡胶等不同材质导尿管的膜片制备铜绿假单胞菌生物膜,通过菌落计数法了解粘附于导尿管材生物膜内细菌菌落数量与材质的关系;用冲洗、冲洗 涡旋振荡、冲洗 超声振荡3种方法处理附有不同生长时期生物膜的导尿管,通过菌落计数法了解3种方法对不同生长时期生物膜的清除效应.结果以乳胶镀膜和硅胶镀膜所分离出的生物膜内细菌最多,分别为1.91×107CFU/cm3和1.20×107CFU/cm3;以纯硅胶上所分离的生物膜内细菌最少,菌落数为2.7×105CFU/m3,红橡胶上所分离的菌落数稍高于纯硅胶,为6.5×106CFU/cm3,四者两两比较,均有统计学差异(P＜0.001).不同处理方法结果表明,在生物膜形成的初期(2d),3种处理方法具有相同清除效应;但当生物膜趋于成熟后,单用冲洗方法难于将粘附细菌洗脱下来,3种方法的效应强弱顺序为:冲洗 超声＞冲洗 涡旋振荡＞冲洗.结论不同材质导尿管与铜绿假单胞菌形成生物膜的数量有一定关系,以纯硅胶和红橡胶尿管形成的生物膜数量较少,而乳胶镀膜和硅胶镀膜尿管形成生物膜数量较多.在生物膜形成初期,对导尿管一般冲洗能较彻底地清除粘附细菌.     

肝螺杆菌感染对BALB/c小鼠免疫应答干扰的初步研究

[摘要] 目的 探讨肝螺杆菌（Helicobacter hepaticus,H.hepaticus）感染对小鼠骨髓源树突状细胞（DC）表面分子形态和机体免疫应答的干扰。方法 以H.hepaticus（ATCC 51450）灌饲SPF级BALB/c雄性小鼠,于末次接种后5个月体外分离培养骨髓DC,经粒细胞-单核细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素-4（IL-4）,刺激DC增殖、分化,流式细胞仪分析DC细胞表面分子CD11c、CD40、CD80、MHCII的表达率。此基础上,用新城疫病毒（NDV）ZJ1株人工接种实验组和对照组小鼠,每周测定NDV血清抗体效价,比较抗体产生的差异。结果 实验组MHC II和CD40分子的表达率高于对照组。NDV抗体水平第1周实验组略低于对照组;第2至第5周内实验组小鼠的抗体水平均高于对照组,差异有显著性;第6周两组小鼠血清抗体均呈下降趋势,差异无显著性。结论 H.hepaticus感染对小鼠骨髓DC成熟有促进作用,能提高MHC II和CD40表达水平,可促进BALB/c小鼠产生抗NDV的抗体水平。     

环孢霉素A对缺血再灌注心肌的保护作用与CD4+T细胞的关系

目的 观察环孢霉素A对缺血再灌注心肌的影响,并探讨其与CD4+T细胞之间的关系.方法 将32只SD大鼠随机分为4组(n=8): 假手术组(Sham)、缺血再灌注(I/R)模型组、环孢霉素(CsA)组、CsA+5-羟基葵酸盐(5-HD)组.CsA、CsA+5-HD组给予CsA 15 mg/kg及1 mL生理盐水腹腔注射,...