甲基化抑制剂5-杂氮胞苷对T淋巴细胞株程序性死亡受体-1基因启动子区域甲基化水平及其表达的影响

目的:以T淋巴细胞株Molt-4细胞为模型,探讨甲基化抑制剂5-杂氮胞苷(5-azacytidine,5-Zac)对淋巴细胞表面程序性死亡受体-1(programmed death receptor 1,PD-1)基因启动子的去甲基化作用及其诱导的PD-1基因表达的改变,并进一步研究去甲基化作用与PD-1基因表达之间的...     

5-杂氮胞苷对成人T淋巴细胞穿孔素基因启动子区域甲基化水平的影响

目的：研究DNA低甲基化对穿孔素基因mRNA和蛋白表达的影响。方法：密度梯度离心分离正常成人的外周血淋巴细胞，磁珠分离CD4和CD8细胞后进行细胞培养，DNA甲基化抑制剂5-杂氮胞苷（5-azaC）处理。分别提取DNA、RNA和蛋白质。亚硫酸氢钠处理DNA，巢式PCR进行扩增、转化入大肠杆菌，挑取克隆测序。实时定量逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测穿孔素mRNA的表达，Western印迹检测穿孔素蛋白量的变化。结果：5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞穿孔素mRNA和蛋白表达显著高于未处理的CD4和CD8细胞组（P〈0．05）。测序结果显示5-azaC处理后的CD4细胞和CD8细胞DNA穿孔素启动子区域的甲基化水平降低，与未处理的CD4和CD8细胞组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论：5-azaC处理后CD4和CD8细胞穿孔素mRNA的表达和蛋白的表达都有显著的增高，这种增高与CD4和CD8细胞穿孔素基因启动子区域出现的低甲基化有关。     

甲基化抑制剂5-氮杂胞苷对HL-60细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系HL-60的增殖抑制作用,探讨其对细胞周期、细胞凋亡的影响.方法:常规方法培养HL-60细胞,加入不同浓度的5-氮杂胞苷,以MTT法测定对HL-60的抑制作用,计算细胞生长抑制率;流式细胞术检测小剂量5-氮杂胞苷处理HL-60细胞后48 h的细胞凋亡率及细胞周期分布特点.结果:不同浓度5-氮杂胞苷均可以不同程度的抑制细胞生长,且表现为时间、浓度依赖性.在小剂量浓度5-氮杂胞苷处理HL-60细胞48 h后,随着5-氮杂胞苷浓度的增加,凋亡细胞百分比逐渐增多(P<0.05);G1期细胞逐渐增多,S期细胞减少,G2/M期细胞相对增多,细胞阻滞在G1期.结论:5-氮杂胞苷对髓系白细胞细胞系HL-60的生长抑制表现为浓度和时间依赖性,一定剂量的5-氮杂胞苷诱导细胞凋亡,使细胞阻滞在G1期.     

5-氮杂胞苷对Eca109细胞增殖及RUNX3基因表达的影响

目的 探讨去甲基化制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)干预对Eca109细胞增殖及其抑癌基因RUNX3表达的影响.方法 应用MTT法来观察5-azaC对Eca109细胞增殖的抑制能力;采用10 μmol/L、20 μmol/L和50 μmol/L 3种不同浓度的5-azaC处理Eca109细胞株,采用MSP检测干预前后RUNX3基因启动子区的甲基化状况;应用RT-PCR、Western blotting检测干预前后RUNX3基因的mRNA和蛋白表达水平的变化.结果 Eca109细胞RUNX3基因启动子区处于异常的高甲基化状态,经5-azaC处理后,高甲基化的RUNX3基因启动子部分去甲基化;处理前启动子高甲基化的RUNX3基因其mRNA或蛋白均不表达,去甲基化处理后能重新激活该基因表达,经3种不同浓度5-azaC处理后,Eca109细胞生长减慢.结论 启动子区高甲基化是食管癌Eca-109细胞RUNX3基因失活的主要原因之一, 5-azaC能逆转RUNX3基因甲基化状态, 从而调控RUNX3基因表达并抑制细胞生长.     

5-氮杂胞苷对胃癌裸鼠移植瘤死亡受体DR4和DR5表达的影响

[目的]研究5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对胃癌裸鼠移植瘤中死亡受体4(DR4)和死亡受体5(DR5)表达的影响.[方法]利用RT-PCR方法检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠移植瘤内DR4和DR5的RNA表达水平、用MS-PCR检测5-Aza-CdR处理后的胃癌裸鼠抑制瘤内DR4和DR5启动子区甲基化水平.[结果]5-Aza-CdR能够抑制胃癌裸鼠移植瘤的生长.5-Aza-CdR能够逆转胃癌裸鼠移植瘤中DR4和DR5的启动子甲基化水平,并上调DR4和DR5的表达水平.[结论]去甲基化药物5-Aza-CdR能够抑制裸鼠胃癌移植瘤生长,提示该药物有治疗作用且能够诱导DR4和DR5的启动子区去甲基化从而使DR4和DR5的表达水平升高.     

5氮杂胞苷对HT29细胞DLC-1基因表达和细胞增殖活性的影响

目的探讨去甲基化药物5氮杂胞苷对肠癌细胞系HT29的DLC1基因表达和细胞增殖活性的影响。方法使用浓度为5μmol·L-1和10μmol·L-1的去甲基化药物5氮杂胞苷处理HT29细胞,通过MTT实验观察细胞增殖活性的差异,RTPCR技术检测DLC1mRNA表达强度的变化。结果经药物处理后,HT29细胞的增殖活性受到抑制,DLC1mRNA的表达明显增强。结论HT29细胞DLC1mRNA的表达下调可能是由于启动子区域高甲基化所致,DLC1基因具有抑制肿瘤细胞生长的功能,其可能参与了结肠癌的发病机制。     

5-氮杂胞苷对HL60细胞P16、DAPK及MGMT基因甲基化状态影响

目的：通过检测5-氮杂胞苷作用于急性早幼粒细胞白血病细胞系（HL60）细胞前后P16、死亡相关蛋白激酶（Death associated protein kinase,DAPK）及6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）基因甲基化状态的改变及基因表达的变化情况,探讨5-氮杂胞苷对髓系白血病细胞系作用的相关机制。方法：采用常规细胞培养,加入5-氮杂胞苷培养48 h后,以甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）检测基因甲基化状态,以RT-PCR检测药物作用前后基因表达水平。结果：MSP显示用药前P16基因、DAPK基因及MGMT基因呈高甲基化状态,应用5-氮杂胞苷处理后P16及DAPK基因发生了完全去甲基化,MGMT基因在用药后发生了部分去甲基化;应用5-氮杂胞苷处理前后P16、DAPK及MGMT基因表达强度分别是（0.22±0.04）与（0.64±0.12）、（0.36±0.08）与（1.27±0.09）及（0.75±0.1）与（1.37±0.1）,３个基因前后表达强度均有统计学差异（P<0.05）。结论：5-氮杂胞苷通过对P16、DAPK及MGMT甲基化基因的去甲基化作用,使这些基因恢复表达,从而抑制髓系白血病细胞系的增殖,发挥肿瘤细胞增殖抑制作用。     

氮杂胞苷对SLE患者外周血T淋巴细胞表达CD70的影响

目的探讨DNA甲基化抑制剂氮杂胞苷对正常人外周血T淋巴细胞表达共刺激分子CD70的影响,以及CD70分子在系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T淋巴细胞的表达。方法分别用流式方法、RT-PCR方法、ELISA方法检测10例健康人外周血T细胞以及10例经氮杂胞苷处理过的健康人外周血T细胞以及20例SLE患者的CD70+CD4+T细胞阳性率、T细胞的CD70mRNA转录水平及血清中的CD70分子分泌水平。结果与健康人相比,活动期、非活动期SLE患者外周血T细胞CD70mRNA表达水平、CD70+CD4+T细胞的阳性率以及血清中CD70蛋白水平均显著升高(P0.05)。且经氮杂胞苷处理过的健康人外周血淋巴细胞CD4+CD70+T细胞阳性率、CD70mRNA转录水平、血清中CD70分子水平较健康人也明显增高(P0.01)。结论SLE患者外周血T淋巴细胞过度表达CD70分子,而且DNA甲基化可能是调控外周血T淋巴细胞的CD70表达的一种基因表达调控机制。     

5-脱氧杂氮胞苷诱导肝癌细胞株p16基因高表达

目的 研究５－脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株ｐ１６基因表达的影响及其机制。方法 肝癌细胞株ＳＭＭＣ－７２２１、ＨｅＰＧ２用５－脱氧杂氮胞苷处理,处理前后采用ＲＴ－ＰＣＲ和免疫组织化学染色法观察和分析其ｍＲＮＡ和蛋白表达变化。结果 经５－脱氧杂氮胞苷处理的肝癌细胞株ｍＲＮＡ和蛋白表达均明显增强。结论 ５－脱氧杂氮胞苷可使ｐ１６基因在转录水平和翻译水平表达增高,其机制可能是通过去甲基化使ｐ１６基因表达恢复。     

DNA甲基化异常对mir-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中表达影响

目的:描述胰腺癌细胞株中DNA异常高甲基化对ndRNA表达抑制所起的作用.观察DNA甲基转移酶抑制剂对miR-615-5p在胰腺癌细胞株PANC-1中甲基化状态和表达的影响.方法:甲基化芯片筛选出在胰腺癌细胞株PANC-1中存在异常甲基化的miRNA.采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycyfid...     

SOX7基因在胰腺癌细胞株的表达及其启动子区甲基化状态的研究

目的:检测SOX7基因在胰腺癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨两者之间的关系?方法:采用RT-PCR检测SOX7基因在胰腺癌细胞株BXPC-3?CFPAC-1?PANC-1和SW1990中的表达水平?重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP)和结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 (combined bisulfite restriction analysis,COBRA)检测启动子区域甲基化状态?采用去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-aza-2-adeoxycytidine,5-aza-dC)处理各细胞株后,检测SOX7基因的mRNA表达和甲基化状态变化?结果:在胰腺癌细胞株BXPC-3?CFPAC-1中SOX7基因的mRNA呈阳性表达,而在PANC-1和SW1990中SOX7基因表达沉默;与BXPC-3?CFPAC-1相比,PANC-1和SW1990中SOX7基因启动子区甲基化率较高?经过去甲基化处理后,PANC-1与SW1990中SOX7启动子区的甲基化率下降,基因重新表达?结论:胰腺癌细胞株PANC-1和SW1990中的SOX7基因表达与启动子区甲基化状态有关,启动子区的高甲基化导致PANC-1? SW1990中SOX7基因的表达沉默?     

不同碘营养水平对大鼠RASSF1A基因甲基化的影响

目的 探究Ras相关区域家族1 A(RASSF1A)基因甲基化与碘营养状态的关系.方法 将40只SD大鼠随机均分成低碘组、适碘组、5倍高碘组、10倍高碘组、20倍高碘组,每组8只.分别用ICP-MS法测定尿碘水平,化学发光免疫分析方法测定血清中甲状腺激素水平,BSP法测定RASSF1A基因的甲基化率.结果 不同碘浓度饲...     

食管鳞状细胞癌中WIF-1基因启动子区甲基化状态及mRNA表达的研究

目的探讨食管鳞状细胞癌(ESCC)中WIF-1基因启动子甲基化状态及mRNA表达水平及其与病理指标之间的关系。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测62例ESCC组织及30例癌旁组织中WIF-1基因启动子区甲基化状态和mRNA的表达水平,应用SPSS13.0探讨其与临床病理资料的关系。结果 WIF-1基因在癌组织中的甲基化率59.7%(37/62)明显高于癌旁组织13.3%(4/30),差异有显著性(P<0.05);其甲基化状态与年龄、分化程度及淋巴结转移情况相关(P<0.05);而与其他临床资料(性别、部位、浸润深度、临床分期)无明显相关性(P>0.05)。WIF-1基因mRNA在ESCC组的表达量(0.565±0.112)显著低于癌旁正常组(0.666±0.107),差异有显著性(P<0.05)。结论 WIF-1基因启动子甲基化在食管鳞癌的进展过程中起着重要的作用;WIF-1基因mRNA表达异常可能与ESCC的发生有关,此基因甲基化与mRNA表达两者之间的关系有待进一步研究。     

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平.结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强.结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.     

5-氮-2'-脱氧胞苷及曲古抑菌素A对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及ING1bmRNA表达的影响

目的　探讨DNA5'CpG岛去甲基化和组蛋白去乙酰化对HT29人结肠癌细胞株ING1b基因启动子区域甲基化、组蛋白乙酰化及其mRNA表达的影响。方法　应用特异性DNA甲基转移酶（DNMTs）抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷（5-Aza-2'-dc,以下简称Aza）及组蛋白去乙酰化酶（HDACs）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）作用人结肠癌细胞株HT29后,用甲基化特异性PCR(MSP)检测该ING1b基因核心启动子区域CpG岛甲基化情况,用染色质免疫沉淀(ChIP)检测其乙酰化组蛋白绑定的DNA情况,并用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ING1bmRNA表达。结果　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因核心启动子区域存在CpG岛半甲基化,且乙酰化水平低,mRNA表达水平低。经Aza及TSA干预后,ING1b基因核心启动子区域CpG岛转为非甲基化,其乙酰化水平增加,ING1bmRNA表达亦比对照组高。结论　HT29人结肠癌细胞株ING1b基因5端核心启动子甲基化及乙酰化可能是导致该基因表达沉默的主要原因,Aza逆转HT29人结肠癌细胞株ING1b基因异常甲基化,TSA能较好地提高其组蛋白乙酰化水平,并有效地激活因半甲基化所致ING1b基因沉默的再转录,诱导该基因表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

胰腺癌细胞株SPARC基因启动子区甲基化状况的研究

目的检测6种胰腺癌细胞株中SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。方法以ASPC、BX-PC3、CFPAC、PANC1、SW 1990、PaTu8988等胰腺癌细胞株及正常人胚肾细胞AD293标本为研究对象,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测细胞株SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化状况。结果6例胰腺癌细胞株中3例(ASPC、CFPAC-1、BxPC3)细胞株发生完全甲基化;3例(PANC-1、Patu8988、SW 1990)发生部分甲基化,正常人胚肾上皮细胞AD293未发生甲基化。结论SPARC基因启动子区5’CpG岛甲基化改变是胰腺癌SPARC基因的一种重要失活方式,SPARC基因启动子区的高甲基化是胰腺癌细胞区别于正常细胞的分子事件之一,可能在胰腺癌的发生、发展中起重要作用。检测SPARC基因高甲基化可能会成为一种新的诊断胰腺癌的肿瘤标志物。     

去甲基化作用对胃癌细胞生物学行为及xaf1基因表达的影响

目的:探讨去甲基化药物5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza.CdR)对体外培养的胃癌BGC823细胞增殖活性、细胞周期和凋亡以及对此细胞株xafl基因表达的影响.方法:用MTT法检测不同浓度5-Aza-CdR对细胞增殖活性的影响;PI染色和流式细胞仪检测不同浓度5-Aza-CdR处理72 h后细胞周期分布和细胞凋亡率;RT-PCR法检测用药前后xafl基因表达的变化.结果:用1×103,5×103.10×103nmol/L的5-Aza-CdR处理BGC823细胞6 d后,试验组细胞增殖抑制率较对照组明显升高(P<0.05),并呈剂量依赖关系;流式细胞仪分析表明,各药物浓度处理72 h后凋亡率明显增加:试验组凋亡率分别为(4.53±0.21)%,(8.11±1.01)%和(11.56±0.86)%,与对照组(0.51±0.01)%相比较差异显著(P<0.05).在5-Aza-CdR处理前,未检测到BGC823细胞株xafl基因mRNA表达,经过5-Aza-CdR处理后,xafl mRNA重新表达.结论:5-Aza-CdR可抑制BGC823细胞增殖;促进细胞凋亡;使xafl基因甲基化状态得到逆转,而重新表达.     

大肠癌组织Runx3基因启动子甲基化的研究

目的:检测大肠癌患者肿瘤组织及其相应的癌旁组织中Runx3基因表达和启动子区域甲基化状态,探讨甲基转移酶抑制剂5-aza-dc对结肠癌细胞系中Runx3表达的作用。方法:将手术切除的37例大肠癌组织和对应癌旁组织提取RNA和基因组DNA,采用RT-PCR检测Runx3基因的表达,甲基化特异PCR方法(MSP)检测Runx3基因启动子区域甲基化状态,用5-aza-dC处理结肠癌细胞系后,RT-PCR方法检测Runx3基因的表达。结果:37例大肠癌和对应癌旁组织中Runx3基因表达阳性率分别为100%(37/37),2.7%(1/37)。癌组织中Runx3基因表达明显降低(P<0.01)。MSP检测发现11例(30%)大肠癌标本及1例(3%)癌旁正常组织中Runx3基因呈甲基化状态。癌组织中Runx3基因甲基化明显高于癌旁组织(P<0.05)。结肠癌细胞系HT29 5-aza-dC处理后Runx3基因表达水平增加。结论:Runx3基因启动子甲基化和Runx3基因表达在大肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著性差异,可能与结肠癌的发生发展有关。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷逆转RASSF1A基因甲基化对人乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：探讨启动子甲基化对乳腺癌MCF-7细胞RASSF1A基因的作用及5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）干预对启动子甲基化的影响,为临床治疗乳腺癌奠定理论基础.方法：用1,3,5,7,9μmol/L不同浓度的5-Aza-CdR处理MCF-7乳腺癌细胞株,通过MTT检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株存活率的影响;建立5μmol/L,10μmol/L的浓度梯度流式细胞仪检测5-Aza-CdR对MCF-7乳腺癌细胞株生长周期及凋亡率的影响,MSP（甲基化PCR）检测5-Aza-CdR处理前后RASFF1A抑癌基因的甲基化状态,RT-PCR检测处理前后抑癌基因RASSF1A mRNA表达情况.结果：5-Aza-CdR抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞,诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡和细胞周期停滞在G0/G1期,呈浓度依赖性.经5-Aza-CdR处理人乳腺癌MCF-7细胞后,MSP检测RASSF1A基因发生了甲基化,RT-PCR检测RASSF1A mRNA恢复了表达.结论：RASSF1A基因启动子甲基化是导致其失活的主要原因,5-Aza-CdR可以逆转乳腺癌细胞株MCF-7细胞RASSF1A基因启动子甲基化状态,使其重新表达．