多孔钽材料细胞毒性、生物相容性及体内成骨性研究

 目的 探讨国产多孔钽材料的细胞毒性和生物相容性,并通过兔骨内植入成骨示踪观察其成骨作用。方法 扫描电镜观察并测量多孔钽的形态学特征。来源于新西兰胎兔颅盖骨的成骨细胞以多孔钽浸提液（实验组）及完全培养基（对照组）培养,MTT法检测多孔钽的细胞毒性及其对增殖的影响。成骨细胞与多孔钽体外复合培养,观察成骨细胞的黏附、生长及增殖。雄性新西兰大白兔24只,制备股骨髁上多孔钽棒植入模型;4只动物于术后第5天和第19天分别肌肉注射荧光素钙黄绿素和茜素红,术后10 周取材,于488 nm（钙黄绿素激发光）和543 nm（茜素红激发光）波长处,激光扫描共聚焦显微镜观察多孔钽-骨界面成骨;20只动物于术后2、4、8和12 周取材行大体及硬组织切片观察。结果 多孔钽表面及断面可见均匀分布的三维立体连通孔隙结构。MTT法检测显示实验组与对照组细胞随培养时间的延长,其OD值的差异均无统计学意义。扫描电镜显示复合培养早期,细胞在多孔支架表面和孔壁上黏附,相互连接;晚期汇合成片并分泌细胞外基质覆盖材料表面。体内成骨实验显示植入的多孔钽棒与宿主骨结合紧密。硬组织切片显示术后2、4周时多孔钽-骨界面已出现新生骨及小血管,并向孔隙内生长;8、12周时多孔钽表面和孔隙内已长满新生骨组织,新生骨小梁已发育成熟并与材料直接接触。激光共聚焦扫描显微镜显示多孔钽-骨界面及孔隙内可见绿色荧光（钙黄绿素）和红色荧光（茜素红）标记的新生骨组织,红色荧光带位于绿色荧光带周围,早期均呈不连续性,晚期则融为一体。结论 国产多孔钽材料无细胞毒性,具有良好的生物相容性,多孔钽-骨界面为接触及传导性成骨并呈时间依赖性。     

3-甲基腺嘌呤对大鼠内皮祖细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的 观察3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine,3-MA)对大鼠骨髓源性内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、凋亡及细胞周期的影响.方法 密度梯度法取大鼠骨髓EPCs,体外诱导分化并鉴定.实验分对照及不同浓度(1.25、2.5、5、10 mmol/L)3-MA组.四氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测细胞增殖,流式细胞仪测凋亡率及细胞周期.结果 (1)5 mmol/L组促EPCs增殖;10 mmol/L组抑制EPCs增殖,差异有统计学意义(P＜0.05).其余两组对EPCs增殖无明显影响,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)10 mmol/L组促EPCs凋亡,差异有统计学意义(P＜0.05).其余各组对EPCs凋亡率无明显影响,与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).(3)5、10 mmol/L组影响细胞周期,5 mmoL/L组G0/G1期细胞减少、S和G2/M期增加;10 mmol/L组发生S期阻滞,G2/M细胞减少;差异有统计学意义(P＜0.05).结论 3-MA对EPCs增殖及凋亡的影响与其浓度有关,当浓度为10 mmol/L时抑制增殖并促进凋亡.

Abstract：

Objective To investigate the effect of proliferation,apoptosis and cell cycle of 3-MA on rat endothelial progenitor cells. Methods Bone marrow-derived mononuclear cells were isolated from rat bone marrow by ficoll. There were five groups. The control group and four 3-MA concentration groups: 1. 25 mmol/L,2. 5 mmol/L,5 mmol/L, 10 mmol/L. MTT was used to measure the proliferation of endothelial progenitor cells. Flow cytometry ( FCM) was used to detect cell apoptosis and cell cycle. Results (1)5 mmol/L 3-MA promotes proliferation of endothelial progenitor cells, while 10 mmol/L 3-MA inhibits the proliferation of endothelial progenitor cells (P ＜ 0. 05). (2) 10 mmol/L 3-MA promotes apoptosis of endothelial progenitor cells, compared with the control, the difference was significant ( P ＜ 0. 05 ). (3) 3-MA at the concentration of 5 mmol/L reduces cells at G0/G1 phase and increases S and G2/M phase cells; 10 mmol/L 3-MA induces endothelial progenitor cells blockade at S phase, G2/M phase cells decreased, compared with the control, the difference was significant (P ＜ 0. 05). Conclusions 5 mmol/L 3-MA promotes the proliferation of endothelial progenitor cells. 10 mmol/L 3-MA inhibits the proliferation and promotes apoptosis of endothelial progenitor cells.     

三种支架材料与软骨细胞复合构建组织工程化软骨的研究

目的：研究细胞、材料及孔径在诱导关节软骨发育过程中的作用。方法：采用细胞与支架的三维培养和体内植入技术。结果：种入支架的原代软骨细胞增殖差，未形成软骨组织。而第2代软骨细胞生长良好，最终发育成软骨组织。孔径为25－100μm的胶原海绵捕捉的细胞量明显多于孔径为100－550μm的明胶海绵和PDLLA泡沫。裸鼠皮下植入16周时3种支架－细胞复合体比较，胶原海绵－细胞复合体中的支架材料降解最彻底，软骨组织发育最好。结论：第3代软骨细胞细胞增殖优于原代细胞；25－100μm的小孔径支架对细胞的吸附量优于100－550μm的大孔径支架；软骨发育中支架材料的彻底降解是优质软骨组织形成的前提。     

胶原膜/国产多孔钽金属双相支架修复山羊大面积骨软骨缺损的实验研究

背景:骨软骨联合病变是骨科常见疾病,一直缺乏有效的治疗手段。目的:通过使用胶原膜联合自主研发的三维多孔钽金属支架,设计构建了一种新型的仿生骨组织工程复合体,并探讨其修复山羊大面积骨软骨缺损的效果。方法:将多孔碳化硅支架通过化学气相沉积技术制备成多孔钽金属,然后采用纤维蛋白黏合剂将胶原膜及自主研发的多孔钽金属进行界面结合,得到双相支架材料;在体外通过扫描电镜观察胶原膜及多孔钽的微观形貌,并通过能谱分析测定其组成成分;万能力学测试机进行双相支架材料的力学检测。32只雄性山羊采用随机数字表法分为4组,每组各8只,于左后肢建立骨软骨缺损模型(缺损面积直径为10 mm,深度为12 mm)。单纯骨软骨缺损组不做任何治疗,其余3组分别采用单纯胶原膜、单纯国产多孔钽金属、胶原膜/国产多孔钽金属双相支架修复。植入16周后进行大体观察及硬组织切片、染色,并进行定量分析。结果:扫描电镜观察结果表明,双相支架结合面均匀、光滑、牢固。能谱分析表明,胶原膜由碳、氧、钙3种元素组成,国内多孔钽金属主要由碳、硅和钽组成。该支架具有良好的抗压强度、抗拉强度、粘结强度和抗剪强度。植入山羊负重区大面积骨软骨缺损区16周后,国际软骨修复学会评分(ICRS)及改良O'Driscoll组织学评分结果显示,与单纯多孔钽金属组、单纯胶原膜组及单纯骨软骨缺损组相比,胶原膜/国产多孔钽金属双相支架组具有明显的骨软骨修复效果(P<0.05)。结论:本研究对于在负重区的大面积骨软骨缺损的成功修复显示了临床转化的潜能。为大面积骨软骨联合病变的临床治疗提供新的组织工程思路。     

多孔钽材料制备及其骨科植入物临床应用现状

多孔钽具有高孔隙率、低弹性模量、高摩擦系数、组织内生性及软骨传导性等特性,是理想的骨科材料。近年来,对多孔钽制备技术的研究以及多孔钽植入器械的临床应用取得令人鼓舞的结果。该文就多孔钽的材料制备及生物学特性,多孔钽植入器械在人工关节外科、脊柱外科等方面的临床应用进展作一综述。     

金属离子对成骨细胞凋亡、细胞周期分布及ALP分泌的影响

目的金属磨损产物对人工关节的无菌性松动有影响,通过观察Co2+、Cr3+对小鼠成骨细胞凋亡、细胞周期以及在离子刺激下对成骨细胞分泌ALP的影响,为防治人工关节置换术后假体周围骨溶解提供实验依据。方法体外培养小鼠颅骨成骨细胞MC3T3-E1至第3～5代,调整细胞密度至5×105个/mL,根据干预方法不同将细胞分为两组。实验组:成骨细胞于含10%FBS的α-MEM培养基中培养,待细胞完全贴壁后,加入CoCl2与CrCl3混合溶液;对照组:成骨细胞于含10%FBS的α-MEM培养基中培养。于培养12、24、48h后,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率及周期分布,ELISA法检测培养上清液中ALP含量。结果培养12、24、48h,实验组凋亡率分别为13.90%±0.52%、14.80%±0.41%、13.40%±0.26%,对照组分别为8.56%±0.31%、8.19%±0.24%、2.15%±0.11%,差异均有统计学意义(P<0.05)。各时间点实验组细胞G2M期分布比例明显较对照组降低,G0G1期分布比例较对照组增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。培养12、24、48h,实验组ALP含量检测吸光度(A)值分别为0.955±0.052、0.624±0.041、0.498±0.026,对照组分别为1.664±0.041、1.986±0.024、2.192±0.041,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Co2+、Cr3+对成骨细胞的细胞周期分布有明显影响,抑制其增殖,使细胞大部分处于G0G1期,同时增加其凋亡率,抑制成骨细胞释放ALP。     

多孔金属钽棒治疗早期股骨头坏死的近期疗效观察

目的探讨多孔金属钽棒治疗早期股骨头坏死（ONFH）的临床效果。方法对应用多孔钽棒治疗的15例早期ONFH患者临床资料进行回顾性研究。按照国际骨循环研究会（ARCO）分类的ONFH病变Ⅰ、Ⅱ期患者共15例（15髋）,术后3、6、12、24个月时随访。临床评价Harris评分、X线片病情及骨长入情况。结果 Harris评分术前与术后3、6、12、24个月比较差异均有统计学意义（P=0.000）。手术前、后X线片分期比较,术后12个月2例ⅡB期进展为ⅡC期,24个月2例ⅡC期进展为Ⅲ期,股骨头塌陷,需行全髋关节置换术。4例可见原有囊性变区内骨密度增高表现,1例在钽棒周围出现＂骨锚固征＂。结论多孔金属钽棒对ONFHⅠ期病变治疗改善率最佳,ⅡA、ⅡB期改善率次之,ⅡC期改善率最低,对Ⅰ、ⅡA、ⅡB期病变可有效防止股骨头塌陷。     

多孔钽棒植入治疗早期股骨头坏死的临床观察

目的探讨多孔钽棒植入治疗早期股骨头坏死的临床疗效。方法对1 012例早期股骨头坏死患者应用髓芯减压和钽棒植入术治疗,术后平均随访11月,根据Harris评分对患者术后髋关节功能进行评估。结果 12患者Harris评分由治疗前平均(70.26±6.33)分,提高到治疗后(89.63±7.81)分,治疗前后差异有统计学意义。随访影像学检查示:股骨头轮廓光滑,无坏死进展。结论多孔钽棒治疗早期股骨头坏死早期临床疗效良好,具有减压、结构性支撑、微创、操作简单等优点。     

马钱子对三种软骨细胞凋亡模型的影响

目的：观察中药马钱子对三种软骨细胞凋亡模型的影响。方法：在兔软骨细胞培养体系中分别加入2mmol／L硝普钠（SNP）、2mmol／LSNP＋马钱子、10mol／L全反式维甲酸（ATRA）、10mold／L ATRA＋马钱子；在人胚胎软骨细胞培养体系中加入30ng／L肿瘤坏死因子-α（TNF—α）、TNF—α＋马钱子，各组培养24h后，采用Annexin V／PI双参数法对软骨细胞凋亡进行定量检测。结果：软骨细胞在加入SNP、ATRA、TNF—α发生凋亡时，加入马钱子能降低SNP、ATRA诱导的软骨细胞凋亡率（P〈0．01，P〈0．05），但对TNF—α诱导的软骨细胞凋亡，无明显抑制作用（P〉0．05）。结论：中药马钱子对部分软骨细胞凋亡有一定抑制作用。     

葛根素联合国产多孔钽对人成骨细胞COL-I、OC、OPN表达和细胞增殖的影响

目的研究探索葛根素联合国产多孔钽支架材料对人成骨细胞MG-63 COL-I、OC、OPN表达和细胞增殖的影响。方法实验分为:葛根素组:不同浓度的葛根素与成骨细胞共培养(CCK-8法筛选出葛根素作用最佳剂量浓度组);多孔钽组:国产多孔钽与成骨细胞共培养;葛根素多孔钽组:葛根素、国产多孔钽与成骨细胞共培养;空白组:成骨细胞培养。扫描电镜观察多孔钽及葛根素多孔钽-成骨细胞复合物表面形态;CCK-8法检测成骨细胞的生长增殖状态;实时荧光定量PCR法(RT-PCR)和免疫细胞化学染色法检测成骨细胞COL-I、OC、OPN mRNA和蛋白的表达。结果葛根素和多孔钽组较空白组均可促进成骨细胞的增殖(P0.05);葛根素多孔钽组较其它各组细胞的增殖活性最显著(P0.05)。RT-PCR法和免疫细胞化学染色法结果显示,葛根素和国产多孔钽对成骨细胞COL-I、OCmRNA和蛋白表达均有影响(P0.05),但对OPN mRNA和蛋白无显著影响(P0.05)。结论葛根素和国产多孔钽支架具有协同影响成骨细胞COL-I、OC、OPN mRNA和蛋白的表达,以及促进成骨细胞的增殖。     

Effect of norcantharidin on the proliferation,apoptosis, and cell cycle of human mesangial cells

Aims: Norcantharidin (NCTD) regulates immune system function and reduces proteinuria. We sought to investigate the effect of NCTD on proliferation, apoptosis and cell cycle of cultured human mesangial cells (HMC) in vitro.

Methods: HMC cells were divided into a normal control group, and various concentrations of NCTD group (2.5, 5, 10, 20, or 40?μg/mL). Cell proliferation was determined by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay, apoptosis was detected by Annexin V/propidium iodide (PI) assays, and morphological analysis was performed by Hoechest 33258 staining. Finally, cell cycle was analyzed by flow cytometry.

Results: NCTD dose and time dependently inhibits HMC proliferation significantly (p?Conclusion: NCTD inhibits HMC cell proliferation, induces apoptosis, and affects the cell cycle.     

血管紧张素Ⅱ对大鼠增生前列腺细胞增殖和凋亡的影响

目的了解血管紧张素Ⅱ对良性前列腺增生(BPH)大鼠前列腺细胞增殖和凋亡的作用。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为正常组(A组),BPH模型组(B组)和BPH+血管紧张素转化酶抑制剂依那普利组(C组),每组10只。B组在双侧睾丸切除后1周开始皮下注射丙酸睾酮并灌饲生理盐水,C组在双侧睾丸切除术后1周开始皮下注射丙酸睾酮并灌饲依那普利。4周后观察各组大鼠前列腺重量和组织学变化,Ki-67免疫组化染色及TUNEL染色测定前列腺上皮和间质细胞的增殖和凋亡指数。结果3组大鼠前列腺指数[前列腺湿重(mg)／体重(g)]分别为1．54±0．09,1．65±0．07和1．59±0．09,B组大鼠前列腺指数显著大于A组和C组(P<0．05)。光镜显示B组前列腺上皮细胞增生明显,C组上皮细胞明显萎缩。A组上皮和间质细胞增殖率分别为(1．4±0．4)％和(1．1±0．4)％,B组为(3．0±0．4)％和(1．4±0．4)％,C组为(2．1±0．5)％和(1．2±0．5)％,B组上皮细胞增殖率显著高于A组和C组(P<0．05),而3组间质细胞的增殖率比较差异无统计学意义(P>0．05);3组上皮细胞凋亡率分别为(1．2±0．5)％,(1．1±0．3)％和(1．1±0．5)％(P>0．05)。结论血管紧张素Ⅱ在大鼠BPH组织中表达上调。血管紧张素Ⅱ可能影响大鼠前列腺细胞的增殖,但对细胞凋亡影响不明显。     

亚麻木酚素对大鼠生长板软骨细胞凋亡的影响

目的：比较不同浓度亚麻木酚素抑制生长板软骨细胞凋亡的效果,筛选出最适药物浓度,为其延迟大鼠骨骺闭合促进长骨生长进行理论支持。方法：选取2只4周龄雄性SD大鼠,SPF级,体质量80 g。解剖大鼠胫骨及股骨生长板软骨并进行体外分离,获得生长板软骨细胞进行培养,利用倒置相差显微镜及Ⅱ型胶原免疫荧光实验对软骨细胞分别进行形态学观察、鉴定,然后采用白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)20 ng/ml诱发生长板软骨细胞凋亡为模型组,同时加入分别含1、10、20、40μM亚麻木酚素为实验组,同时加入5μM来曲唑为阳性对照组,分别培养24、48 h,MTT法观察药物促进细胞增殖情况,流式细胞仪检测药物抑制细胞凋亡情况。结果：含量1、10、20、40μM的亚麻木酚素均可不同程度促进细胞增殖,其原理为药物抑制了IL-1β诱发的生长板软骨细胞凋亡,抑制细胞凋亡的最佳药物浓度为20μM。结论：适宜浓度的亚麻木酚素对大鼠生长板软骨细胞凋亡抑制效果明显且最适药物浓度为20μM,为骨骼延迟闭合提供更长的生长时间,从而为促进发育期骨骼增长提供可能。     

大鼠肝切除后肝再生期间细胞周期调控下细胞增殖与凋亡的关系

目的探讨正常组织增生过程中,细胞周期调控下细胞增殖与凋亡之间的关系。方法以大鼠肝切除后肝再生为模型,以Ｋｉ６７抗原的检测和ＳｕｂＧ１法分别为细胞增殖与细胞凋亡的定量分析方法。结果肝切除术后３６小时,Ｋｉ６７阳性细胞比例（Ｋｉ）达峰值;术后２４小时,凋亡细胞比例（Ａｐ）达峰值;各实验组的Ａｐ／Ｋｉ比值与对照组相比差异有显著性（Ｐ＜０．０１）,其峰值位于术后１２小时。结论（１）正常组织增生中,细胞凋亡不但存在,而且和细胞增殖一样重要。机体通过细胞周期,以细胞凋亡形式,调控着组织增生的速度和规模;（２）应以Ａｐ／Ｋｉ衡量细胞凋亡在各时期所具作用之重要性;（３）细胞凋亡所具作用相对最大时,是在组织增生开始后的早期,先于细胞增殖最活跃期,表明机体对组织增生的反应谨慎而严格。     

环孢素对大鼠膀胱肿瘤细胞增殖、凋亡和新生血管形成的影响

目的 探讨环孢素对N-丁基-N-(4-羟丁基)亚硝胺(BBN)诱导的大鼠膀胱肿瘤细胞增殖、凋亡及肿瘤新生血管形成的影响.方法实验组大鼠10只在用BBN诱导膀胱肿瘤的同时用环孢素进行药物干预,对照组大鼠10只仅用BBN诱导膀胱肿瘤.取2组大鼠膀胱标本免疫组化方法检测肿瘤增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况,计算肿瘤细胞增殖指数;TUNEL方法检测肿瘤细胞凋亡情况,计算肿瘤细胞凋亡指数;免疫组化方法检测肿瘤CD31表达情况,计算肿瘤微血管密度(MVD).结果 实验组和对照组肿瘤细胞增殖指数分别为(35.3±8.6)%和(28.7±8.0)%,P＜0.05;凋亡指数分别为(2.5±0.8)%和(4.3±1.3)%,P＜0.05;微血管密度分别为32.5±8.2和26.3±8.1,P＜0.05.结论 环孢素可能通过影响肿瘤细胞增殖、凋亡和肿瘤新生血管形成等机制对膀胱肿瘤生长产生促进作用.     

补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖对大鼠膝软骨细胞增殖及凋亡影响的研究

目的研究中药经方补肾壮筋汤联合西药盐酸氨基葡萄糖,制备相应浓度的含药血清,作用于大鼠膝软骨细胞,为膝骨性关节炎的治疗提供新的理论依据及方法。方法将SPF级大鼠(32只)随机分为4组,分别以生理盐水、补肾壮筋汤、盐酸氨基葡萄糖、补肾壮筋汤联合盐酸氨基葡萄糖,对大鼠进行药物灌胃1周,制备相应浓度的含药血清作用于离体培养的大鼠膝软骨细胞,通过MTT法检测不同浓度(0. 6%、1. 2%、2. 4%)含药血清对软骨细胞增殖活力、流式细胞分析仪检测细胞凋亡率、Western blot检测软骨细胞中II型胶原蛋白的表达情况。结果 MTT法检测示,对大鼠膝软骨细胞的促进增殖作用中,中西医结合组优于其他各组,差异具有统计学意义(P0. 01);流式细胞仪检测细胞凋亡率示,中西结合血清组能够明显降低软骨细胞凋亡率,与其他各组比较差异具有统计学意义(P0. 01); Western blot示,中西医结合血清组促进软骨细胞中II型胶原蛋白表达明显高于其他各组,差异具有统计学意义(P0. 01)。结论中西医药物联合应用对大鼠膝软骨细胞增殖作用明显高于中药组及西药组,并能够促进软骨细胞中II型胶原蛋白的表达,降低大鼠膝软骨细胞凋亡的发生,从而起到骨性关节炎的治疗作用。     

基因靶向抑制反义生存素对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨反义生存素（Survivin）脂质体复合物对脑胶质瘤细胞增殖和凋亡效应的影响及机制，为脑胶质瘤Survivin基因靶向治疗提供理论依据。方法用脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染脑胶质瘤细胞系U251细胞；Western印迹试验检测Survivin表达水平变化；噻唑蓝（MTT）法测量细胞生长情况；流式细胞仪检测细胞凋亡率及线粒体膜电位变化；电镜倒置显微镜观察细胞形态学变化；应用激光共聚焦显微镜免疫荧光分析法评价脂质体反义复合物对Survivin蛋白的影响。结果反义Survivin脂质体复合物能有效下调Survivin表达水平。肿瘤细胞凋亡率随转染时间延长而逐渐递增。并出现凋亡形态学变化。免疫荧光分析中标记有绿色荧光染色的Survivin蛋白分子在未转染的细胞浆中清晰可见。并呈斑点状分布；而在转染细胞中几乎没有发现。结论靶向抑制Survivin基因在脑胶质瘤未来治疗中有良好的应用前景。     

褪黑素对高糖条件下培养的大鼠系膜细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

糖尿病肾病（DN）晚期肾脏细胞凋亡与肾功能恶化程度成正比，抑制凋亡则可延缓肾小球硬化。褪黑素（MT）是松果体分泌的神经内分泌激素，肾脏是其靶器官之一。研究显示MT对DN肾脏有明显的保护作用，但MT对DN晚期肾小球系膜细胞（MC）凋亡的影响尚未检索到有关报道。本试验选用大鼠MC为研究对象，来观察MT对高糖诱导的MC凋亡的影响。