重组人TNF-α在大肠杆菌中的表达、纯化及生物学活性研究

构建有利于人肿瘤坏死因子α(TNF-α)大量表达及有效纯化的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达。通过密码子优化构建表达质粒pET28-TNF,并将其转化入大肠杆菌,对表达条件进行优化后进行大量表达并通过两轮镍柱亲和纯化获得高纯度重组人TNF-α(rhTNF-α)蛋白。应用Western blot和细胞测活分别检测重组人TNF-α蛋白的抗原性和细胞毒活性。成功构建了重组人TNF-α原核表达载体,并通过表达纯化获得了纯度>95%,具有生物活性(LD50<10 ng/mL)的rhTNF-α蛋白。     

重组人突变型TNF-α在大肠杆菌中的诱导表达及高效纯化

建立重组人突变型ＴＮＦ－α的纯化工艺,获得ＴＮＦ－α纯品,为下游规模生产打基础。方法：诱导表达重组 ＴＮＦ－α突变体蛋白,用 ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、ＣＭ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ两步层析结合小范围线性梯度洗脱法纯化。结果：所得重组蛋白的纯度达９８％以上,比活达１．７×１０９ｕ／ｍｇ蛋白,无热原。结论：此纯化方法可对重组ＴＮＦ－α突变体蛋白进行高效快速纯化,易于实现规模化生产。     

重组人Hexastatin融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及其纯化

目的构建人Hexastatin蛋白原核表达载体,大量表达并纯化Hexastatin蛋白,为其在体内外的活性研究奠定基础。方法提取人食管癌EC9706细胞总RNA,通过RT-PCR方法扩增人Hexastatin基因,导入pMD18-T载体测序,然后克隆至pMAL-c4x表达载体,IPTG诱导表达,并利用Amylose亲和树脂纯化融合蛋白,产物进行Westernblot鉴定。结果经PCR扩增成功获得了687bp的人Hexastatin基因,测序正确。重组人Hexastatin基因在BL21菌体中获得高效可溶性表达,表达的可溶性蛋白占总蛋白量的24.8%,纯化后的MBP-Hexastatin融合蛋白纯度可达90%,Westernblot证实表达蛋白为目的蛋白。结论人Hexastatin基因克隆、表达及纯化的成功,为进一步在体内外研究其生物活性奠定基础,同时也为肿瘤的生物治疗提供了新的方法。     

蛋白激酶CK2α在大鼠肝纤维化病理过程中的表达变化

目的 观察蛋白激酶casein kinaseⅡα(CK2α)在大鼠肝纤维化病理过程中的表达变化,以及10-甲氨基-8-硫代苦参碱(MASM)抗肝纤维化治疗对CK2α表达的影响。 方法 采用二甲基亚硝胺(DMN)和胆管结扎术(BDL)的方法建立大鼠肝纤维化模型,造模后灌胃给予MASM(50 mg/kg)和生理盐水进行治疗。肝组织切片分别采用苏木精-伊红染色进行病理分析,用天狼星红和Masson胶原染色判定肝纤维化程度,免疫组织化学法观察纤维化肝组织中CK2α和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达变化。 结果 与对照组相比,DMN及BDL诱导的肝纤维化组织中CK2α的表达水平均显著上调;注射DMN造模1~4周,随着造模时间的延长,α-SMA表达逐渐增加,CK2α的表达水平相应显著上调;与模型组相比,MASM药物治疗组大鼠肝纤维化程度明显缓解,同时CK2α 的表达水平显著下调。 结论 蛋白激酶CK2α的表达水平与肝纤维化的形成呈正相关关系;苦参碱衍生物MASM抗肝纤维化作用伴随下调CK2α的表达水平,提示CK2α是一个肝纤维化治疗的潜在靶点。     

重组TGF β1在大肠杆菌中的表达、纯化

目的通过pET 43.1原核表达载体,表达重组人转化生长因子β1(human transform growth fac-tor,rhTGFβ1)。方法将人工整合了肠激酶作用位点的TGFβ1,插入到含有NusA蛋白的融合表达载体pET 43.1中。重组质粒转化大肠杆菌(E.coli)BL21(+)并用IPTG诱导表达。通过镍柱纯化重组蛋白,用Western blot杂交检测重组蛋白的免疫原性,用肠激酶酶切得到TGFβ1单体。结果 SDS-PAGE结果显示,相对分子质量约为70 000的融合蛋白大部分在上清中表达,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的80%。取超声上清,通过His亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,纯度质量分数为95%。肠激酶切割得到TGFβ1单体,经Western blot检测重组蛋白的免疫原性。结论人转化生长因子β1在大肠杆菌中实现了高效表达,获得了具有免疫原性的重组TGFβ1。     

重组人PD-L1在大肠杆菌BL-21中的表达、纯化和鉴定

目的 分离纯化人程序死亡蛋白-1(PD-LI)基因,制备重组人PD-L1蛋白,为进一步研究PD-L1在肿瘤免疫逃逸中的作用和机制建立基础.方法 通过RT-PCR分离纯化人PD-L1基因,并将其克隆到原核表达质粒pGEX-4T一1中,经酶切,测序鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达.产物经GST蛋白纯化系统进行纯化后,用10%SDS-PAGE及Western Blot分析鉴定.结果 经RT-PCR分离纯化的PD-L1 cDNA分子由645 bp构成,编码相对分子量约25 KD的蛋白,并与GST形成融合蛋白.GST-PD-L1融合蛋白相对分子量约46 KD.Western Blot结果显示,该蛋白能被兔抗GST和抗PD-L1抗体识别.结论 成功构建了PD-L1原核表达载体,并在大肠杆菌BL21中获得高效表达.     

蛋白激酶CK2在细胞周期调控中的作用

细胞周期的研究是生物生长、发育、遗传及医学等相关领域中重大问题研究的基础,其运转的分子基础是以Cyc lin-CDK-CK I为中心的细胞周期网络调控系统。蛋白激酶CK2在进化过程中是最保守的蛋白激酶之一,大量的研究表明,其在细胞周期的调控中发挥着举足轻重的作用。     

重组羧肽酶原B在大肠杆菌中的可溶性表达及活性羧肽酶B的纯化

实现羧肽酶原B表达质粒在大肠杆菌中的可溶性表达,并对表达产物进行激活和纯化,得到活性CPB.采用摇瓶发酵,对诱导温度,诱导时间,诱导剂IPTG的浓度进行优化,促成其可溶性表达;优化酶解激活条件,提高粗酶液比活.粗酶液用DEAE-FF离子交换柱和Octyl-FF疏水柱两步纯化.结果：实现可溶性表达的最佳条件为15℃下,0.1 mmol/LIPTG诱导20 h.此条件下得到的粗酶液经激活后两步纯化,得到比活为128.2 u/mg protein的较纯的活性CPB,活性回收率达39%.     

一种新型重组人复合α干扰素的表达、分离纯化及活性测定

为提高重组复合α干扰素的活性和半衰期,在现有复合α干扰素结构基础上进行氨基酸替换,合成了新型干扰素(N-cIFN)基因,将该基因克隆到温控表达质粒pBV220,转化大肠杆菌BL21获得工程菌BL21/pBV220-cIFN,经过诱导表达、包涵体变性、DEAE Sephadex A-25柱层析、Sephadex G-50...     

蛋白激酶CK2α与食管癌发生发展及临床病理因素的相关性研究

目的 探讨蛋白激酶CK2α在食管癌发生发展中的作用及其与食管癌的临床分期、病理类型之间的关系.方法 采用免疫组织化学法检测该院收治的120例食管癌患者癌组织及癌旁组织中蛋白激酶CK2α蛋白的表达水平,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot技术对其中的19例患者的术后标本的蛋白和mRNA进行检测.比较癌组织和癌旁组织中的蛋白激酶CK2α蛋白和mRNA表达差异.结果 食管癌组织中的CK2α中阳性与强阳性表达率分别高于癌旁组织(P＜0.05).CK2α阳性表达情况在不同T分期、淋巴结转移间差异无统计学意义(P＞0.05),CK2α阳性表达分布在不同临床TNM分期间差异有统计学意义(P＞0.05).CK2α蛋白、CK2αmRNA在食管癌组织的表达均显著的高于癌旁组织(P＜0.05).结论 蛋白激酶CK2α与食管癌的发展有着一定的关系,可以作为临床上对食管癌病变程度的一种分子判定标准.     

重组肝素酶I在大肠杆菌中的表达及纯化

优化肝素裂解酶I在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pOFX-T7-SL1中的重组表达条件,结果显示接种6 h(OD600≈2.5)后加入0.25 mmol/L IPTG,在25℃下表达8 h目标蛋白酶活达到最高值1.49×105IU/L。进一步于5 L发酵罐中扩大培养,20 h后最高酶活达到5.55×105IU/L。利用亲和层析分离目标蛋白,肝素裂解酶I的纯度可达到96%,回收率为37.58%,比酶活达到1.12×103IU/mg。肝素裂解酶I的高效表达为大规模利用酶法制备低分子肝素打下了坚实的基础。     

蜂毒肽基因在大肠杆菌中的表达、纯化及初步鉴定

目的通过pGEX-2T原核表达载体表达蜂毒肽。方法将人工合成整合了肠激酶作用位点的蜂毒肽基因,插入载体pGEX-2T,构建蜂毒肽与谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合表达载体pGEX-MEL。重组质粒转化E.coliBL21(DE3)诱导表达,超声破碎菌体,SDS-PAGE检测蛋白表达情况,取超声上清,通过GST亲和色谱系统纯化目的融合蛋白,酶切通过溶血实验检测其溶血活性。结果SDS-PAGE结果显示,表达了相对分子质量约为30 000的融合蛋白,目的融合蛋白量约占菌体总蛋白量的29.5%。经Western blot鉴定,表达的GST融合蛋白与GST抗体有强烈的交叉反应,说明成功表达了目的融合蛋白。取超声上清,亲和色谱纯化融合蛋白,纯度为95%。肠激酶切割得到了人工天然蜂毒肽,测定蜂毒肽回收率为80%。结论通过原核表达系统成功表达蜂毒肽,具有和天然蜂毒相同的溶血活性。     

重组人促甲状腺激素α亚基在大肠杆菌中的表达

目的:构建pGEX-3X/hTSHα大肠杆菌表达系统,制备重组人促甲状腺激素α(TSHα)亚基.方法:Trizol法提取新鲜人绒毛膜组织总RNA,将1 μg总RNA逆转录合成cDNA并以之为模板进行PCR扩增hTSHα亚基的完全编码序列.EcoR1和BamHI双酶切将所扩增的hTSHα基因定向克隆入表达载体pGEX-3X,转化感受态大肠杆菌Mach1-T1,IPTG诱导表达融合蛋白GST-rhTSHα.离心收集菌体,超声碎菌后获得包涵体.以梯度浓度降低的尿素溶液洗涤,8 mol/L尿素溶液溶解包涵体.包涵体溶解液经透析后复性进行SDS-PAGE鉴定及竞争性ELISA抗原性分析.结果:DNA序列分析证实重组pGEX-3X/h TSHα质粒含有读码框正确的hTSHα基因.PAGE显示重组质粒可表达产生36 ku大小的特异蛋白条带.ELISA结果表明,所表达的融合蛋白具有与抗人TSHα抗体相结合的能力.结论:成功构建了重组pGEX-3X/hTSHα表达载体,其产物具有hTSHα抗原性.     

蛋白激酶CK2在信号转导中的作用及其与肿瘤发生的关系

蛋白激酶CK2是一种在真核细胞中普遍存在的信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶,可横向介导多条信号途径,以级联和垂直的方式发挥作用,调节细胞的生长和凋亡。其精细调控一旦失衡,可诱发肿瘤;而其特异性抑制剂和以其为靶向的基因治疗可抑制肿瘤。以CK2调节为中心的致瘤机制研究和以CK2为靶点的肿瘤药物开发具有重要的临床应用价值。     

重组人白细胞介素-7原核表达、纯化与理化性质鉴定

白细胞介素-7(Interleukin-7,IL-7)是骨髓基质细胞和胸腺基质细胞产生的细胞因子,能促进淋巴细胞(T、B和NK细胞)早期增殖和分化,还能诱导成熟巨噬细胞增殖,具有广阔的应用前景.我们构建了原核表达系统pET28a(+)-sfp-3C-rhil7,转化BL21(DE3)表达菌株,该菌株以包涵体形式稳定表达带his-tag和3C蛋白酶的rhIL7融合蛋白.通过CS(Chelating Sepharose Fast Flow)亲和层析、复性后3C蛋白酶酶切,CS去除标签,SPFF(Sepharose Fast Flow)精纯、S75(Superdex 75)去除部分聚集体等工艺制备的rhIL-7样品,纯度大于97%,活性显著高于R&D rhIL7标准品.     

重组人干扰素大肠杆菌高效表达系统的建立

目的:构建重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)原核表达系统,以获得rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达。方法:依据大肠杆菌遗传密码子频率表,在不改变氨基酸组成的情况下,人工半合成适于在大肠杆菌中表达的rhIFN-α2b编码序列;经PCR扩增后,克隆人表达型质粒载体pDH;筛选阳性菌落,温度诱导表达,表达产物行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹(WesternBlot)鉴定,并以人羊膜细胞-水泡性口炎病毒(WISH-VSV)系统鉴定rhIFN-α2b抗病毒活性。结果:PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定可见与预期大小符合的512bp的DNA条带;重组质粒pDH/IFN-α2b经序列分析,证实含有与预期相符且读码框架正确的hIFN-2b编码序列;SDS-PAGE可见与IFN-α2b分子质量大小一致的蛋白质条带,WesternBlot鉴定此条带为rhIFN-2b,其比活性达(1.8～2)×108U/mg。结论:rhIFN-α2b在大肠杆菌中的高效表达系统构建成功,且能高水平地表达出具有生物活性的rhIFN-α2b。     

sCR1在原核中表达、纯化、复性及活性鉴定

目的采用原核表达载体pET28a在E.coli BL21(DE3)中获得高表达、高活性的重组人sCR1融合蛋白。方法从人外周血中提取总RNA,应用RT-PCR获得人sCR1全长cDNA,将其克隆入原核表达载体pET28a中,构建含人sCR1的重组质粒(pET28a-sCR1),经测序鉴定正确,转化入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化后进行复性及生物学活性鉴定。结果获得原核表达载体pET28a-sCR1,经PCR鉴定及测序鉴定,得到重组E.coli BL21(DE3)克隆菌株,经IPTG诱导含有pET28a-sCR1的E.coli BL21(DE3)克隆菌,表达出重组人sCR1融合蛋白。此蛋白在SDS-PAGE上表现为Mr大于29000的蛋白区带,在Western blot分析中可被sCR1的CD35单克隆单抗体(mAb)识别。经Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化、复性后得到高纯度的sCR1融合蛋白表达及较高的生物学活性。结论人sCR1融合蛋白在E.coli BL21(DE3)表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。     

重组人干扰素α2a分离纯化中试工艺研究

目的探索无单克隆抗体亲和层析的重组人干扰素α2a分离纯化工艺。方法用 7mmol·L-1盐酸胍抽提干扰素 ,然后用金属螯合层析、离子交换层析、反相柱层析和凝胶过滤将提取的干扰素纯化。结果目标蛋白纯化了 195 1倍 ,蛋白比活性达 2 4 0× 10 8IU·mg-1,回收率达 30 1%。SDS PAGE检定呈一条带 ,其分子质量约为 19kD ,纯度大于 97%。结论本工艺降低了生产成本 ,易于扩大生产规模 ,适合产业化要求。     

9种蒽醌类衍生物对重组人蛋白激酶CK2活性的影响及构效浅析

目的观察9种蒽醌类衍生物对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响,并进行构效分析。方法将利用基因工程技术获得的重组人CK2α′及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶。通过测定药物作用后转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P的放射性活度,探讨蒽醌类衍生物对重组人CK2全酶活性的抑制作用,并采用半数效量概率单位法计算其IC50值。结果米托蒽醌、2-羧基蒽醌、1,2-二氨蒽醌、1,8-二羟蒽醌和醌茜能明显抑制重组人CK2全酶活性,其IC50值分别是0.66、0.81、8.81、28.76和61.26μmol·L-1;其中米托蒽醌、2-羧基蒽醌和1,2-二氨蒽醌的作用效果均强于目前已知的CK2抑制剂DRB和A3。1-氨基蒽醌和1-氯蒽醌对CK2的作用效果较弱,其IC50值分别为143.38和221.18μmol·L-1;而蒽醌和2-乙基蒽醌对CK2的活性则没有明显的影响。构效分析表明:C2上的-COOH、C8位上的-OH以及C2上的-NH2可能分别是2-羧基蒽醌、1,8-二羟蒽醌和1,2-二氨基蒽醌的药效基团;而C2上的-CH2CH3和C1上的-Cl可能分别是2-乙基蒽醌和1-氯蒽醌的非必需基团。结论米托蒽醌、2-羧基蒽醌和1,2-二氨蒽醌是3种较强的重组人蛋白激酶CK2的抑制剂。     

HPA、CK2β与HIF-1α在鼻咽癌组织中协同作用的研究

目的检测乙酰肝素酶(HPA)、蛋白激酶CK2β(CK2β)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在NPC组织中的表达的相关性,分析它们的相互关系。方法采用免疫组织化学染色技术Super-Vision法检测49例鼻咽癌(NPC)组织标本中HPA、CK2β及HIF-1α的表达水平。结果 HPA、CK2β与HIF-1α任意两者间在NPC组织中的表达均呈正相关关系(P0.05)。结论在NPC的发生发展过程中,HPA、CK2β和HIF-1α之间存在协同作用,三者之间可能产生一种"连锁效应"促进了NPC的发生发展。