白血病细胞雌激素受体α启动子CpG 岛甲基化状态的实验研究

目的 检测3种白血病细胞Jurkat、Molt-4、HL-60的雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)基因启动子ERα-A、ERα-B CpG岛甲基化状态,初步探讨ERα启动子区的甲基化状态以及与白血病发病机制的可能联系.方法 应用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测3种白血病细胞株与正常人外周血单个核细胞ERα启动子区ERα-A 和ERα-B启动子区CpG岛甲基化状态.结果 白血病细胞株ERα-A 和ERα-B均出现甲基化条带,为全甲基化状态;正常人外周血单个核细胞ERα-A 和ERα-B CpG岛呈现非甲基化状态.结论 ERα基因启动子ERα-A 和ERα-B CpG岛的甲基化状态有可能成为白血病新的分子诊断标记物.     

白血病细胞多巴胺受体基因甲基化研究

目的：探讨多巴胺受体（ＤＲＤ４）基因第一外显子中ＮｏｔＩ酶切位点甲基化与急性非洒巴细胞白血病（ＡＭＬ）的关系。方法：应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印记杂交与ＤＮＡ序列分析技术对ＡＭＬ患者骨髓标本进行分析。结果：在２７例白血病患者骨髓标本中１６例ＤＲＤ４基因甲基化（５９％），其中初治化疗敏感患者ＤＲＤ４基因甲基化发生率为５０％（９／１８），复发及难治患者甲基化发生率为７８％（７／９），而９例正常人骨髓标本ＤＲ     

白血病细胞雌激素受体多个启动子甲基化的实验研究

目的检测白血病细胞雌激素受体（estrogen receptors,ER）基因启动子区CpG岛甲基化状态情况,探讨雌激素受体基因多个启动子区包括ERα（ERα-A,-B and-C）和ERβ甲基化与其表达异常的联系。方法应用RT—PCR检测6种白血病细胞株以5′-杂氮-2-脱氧胞苷（5′-Aza-Dc）去甲基化前后ER基因表达活性并应用甲基化特异性PCR技术（methylation specific PCR,MSP）检测10例正常人白细胞和6种白血病细胞株以5′-Aza-Dc去甲基化前后ER基因甲基化状态。结果ER各启动子在白血病细胞株中均出现甲基化或半甲基化带,但只有ERα-A基因表达沉默而且在正常人白细胞中呈未甲基化状态,在以5′-Aza-Dc处理细胞株后ERα-A基因表达恢复。结论白血病细胞的雌激素受体基因启动子区存在高甲基化现象并导致其基因表达沉默,可能为白血病的致病机制分析提供了一个新的方向,提示ERα-A基因启动子CPG岛的甲基化有可能成为白血病的新的参考标记物。     

Hela细胞雄激素受体基因外显子1的甲基化检测

目的:检测Hela细胞雄激素受体(AR)基因外显子1的甲基化水平.方法:用亚硫酸氢盐克隆测序法和联合亚硫酸氢盐的限制酶法(COBRA)检测不同来源Hela细胞AR基因外显子1的甲基化水平,BiQ Analyzer软件分析测序结果.结果:在非CpG胞嘧啶转化率＞98％的前提下,Hela细胞AR基因外显子1片段的总甲基化率...     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。     

喉鳞状细胞癌中RASSF1A基因启动子区甲基化及蛋白表达

目的：探讨RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的关系。方法：运用甲基化特异性PCR,检测RASSF1A基因在48例喉癌组织、相对应癌旁组织及48例正常人外周血中的启动子区甲基化情况。用Western blotting方法检测喉癌组织、癌旁组织及正常人外周血中RASSF1A表达情况。结果：在48例喉癌组织、相对应的癌旁组织和48份正常人外周血中,RASSF1A基因启动子区分别有34例（70.83%）、11例（22.92%）和6例（12.50%）发生了甲基化, 喉癌组织甲基化程度明显高于癌旁组织和正常人外周血（P<0.05）。在48例喉癌组织中27例（56.25%）不能正常表达RASSF1A蛋白,而相对应癌旁组织中仅有8例（16.67%）,喉癌组织中RASSF1A蛋白的表达程度明显低于癌旁组织(P<0.01)。启动子区发生甲基化的34例喉癌组织中共有25例（73.53%）呈弱阳性,而7例未发生甲基化的喉癌组织中为1例（14.29%）,两组间比较差异具有显著性(P<0.05)。结论：RASSF1A基因启动子区甲基化与喉癌的发生有关,有望成为喉癌诊断的分子标志。     

宫颈癌细胞FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态分析

FHIT基因是一种与凋亡有关的肿瘤抑制基因,广泛存在于各种细胞凋亡系统中,在多种肿瘤及细胞系中失活,其启动子部位CpG岛甲基化是FHIT基因失活的主要机制之一。本研究应用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)对不同宫颈鳞癌细胞系FHIT基因启动子CpG岛甲基化状态进行检测,在分子水平上了解FHIT异常甲基化与宫颈癌的相关性,为宫颈癌去甲基化治疗提供依据。     

乳腺癌组织ABCG2基因启动子区甲基化状况与其表达

目的研究多药耐药基因ABCG2启动子区甲基化状态与其在乳腺癌组织中表达的关系，探讨ABCG2基因表达的表观遗传学机制。方法采用甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR，MSP）检测15例乳腺癌组织及配对癌旁组织中ABCG2启动子区-359--353两特异位点的甲基化情况，并经MSP产物测序检测位点的甲基化状态；用Q—PCR检测ABCG2基因mRNA的表达水平；并应用统计学Spearman等级相关性方法分析二者的相关关系。结果15例乳腺癌组织中有13例（86．67％）ABCG2基因启动子区的特异位点存在高甲基化（P〈0．05），MSP产物的测序验证了特异位点的甲基化，并且mRNA表达水平相对增高，二者之间存在显著正相关性（Х^2=0．6842，P〈0．05）。结论ABCG2基因的启动子区-359～-353位点存在高甲基化，可促进该基因在乳腺癌组织中的表达。     

白血病细胞系中WT1基因启动子区域DNA甲基化的研究

目的应用基于聚合酶链反应(PCR)的实验方法,研究白血病细胞系中WT1基因启动子区域的DNA甲基化水平及其与WT1基因表达的关系.方法采用RT-PCR技术及甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)技术,检测HL-60、Jurkat及KG-1等白血病细胞系中WT1基因mRNA表达水平及其启动子区域的DNA甲基化状态;以5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-aza-CdR)对启动子区域DNA高甲基化的U937细胞系进行去甲基化处理后,观察WT1基因表达水平的改变.结果 HL-60、K562、KG-1、NB4及SHI-1细胞系中WT1水平高表达,而Jurkat和U937细胞表达水平极低,同时检测到这两个细胞系存在WT1基因启动子区域DNA高甲基化;经去甲基化处理后,U937细胞系的WT1基因表达水平较未处理者升高.结论 WT1基因启动子区域DNA高甲基化是抑制其表达的机制之一.     

乳腺癌患者RASSF1A基因启动子区甲基化及临床意义

目的 探讨乳腺癌组织中RASSF1A（RAS association domain family 1A）基因启动子区CPG岛甲基化状态及临床意义。方法 用甲基化特异性PCR（MSP）检测40份乳腺癌组织和24份正常乳腺组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态。结果 乳腺癌组织中RASSF1A基因启动子区CPG岛甲基化率为45．0％（18／40），与正常乳腺组织比较差异有显著性（2／24）（P〈0.05），但与肿瘤病理类型、患者年龄、有无淋巴结转移的差异无显著性（P〉0．05）。结论 RASSF1A基因启动予区在乳腺癌中发生异常甲基化，为乳腺癌的候选基因。     

弥漫大B细胞淋巴瘤中TMS1基因启动子甲基化异常的研究

目的:研究弥漫大B细胞淋巴瘤中甲基化诱导沉默基因1(TMS1)基因启动子甲基化及其与弥漫大B细胞淋巴瘤不同细胞起源类型之间的相关性。方法:应用免疫组织化学方法检测40例弥漫大B细胞淋巴瘤石蜡包埋组织中CD10、Bcl6和MUM1的表达,并进一步区分生发中心与非生发中心B细胞起源类型;甲基化特异性PCR技术检测TMS1基因启动子甲基化状态。结果:弥漫大B细胞淋巴瘤40例中,生发中心B细胞起源16例,非生发中心B细胞起源24例。弥漫大B细胞淋巴瘤14例中存在TSM1/ASC基因异常甲基化,其中生发中心B细胞起源2例(12.5%),非生发中心B细胞起源12例(50.0%),两者阳性率比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:TSM1基因启动子甲基化在弥漫大B细胞淋巴瘤中常见,且对非生发中心B细胞起源发生进展更为重要。     

动脉粥样硬化AR基因甲基化修饰的初步探讨

目的:探讨雄激素受体(AR)基因CpG岛(CCGG)胞嘧啶甲基化模式与动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)的关系. 方法:应用甲基化敏感的限制性内切酶及聚合酶链式反应(PCR)对96例动脉粥样硬化患者、91例正常对照人群AR基因CpG岛甲基化模式进行比较,并进行分析. 结果:男性患者AR基因CpG岛甲基化程度较男性对照组为低(P<0.05);女性患者AR基因CpG岛甲基化程度较女性对照组差异无显著(P>0.05);男性患者与女性患者相比较,男性患者AR基因CpG岛甲基化程度较低(P<0.05);男性对照与女性对照的甲基化模式差异无显著(P>0.05). 结论:AR基因CpG岛存在的低甲基化模式对AS诊断有一定的临床意义.     

Mutations in the androgen receptor gene of seven Chinese patients with complete androgen insensitivity syndromes

Androgenplaysanimportantroleinthenormaldevelopmentofmalephenotypeandtheregulationofvirilization.Theseactionsofandrogenaremediatedbytheintracellularandrogenreceptor(AR)containingN--terminal,DNAuandsteroidbindingdomains.MutationsintheARgenecancausevariousdegreesofandrogenInsensitivitysyndromes(AlS)inpatientswith46,XYkaryotype.ThephenotypeofpatientswithAlSrangesfromcompletefemaleexternalgenitalia(completeAlS,CAIS)overgenitalambiguity(partialAlS,PAlS)totheinfertilewithnormalmaleornearlys…     

3种结肠癌细胞株中DLC-1基因的表达及其启动子区的甲基化状态研究

目的:研究候选抑癌基因DLC-1在结肠癌细胞株中的表达及其启动子区的甲基化状态,初步探讨结肠癌细胞株DLC-1基因表达水平与其启动子区甲基化的相关性.方法:采用RT-PCR技术分别检测DLC-1基因在人结肠癌细胞株CaCo-2、HT-29和LoVo中的表达水平;应用甲基化特异性PCR(MSP)方法和亚硫酸氢盐修饰DNA测序检测启动子区域甲基化状态;分别用0、5、10 μmol·L-1浓度的去甲基化药物5氮杂胞苷处理DLC-1基因启动子区域高甲基化状态细胞后,再检测DLC-1基因mRNA表达水平.结果:人结肠癌细胞株CaCo-2和LoVo中DLC-1 mRNA呈阳性表达,HT-29中的表达呈阴性表达;CaCo-2和LoVo细胞DLC-1基因启动子区域未发生甲基化,而HT-29出现启动子区高甲基化状态;经5氮杂胞苷药物干预后,HT-29结肠癌细胞的DLC-1基因表达明显增强.结论:结肠癌细胞株HT-29中DLC-1基因表达沉默与启动子区高甲基化状态有关.     

雄激素受体反义RNA对前列腺癌细胞雄激素受体表达的抑制作用研究

目的 观测雄激素受体（AR）反义RNA逆转录病毒表达载体在前列腺癌细胞中的表达及其对AR表达的影响。方法 将AR反义RNA逆转录病毒表达载体导入前列腺癌细胞株LNCaP，PCR检测AR目的片段在重组LNCaP细胞基因组中的存在，RT－PCR检测AR反义RNA表达和AR mRNA水平，Western blot检测AR蛋白表达水平。结果 PCR在LNCaP^as-AR基因组DNA中扩增出了AR目的片段，表明AR目的片段整合到了细胞基因组。RT－PCR证实LNCaP^as-AR有AR反义RNA表达，且其AR mRNA水平较LNCaP和空载体转染的LNCaP^Neo显著下调（P＜0.05)，Western blot证实LNCaP^as-AR细胞AR蛋白含量显著下降（P＜0.05)。结论 AR反义RNA可抑制前列腺癌细胞AR表达。     

非甾体类雄激素受体拮抗剂的研究进展

研究发现,雄激素受体与前列腺癌的发生存在密切关系。雄激素拮抗疗法成为临床治疗早期前列腺癌的有效手段,近20年来已有多个药物上市（如氟他胺、羟基氟他胺和比卡鲁胺等）,但这些经典的药物在治疗中易产生抗雄激素撤除综合症等问题,因此其应用受到限制。目前,新近研发的非甾体类雄激素受体拮抗剂（如RD162、MDV3100和BMS-641988）活性更强,正进行临床试验,并有望解决过去雄激素受体拮抗剂存在的问题。查阅国内外相关文献,对已上市药物、当前临床研究的药物以及近年发现的小分子雄激素受体抑制剂的研究进展进行综述。     

Study of Androgen and Androgen Receptor in Relation to Insulin Resistance in Polycystic Ovary Syndrome

Polycystic ovary syndrome (PCOS) is the mostcommon endocrinopathies of premonopausal womenwith the incidence rate being5 % to2 1 % [1,2 ] .Thedisorder is characterized by anovulation,hyperandro-genism,hyperinsulinism and obesity.Many studiessuggested that insulin resistance play an importantrole in the pathogenesisof PCOS,butthere wasveryfew investigations about androgen and androgen re-ceptor in relation to insulin resistance.The purposeof this study was to investigate the role of serum an…     

急性髓性白血病降钙素基因甲基化定量研究

为探讨降钙素（ＣＴ）基因高甲基化能否作为急性髓性白血病（ＡＭＬ）微小残留病（ＭＲＤ）的检测指标。采用设有内、外参照的聚合酶链反应（ＰＣＲ），结合限制内切酶和激光扫描技术，检测了４０例ＡＭＬ患者骨髓细胞的ＣＴ基因５′端甲基化率（ＣＴＭＲ）。结果：初发ＡＭＬ患者ＣＴＭＲ为５２５％±１９３７％，显著高于对照组（８１％±３７３％；Ｐ＜００００５），部分缓解（ＰＲ）组显著高于对照组而显著低于初发组；完全缓解（ＣＲ）组显著高于对照组而与ＰＲ组差别无显著性；ＡＭＬ患者的ＣＴＭＲ与骨髓白血病细胞数呈显著正相关（ｒ＝０．７１５，Ｐ＜０００１），ＣＲ组１６例中４例ＣＴＭＲ在５０％以上，分别于２、４、４５和９个月后复发。结果提示：ＣＴＭＲ有可能成为检测ＡＭＬ微小残留病的有用指标     

核转出蛋白对前列腺癌雄激素受体稳定性的调节

目的：探讨位于雄激素受体(androgen receptor, AR)配体结合域中具有出核转运信号肽的核转出蛋白(nuclear export signal of androgen receptor, NESAR)对前列腺癌雄激素受体蛋白表达和稳定性调节的机制。方法：绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合蛋白表达载体pEGFP-AR(1-918aa),pEGFP-NESAR(743-817aa),pEGFP-NAR (1-665aa)和pEGFP-NAR-NESAR,及NESAR的赖氨酸突变体（赖氨酸K突变为精氨酸R）pEGFP-NESAR K776R,pEGFP-NESAR K807R和pEGFP-NESAR K776R/K807R,瞬时转染前列腺癌细胞PC3后,采用荧光显微镜、蛋白质免疫印迹和免疫沉淀,检测NESAR对雄激素受体稳定性的调节。结果：在荧光显微镜下,含NESAR的融合蛋白呈胞浆定位,荧光信号强度比不含NESAR的融合蛋白明显减弱,且含NESAR的融合蛋白表达水平显著低于不含NESAR的融合蛋白表达水平。在蛋白合成抑制剂放线菌酮处理下,GFP-NESAR和GFP-NAR-NESAR的半衰期小于6 h,而对照GFP和GFP-NAR的表达相对更稳定,半衰期大于24 h。融合蛋白GFP-NESAR在蛋白酶体抑制剂MG132的处理下,其蛋白表达显著增加,并呈现剂量依赖性,而MG132对GFP蛋白稳定性没有显著影响;在蛋白合成被抑制的情况下,MG132同样显著抑制了GFP-NESAR融合蛋白的降解,且蛋白表达呈剂量依赖性的增加。GFP免疫沉淀的结果显示,GFP-NESAR融合蛋白的泛素化水平明显高于GFP对照。赖氨酸位点K776和K807突变的NESAR的泛素化水平显著降低,且蛋白稳定性提高,赖氨酸位点K776和K807是介导NESAR发生泛素化的关键氨基酸残基。结论：核转出蛋白NESAR具有降解不稳定性,作为多聚泛素化修饰的识别信号,介导了其融合蛋白在前列腺癌细胞中通过泛素-蛋白酶体途径的降解。本研究为AR蛋白水平和/或活性的调控开辟一种新的研究思路,有助于对AR降解分子机制的了解和在前列腺癌产生去势抗性的过程中对AR靶向的密切调控。