应用荧光蛋白标记技术对体外构建组织工程软骨的监测

目的: 应用荧光蛋白标记细胞的技术, 对组织工程软骨体外构建过程进行活细胞的实时示踪。方法: 采用逆转录病毒载体pLEGFP N1对人间充质干细胞进行荧光蛋白标记, 以同期培养未标记细胞为对照组, 体外构建细胞 材料复合体, 通过倒置荧光显微镜和扫描电镜观测种子细胞在支架材料内的分布与数量, 并对培养 7d的两组复合体进行细胞数量比较。结果: 逆转录病毒载体pLEGFP N1成功标记间充质干细胞, 并应用于工程化组织体外构建的示踪; 第 7d标记组细胞数 (3. 4±0. 1)×106 /个复合体, 未标记组细胞数 (3. 6±0. 1)×106 /个复合体, 两组数据无统计学差异(P=0. 339)。结论: 采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记, 不影响细胞在材料内的增殖, 对体外构建组织工程软骨具有良好的示踪作用。     

纤维蛋白凝胶种植技术在组织工程软骨体外构建中的应用

目的探讨纤维蛋白凝胶种植技术应用于体外构建组织工程软骨,从而改善目前常规构建技术的缺陷。方法首先采用逆转录病毒pLEGFP-N1对人间充质干细胞进行荧光蛋白标记,然后分别应用纤维蛋白凝胶种植技术(A组)和沉淀种植技术(B组),体外构建细胞-材料复合体,通过倒置荧光显微镜和扫描电镜等观测种子细胞在支架材料内的分布与数量。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记间充质干细胞,并应用于工程化组织体外构建的示踪;A组细胞在材料内分布更均匀、数量更多,构建第2天细胞数量为(3·53±0·18)×106/个复合体,而B组细胞为(0·88±0·13)×106/个复合体,两组数据差异非常显著(P<0·01)。结论纤维蛋白凝胶种植技术简单易行,可以改善种子细胞在软骨支架材料内的分布,并提高细胞密度,为体外高效构建组织工程软骨创造了条件。     

应用荧光蛋白示踪组织工程骨体外构建的实验研究

目的应用荧光蛋白标记技术对组织工程骨体外构建过程进行细胞示踪。方法采用逆转录病毒pLEGFP-N1对种子细胞进行荧光蛋白标记,以羟基磷灰石为支架材料,体外构建细胞-材料复合体,测定细胞的粘附率。通过倒置荧光显微镜,定期观察种子细胞在支架材料内的分布。结果逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记人骨髓基质干细胞(BMSCs),并对组织工程骨的体外构建和4周的体外培养进行了良好示踪;标记细胞的粘附率为(90.3±2.1)%,无标记处理细胞的粘附率为(92.0±1.5)%,两组数据差异无显著性意义(P=0.236)。结论采用逆转录病毒介导方式对种子细胞进行荧光蛋白标记后,细胞在材料内仍维持较高的粘附能力,这有利于对体外构建和长期培养组织工程骨时进行种子细胞示踪。     

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的 探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数.方法 抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2 代BMSCs,以5.0×107/cm3 的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7 d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养.8周后取材,行相关检测.结果 力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质 ,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分.GAG含量为(6.0±1.2) mg/g,抗压强度为 (2.2±0.8) kPa,弹性模量为(7.4±1.6) kPa.各项指标均明显优于其他各组.结论 力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨.     

力学刺激促进骨髓基质干细胞体外软骨分化

目的探讨离心力刺激对猪骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成软骨分化的作用,以及对三维支架上构建组织工程化软骨的影响,明确力学刺激与细胞分化及组织形成的关系,为体外软骨构建提供适当参数。方法抽取8周龄猪髂嵴骨髓,应用贴壁法分选单个核细胞,体外培养扩增后获得第2代BMSCs,以5.0×107/cm3的细胞密度接种到聚羟基乙酸(PGA)制成的圆柱形三维支架上,7d后分成4组,在不同的力学条件及诱导条件下培养。8周后取材,行相关检测。结果力学诱导组形成的组织呈白色,细腻光泽,形状规则,体积无明显改变,有良好的弹性和硬度,并具有典型的软骨陷窝结构和大量软骨特异性细胞外基质,Ⅱ型胶原及丰富的聚合蛋白多糖(GAG)成分。GAG含量为(6.0±1.2)mg/g,抗压强度为(2.2±0.8)kPa,弹性模量为(7.4±1.6)kPa。各项指标均明显优于其他各组。结论力学刺激有利于促进BMSCs成软骨分化,并在三维支架材料上构建组织工程化软骨。     

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.     

大鼠骨髓间充质干细胞与多孔双相磷酸钙陶瓷支架体外黏附的实验研究

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(marrowmesenchymalstemcells,MSCs)诱导培养后在多孔双相磷酸钙(biphasiccalciumphosphate,BCP)陶瓷支架材料上的黏附和生长。方法SD大鼠MSCs经矿化诱导培养、扩增,具有成骨细胞表型后,与多孔BCP陶瓷支架及普通多孔羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)陶瓷支架体外复合培养,扫描电镜观察比较MSCs在两种材料支架表面的黏附数量和形态;同时以0.5、1.0、2.0、3.0和4.0×106/ml浓度细胞悬液接种于多孔BCP支架材料,检测适宜的接种浓度及单位体积支架材料可黏附MSCs数量。结果大鼠MSCs经诱导培养14d后,行矿化沉积茜素红染色、型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶细胞化学染色,结果均为阳性。大鼠MSCs黏附于多孔BCP陶瓷上的细胞数(88.00±6.58)明显高于HA陶瓷组(39.00±3.65),两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。当接种浓度为2.0×106/ml时,单位体积的陶瓷支架材料最多可黏附MSCs数量为1.28×107个/cm3,为细胞适宜接种浓度。结论大鼠MSCs在体外经矿化诱导培养可表达成骨细胞表型,细胞浓度为2.0×106/ml时与多孔BCP陶瓷支架材料具有良好的黏附能力。     

骨髓基质干细胞与软骨脱细胞基质多孔支架异位构建组织工程化软骨的实验研究

目的 探讨骨髓基质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)与软骨脱细胞基质多孔支架(cartilage ECM-derived porous scaffold,CEDPS)在裸鼠体内异位构建软骨的可行性,并建立利用PKH26荧光和分子荧光活体成像系统无创评估组织工程化细胞-支架复合体在体内生长情况的新方法.方法 PKH26荧光标记成软骨诱导的BMSCs,接种入CEDPS支架,体外进行电镜、Desd/Live荧光染色观察,然后植入裸鼠背部,4周后利用分子荧光活体成像系统无创伤性评估组织工程化组织在裸鼠体内生长情况,取材进行组织学以及Ⅱ型胶原免疫荧光检测,与荧光图像比较.结果 体外培养的BMSCs-CEDPS复合体电镜检查结果表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞基质分泌增加,Dead/Live染色表明BMSCs在支架内部活性良好.4周后活体荧光示踪显示BMSCs在支架内生长良好,无扩散趋势,BMSCs-CEDPS复合体在裸鼠体内生成软骨样组织,番红"O"、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,免疫荧光检查表明构建的软骨样组织内的细胞来源为接种的PKH26标记的BM-SCs.结论 利用BMSCs和CEDPS支架能够在裸鼠皮下异位构建类软骨样组织.PKH26标记与分子荧光活体成像系统结合,能够无创伤性评估组织工程化组织的种子细胞在动物体内生长情况与转归.     

骨髓间充质干细胞种植Ⅰ型胶原支架材料修复关节软骨缺损的初步研究

目的研究骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)种植在Ⅰ型胶原支架材料(type Ⅰ collagen-glycosaminoglycan,CG)上,软骨定向诱导后修复关节软骨缺损的可能性.方法将来源于10只成年实验犬骨髓的贴壁细胞培养传代至第3代,收集后以2×106密度种植于直径9 mm,厚3 mm(干样品尺寸)干热交联处理(dehydrothermal treatment,DHT)的CG材料中,软骨诱导培养基诱导培养21 d.观察每日细胞-材料复合体直径与初始直径的百分比,反应其收缩性.Ⅱ型胶原及平滑肌肌动蛋白(smooth muscle actin,SMA)免疫组织化学染色观测体外软骨形成情况.将体外诱导培养的细胞-材料复合体植入实验犬膝关节软骨缺损模型,12周后取材观察.结果诱导培养过程中细胞材料复合体直径随时间延长而下降.21 d后,细胞-材料复合体收缩至初始直径的64.4%±0.3%;组织学见:材料的孔隙收缩,新合成的基质使细胞-材料复合体的多数区域变为实体组织;Ⅱ型胶原及SMA染色阳性.植入实验犬膝关节软骨缺损12周后,犬膝关节功能恢复,关节软骨缺损处有软骨样组织填充.结论将MSCs种植于CG材料中,经软骨诱导培养后并植入软骨缺损后能形成含有Ⅱ型胶原的软骨样实体组织.     

关节软骨细胞三维支架双相接种体外生成软骨组织的观察

目的联合应用自制生物凝胶和三维支架材料,建立组织工程种子细胞的三维支架双相接种技术,并对其构建生成组织工程关节软骨的效果进行初步观察。方法酶消化法分离幼兔关节软骨细胞,于培养瓶中接种、培养,收集第1代软骨细胞,以2.5×107/ml加入液态的自制生物凝胶液中充分混均,制成细胞-凝胶混悬液,接种于CPPf/PLLA(caliumpolyphosphatefiber/poly-L-lacticacid)三维支架材料中,经固化后形成工程化组织块,体外连续培养4周。行大体、倒置显微镜以及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化光镜观察,二甲基亚甲蓝显色法定量检测硫酸糖胺多糖含量。结果(1)细胞-凝胶混悬液接种后完全充满CPPf/PLLA支架的孔隙,固化后三者很好地形成一个工程化组织整体。构建的工程化组织块在培养过程中不仅能够保持其初始外形,而且能保持种子细胞稳定的三维均相分布,无细胞脱落现象。同时,硬度亦不断增加,有弹性,表面湿润、光滑。(2)随着培养时间的延长,软骨组织的形成是由外周向中心进行。培养2周后,逐渐形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的成熟工程化软骨。同时,Ⅰ型胶原逐渐转为阴性,支架材料亦不断降解。4周时硫酸糖胺多糖含量平均为(15.70±2.00)mg/g(湿重),为天然关节软骨的30%以上。结论种子细胞的三维支架双相     

胸腰椎骨折椎弓根内固定断裂与植骨融合方式的相关性分析

[目的]探讨胸腰椎骨折椎弓根螺钉内固定系统内固定术后,椎弓根螺钉断裂与植骨融合方式之间的关系,以探讨胸腰椎骨折植骨融合的最佳方式。[方法]回顾性研究1995年5月~2005年12月本院脊柱外科收治的胸腰椎骨折病人197例,其中A组单纯内固定(不植骨)患者14例,B组“H”形椎板植骨21例,C组横突间植骨67例,D组椎间、椎内联合横突间植骨95例。[结果]术后随访6~32个月,内固定断裂12例,其中A组4例,B组3例,C组5例,D组0例,4组中D组内固定断裂率显著低于其他3组(P<0.05)。[结论]椎间、椎体内联合横突间植骨重建脊柱三柱的稳定性,符合人体生物力学原理,能有效降低内固定断裂的发生。     

On the measurement of the functional properties of the CFTR

A number of methods are currently employed to assess the functional properties of CFTR channels and their response to pharmacological potentiators, correction of the defective CFTR trafficking, and vectorial introduction of new proteins. Here we review the most common methods used to assess CFTR channel function. The suitability of each technique to various experimental conditions is discussed.     

The Measurement of the Inclination Angle of the Hamate and Analysis of the Inclination Angle for the Rotation Deformity of the Little Finger in the Fixation of the Carpometacarpal Joint

ObjectiveComplex base fractures of the fifth metacarpal bone and dislocation of the fifth carpometacarpal joint are more prone to internal rotation deformity of the little finger sequence after fixation with a transarticular plate. In the past, we have neglected that there is actually a certain angle of external rotation in the hamate surface of transarticular fixation. This study measured the inclination angle of the hamate surface relative to the fifth metacarpal surface for clinical reference.MethodsIn a prospective single‐center study, we investigated the tilt angle of 60 normal hamates. The study included thin‐layer computed tomography (CT) data from 60 patients from the orthopaedic clinic and inpatient unit from January 2017 to March 2020, including 34 men and 26 women who were 15~59 years old, average 35 years old. The CT data of 60 cases in Dicom format of the hand was input into Mimics and 3‐Matics software for three‐dimensional (3D) reconstruction and measuring the angle α between hamate surface and the fifth metacarpal surface. According to the possible placement of the transarticular plate on the fifth metacarpal surface, we measured the angle β between the hamate surface 1 and the fifth metacarpal surface and the angle γ between the hamate surface 2 and the fifth metacarpal surface.ResultsThe average angle between the hamate surface and the fifth metacarpal surface was 11.66°. The hamate surfaces 1 and 2 have an external rotation angle of 7.30° and 7.51° on average with respect to the fifth metacarpal surface, respectively. There is no statistically significant difference in the angles between the two groups (P > 0.05).ConclusionsThe horizontal angle of the dorsal side of the hamate is different from the back of the fifth metacarpal surface, and the hamate has a certain external rotation angle with respect to the fifth metacarpal surface. No matter how the transarticular plate is placed, the plate always has a certain external rotation angle relative to the fifth metacarpal surface. When the fixation is across the fifth carpometacarpal joint, if the plate does not twist and shape, it will inevitably cause internal rotation of the fifth metacarpal, resulting in internal rotation deformity of the little finger sequence.     

静脉输注甘露醇开放血脑屏障对抗生素透过血脑屏障的影响

目的　通过快速静脉输注甘露醇可逆性开放血脑屏障 (BBB) ,探知此方法能否增加抗生素透过BBB的量 ,在何时达到最高峰 ,其通透量增加后临床上有无不良反应。方法　采用自身配伍设计 ,共 6个样本组。对照组仅使用抗生素 ;其余 5组分别在使用甘露醇前 60、3 0min ,同时使用甘露醇后 3 0、60min使用抗生素 ,各组皆取使用抗生素后 1h的脑脊液测其抗生素浓度。抗生素选用头孢三嗪。结果　测量值经过q检验 ,经 2 0 %甘露醇处理前后的CSF中的头孢三嗪浓度差异有非常显著性。全组患者经临床观察未出现神经系统的不良反应。结论　经静脉快速输注2 0 %甘露醇后可以使透过BBB的水溶性抗生素的量增加 ,两者使用的顺序是在抗生素使用 3 0min内即给予甘露醇快速滴注。该方法不会增加低神经毒性抗生素在中枢神经系统的不良反应。     

三角韧带损伤的手术治疗

[目的]探讨踝关节三角韧带损伤的手术治疗及效果。[方法]2002年4月-2005年4月治疗伴有三角韧带损伤的踝关节骨折40例，均采用切开复位和坚强内固定，并修复重建三角韧带，恢复踝关节内外侧结构的稳定性。下胫腓联合分离仍不稳定者，给予皮质骨螺钉横向内固定。[结果]全部病例得到16个月-3a随访，平均1．5a。按齐氏疗效评定标准：优良30例，可8例，差2例，优良率75％。[结论]强调踝关节骨折切开解剖复位，坚强内固定的同时，应充分重视修复重建三角韧带。     

Preservation of the pylorus and resection of the head of the pancreas

The historical evolution of the pylorus-preservation resection of the head of the pancreas is traced from the first resections early in this century to relative standardization of the operation, to a lowering of the operative mortality, and to an interest in improving nutritional status after resection. There are many theoretical advantages for the function of the upper gastrointestinal tract after pylorus and gastric preservation, such as maintenance of gastric capacitance and equilibration of osmotic pressure in gastric digestants, foodstuff digestion and absorption, and bowel motility. After the pylorus-preserving resection, gastric emptying is normal, pyloric function to prevent duodenal reflux is often normal, and gastric acids and serum levels of duodenal hormones are at normal levels, whereas after standard pancreatoduodenectomy, all of these are often abnormal. No prospective blinded studies have been published comparing nutritional values after the two operative procedures, but evidence is presented of a satisfactory result with regard to gastric capacitance, body weight gain, and lack of postgastrectomy symptoms. An undoubted advantage of the pylorus-preserving feature is a simplification of the operation. These gains are achieved without increase in operative mortality, without increase in the incidence of jejunal ulcer, and without theoretical or actual decrease in value of the procedure as a cancer operation, except in patients with duodenal carcinoma proximal to the ampulla of Vater.     

下颌全牙弓后移量及最后界的测量

目的：研究下颌牙弓的有效后移量及找寻下颌牙弓移动的后界。方法：选取涉及拔除下颌第三磨牙或下颌第三磨牙缺失的病例18例（男6例,女12例）。采用种植支抗牵引下牙弓向远中,治疗完成时所有病例均明确到达下颌牙弓后界,即下颌第二磨牙远中到达下颌升支前缘软组织交界处。应用治疗前后的曲断片测量下颌第二磨牙远中到升支前缘的距离。结果：下颌第二磨牙后移量为（3.49±1.21）mm;治疗后磨牙后间隙的长度为（4.43±0.97）mm。结论：下颌牙弓可确定性地实现整体后移;最大后移量由磨牙后间隙的长度决定;其最后界止于下颌第二磨牙远中与下颌升支前缘软组织交界处。