氯霉素-BSA和氯霉素-OVA偶联物的制备与鉴定

目的：制备氯霉素（CAP）-牛血清闩蛋白（BSA）及氯霉素（CAP）-卵清白蛋白（OVA）的偶联物并进行鉴定。方法：分别采用混合酸酐法和重氮化法制备CAP—BSA及CAP—OVA的偶联物，前者是将CAP先与琥珀酸酐反应生成CAP-半琥珀酸酯（CAP—HS），再进行混合酸酐反应。将反应产物CAP—HS与BSA结合，合成CAP—HS—BSA偶联物；后者是将CAP分子中的苯环上的硝基还原为氯基后，进行重氮化处理，然后分别与BSA和OVA连接，合成CAP—BSA和CAP—OVA复合物。结果：紫外图谱分析表明，CAP—BSA、CAP—OVA和CAP—HS—BSA的紫外最大吸收峰分别是262nm、213nm和275nm；计算得CAP与载体蛋白BSA、OVA及HS的偶联比分别为5：1、12：1和22：1。结论：成功的制备CAP—BSA及CAP—OVA的偶联物，为免疫动物制备抗CAP的抗体奠定了基础。     

多菌灵人工抗原的合成及其鼠源性多克隆抗体的制备

目的 合成多菌灵人工抗原,制备多菌灵多克隆抗体并鉴定其特性。方法 利用混合酸酐法引入羧基制备多菌灵半抗原。将小分子半抗原与大分子载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成多菌灵人工抗原和包被抗原,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对人工抗原进行鉴定。用制备的人工抗原免疫小鼠获得抗多菌灵多克隆抗体,利用间接ELISA对抗体效价以及特异性进行测定。结果 成功制备多菌灵人工抗原。免疫小鼠后获得的抗体效价可达1∶12 800。抗体对多菌灵的半数抑制剂量(IC₅₀)为0.107μg/mL,且与苯菌灵、噻菌灵的交叉反应率均<1%。结论 成功获得高敏感性、高特异性的多克隆抗体,为多菌灵残留快速检测方法的建立奠定了基础。     

苏丹红Ⅳ和柠檬黄人工抗原的制备与鉴定

目的:制备并鉴定苏丹红Ⅳ和柠檬黄人工抗原.方法:琥珀酸酐法构建苏丹红Ⅳ半抗原;以牛血清蛋白(BSA)为载体,用活性脂法分别与苏丹红Ⅳ半抗原和柠檬黄进行偶联.并用紫外吸收色谱法和电泳凝胶色谱鉴定制备是否成功.结果:经紫外吸收和摩尔吸收系数法估算得到苏丹红Ⅳ与BSA的偶联比31∶1,柠檬黄与BSA的偶联比17∶1.结论:成功制备出苏丹红Ⅳ和柠檬黄的人工抗原.     

甲氰菊酯人工抗原的合成和鉴定

目的 合成与鉴定甲氰菊酯的人工抗原.方法 通过水解、酰化、酯化等反应合成了甲氰菊酯的半抗原2,2,3,3.四甲基环丙烷羧酸-a-(N-丁酸基)-甲酰氨-3-苯氧基苄酯(Ⅳ)和2,2,3,3-四甲基环丙烷羧酸-a-羧基-3-苯氧基苄酯(Ⅲ).通过碳二亚胺法将半抗原Ⅳ与牛血清蛋白(BSA)偶联制备免疫抗原,通过混合酸酐法将半抗原Ⅲ与卵清蛋白(OVA)偶联制备包被抗原.结果 用质谱和核磁共振对Ⅲ和Ⅳ进行结构表征,合成产物为目标物.紫外光谱法鉴定结果表明,免疫抗原和包被抗原都发生了有效偶联,偶联比38:1和15:1,免疫抗原通过免疫新西兰大白兔得到的抗体效价为5.12×105.结论成功的合成了甲氰菊酯的人工抗原,为其免疫方法的建立奠定了基础.     

百草枯人工抗原的合成及抗体的制备

目的: 制备百草枯人工抗原和抗血清, 为建立酶联免疫吸附法提供技术储备.方法: 以4, 4'-联吡啶和碘甲烷为起始原料, 于暗处通氮气保护下合成了百草枯半抗原; 混合酸酐法偶联大分子蛋白载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)制备免疫抗原和包被抗原; 免疫新西兰大白兔, 制备多抗.结果: 合成的半抗原经HPLC-MS、 1HNMR和IR鉴定, 初步确定合成成功; 百草枯半抗原与BSA和OVA的结合比分别为19∶ 1和14∶ 1; 抗血清经间接ELISA法检测, 效价达1∶ 2.56×104, 经饱和硫酸铵沉淀法纯化后抗体的效价达1∶ 5.12×104.结论: 合成的百草枯人工抗原具有较好的免疫原性, 为百草枯酶联免疫检测(ELISA)试剂盒的研制提供了基础.     

25-羟基维生素D3人工完全抗原的合成与鉴定

目的:合成25-羟基维生素D3人工完全抗原,并制备抗25-羟基维生素D3的特异性抗体。方法:将25-羟基维生素D3进行化学修饰加入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯。采用碳二亚胺法,将25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯,分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工完全抗原25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA和25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-OVA。通过紫外吸收光谱,SDS-PAGE和MALDI-TOF进行偶联鉴定。用25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯-BSA免疫小鼠,获得抗25-羟基维生素D3抗体免疫血清。结果:25-羟基维生素D3-半琥珀酸酯与BSA的偶联比为(12±0.16)∶1,免疫小鼠后获得高效价(效价为6.25×10-4)的抗体,且标准品浓度在37.5～600 ng/mL范围具有显著的竞争性线性关系,检测的灵敏度为37.5 ng/mL。结论:成功合成了25-羟基维生素D3人工完全抗原,制备出25-羟基维生素D3的抗体且其线性关系显著,灵敏度较高,为进一步研制检测25-羟基维生素D3的试剂盒奠定了基础。     

恩诺沙星完全抗原的制备试验

目的制备恩诺沙星(EF)的完全抗原,进而为EF单克隆抗体检测试剂盒的研制奠定基础。方法将小分子的药物EF和鸡血清白蛋白(OVA)以及牛血清白蛋白(BSA)分别采用碳二亚胺法和活化酯法两种不同的偶联方法合成完全抗原,通过紫外特征光谱和抗血清效价对完全抗原的合成效果进行分析。结果2种不同的偶联方法均使OVA和BSA与EF偶联成功。偶联方法对于完全抗原的合成效果也存在差异,从紫外吸光率和偶联物结合比判断,OVA采用活化酯法效果好,未经EDA处理的OVA、活化酯法和碳二亚胺法合成的偶联物的结合比分别为10.3、20.7、16.5;而BSA采用碳二亚胺法效果好,未经EDA处理的BSA、活化酯法和碳二亚胺法合成的偶联物的结合比分别为20.5、24.6和30.8。血清效价检测发现,以BSA-EF为完全抗原的效价为25600,以OVA-EF为完全抗原的效价为6400,这表明完全抗原的合成是成功的。结论2种不同方法合成的OVA-EF和BSA-EF完全抗原,可以作为免疫原用于制备抗体以及检测时的包被原进行ELISA检测。     

特异性免疫磁珠联合毛细管电泳技术检测蛋白质的方法探讨

目的 尿液蛋白的检测在疾病的诊断、监测和疗效评估中发挥着重要作用.目前常用的蛋白检测方法无法检测尿液低浓度蛋白.为了实现对尿液低浓度蛋白的检测,使其应用到临床诊断等方面,本实验室尝试应用特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白.本实选择β-actin单克隆抗体来制备特异性免疫磁珠对该方法进行可行性探讨和方法学研究.方法 将β-actin单克隆抗体以共价偶联的方式包被到羧基磁珠表面,用含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液封闭磁珠,获得特异性β-actin免疫磁珠.使用pH 10.0的0.02mol/L硼砂溶液对β-actin免疫磁珠进行洗脱,将洗脱液进行毛细管电泳,验证免疫磁珠是否制备成功.结果 β-actin免疫磁珠洗脱液的毛细管电泳图中可见到β-actin抗体峰和BSA峰,结果表明β-actin抗体与羧基磁珠偶联成功以及BSA封闭羧基磁珠成功.结论 本实验成功的制备了特异性β-actin免疫磁珠,并应用毛细管电泳方法进行相关验证,此实验为特异性免疫磁珠联合毛细管电泳方法检测尿液低浓度蛋白奠定了基础.     

β-Netrin抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的:制备抗神经细胞突起生长诱向因子(β-Netrin)的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:应用GoldKey软件分析人βNetrinC末端结构域氨基酸的序列(共114个氨基酸),确定抗原表位并人工合成多肽。然后采用碳化二亚胺法,将合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行HAT选择培养,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞并克隆化。对分泌的mAb的效价、Ig亚类(型)及特异性,分别用间接ELISA和Westernblot进行鉴定。同时,通过免疫细胞化学染色鉴定抗体的特异性。另外,以偶联的分子免疫新西兰白兔,制备抗β-Netrin的pAb,用Westernblot鉴定其特异性。结果:以确定的此16个氨基酸的序列NH2-FRGKRT-LYPESWTDRG-COOH作为抗原表位,以人工合成多肽与BSA偶联作为免疫原,获得3株可稳定分泌特异性抗β-Netrin mAb的杂交瘤细胞。免疫细胞化学染色结果表明,这3株抗体均能特异性地识别细胞中的抗原。另外,制备了高效价的抗β-Netrin的pAb,并能特异性地识别原核表达的β-Netrin蛋白。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功地制备出抗β-Netrin的pAb和mAb。     

蛙皮素单克隆抗体的制备

蛙皮素(Bombesin,MW 1620)是癌细胞自分泌生长因子之一。为肽类半抗原。在交联剂羰二亚胺(ECDI)作用下与牛血清白蛋白(BSA)偶联。克分子比例为:Bombesin:BSA:ECII=60:1:6000。在4℃生理盐水中搅拌、反应8小时后透析,去除羰二亚胺后浓     

抗HCV HVR1模拟合成肽单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗-HCV高变区1(HVR1)合成肽单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定。方法:以固相合成的HCV HVR1合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,免疫8周龄的BALB/c小鼠。采用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备抗-HCV HVR1 mAb。经HAT、HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后,用相关的试剂盒鉴定小鼠mAb的Ig亚类;经中和抑制后用ELISA法检测mAb的特异性;用间接ELISA法检测mAb腹水的效价及相对亲和常数。结果:获得1株可分泌抗-HCV HVR1合成肽特异性mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11。该株mAb的Ig亚类为IgG3;腹水效价为3.125×10-5;相对亲和常数为1.0×106L/mol。该株mAb与HBsAg、HBeAg、HBcAg、HAAg、牛血清白蛋白、酪蛋白和胸腺5肽均无交叉反应,与HCV HVR1合成肽-牛血清白蛋白出现特异性反应。结论:成功地建立了1株可分泌抗-HCV HVR1 mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11,为进一步的实验研究提供了重要的制剂。     

心钠素单克隆抗体的制备及鉴定

本文将心房肽Ⅲ(APⅢ)与牛血清白蛋白(BSA)偶联成大分子复合物,免疫BALB/c小鼠制备出三株分泌心房肽Ⅲ-单克隆抗体(APⅢ-McAb),分别命名为A_1、A_2和A_3。所分泌的APⅢ抗体,行亚类鉴定为IgG_1型,琼脂双扩与BSA无出现沉淀线。应用APⅢ-McAb制备亲和层析柱,对心钠素有很高的亲和力,其洗脱峰值管,有明显的降压作用。     

3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺单克隆抗体的制备

目的:制备抗3,4-亚甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA)小鼠单克隆抗体(mAb),初步鉴定其特性,为MDMA快速检测方法的开发奠定基础。方法:将摇头丸与丁二酸酐反应生成摇头丸丁二酸酐的羧基衍生物(MDMA-HS),通过活性酯法MDMA-HS偶联于载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA),合成免疫抗原MDMA-HS-BSA和检测抗原MD-MA-HS-OVA。将MDMA-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株19A11。结果:将该细胞株注射BALB/c小鼠制备腹水mAb。腹水纯化后效价为1∶1.6×105,属于IgG1型。MDMAmAb的灵敏度为0.93μg/L,IC50为6.07μg/L。mAb与大麻、麻黄碱、氯胺酮、苯丙胺、甲基苯丙胺、吗啡、可卡因的交叉反应率均小于0.3%。结论:制备出的MDMAmAb为研制MDMA的快速检测方法奠定了基础。     

叶酸偶联白蛋白纳米粒的制备工艺研究

采用去溶剂化法制备普通白蛋白纳米粒 ,利用叶酸活性酯在微碱性条件下与白蛋白纳米粒表面的氨基反应 ,制得叶酸偶联白蛋白纳米粒。采用葡聚糖凝胶柱色谱法及紫外分光光度法验证偶联是否成功 ,并测定叶酸偶联的程度。通过葡聚糖凝胶柱色谱法可以清楚地看到叶酸偶联白蛋白纳米粒与未反应的叶酸活性酯完全分离 ,叶酸偶联白蛋白纳米粒与叶酸白蛋白机械混合物的胰蛋白酶水解液在 35 8nm处的紫外吸收图谱基本一致 ,说明叶酸已经成功地偶联于白蛋白纳米粒的表面。纳米粒形态圆整 ,平均粒径为 6 6 nm。叶酸偶联白蛋白纳米粒制备成功 ,作为叶酸受体表达丰富的多种肿瘤细胞的主动靶向给药的潜在途径 ,值得进一步的关注和研究     

己烯雌酚免疫原的合成及其抗血清制备

目的: 制备人工合成的己烯雌酚 (DES)的多克隆抗体。方法: 采用碳二亚胺法将DES与牛血清白蛋白 (BSA)交联, 经紫外扫描估算其交联比为 22, SDS- PAGE实验初步表明DES与BSA发生交联。用双向免疫琼脂扩散实验检测经DES -HS- BSA多次免疫新西兰白兔的抗血清。结果: 合成的DES- HS- BSA复合物, 具有免疫原性, 并产生了针对小分子DES的抗体。结论: DES免疫原的合成是成功的, 为其试剂盒的研制提供了条件。     

泰妙菌素人工完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

目的研制灵敏度高、特异性好的抗泰妙菌素(TML)单克隆抗体。方法用肟化法和碳二亚胺法将TML分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原TML-BSA和包被原TML-OVA,用TML-BSA免疫BALB/c小鼠,经细胞融合并采用间接ELISA筛选抗TML杂交瘤细胞株,用体内诱生法制备腹水和辛酸-硫酸铵法纯化获得单克隆抗体,并用SDS-PAGE鉴定。结果成功筛选出2株杂交瘤细胞株3B3和4A7,其细胞上清效价分别为1∶1600和1∶6400。纯化后单克隆抗体4A7的效价为5.12×10~5,半数抑制剂量(IC_(50))为0.049 ng/mL,亲和力常数Kaff为1.47×10~9 L/mol,与类似物瑞他帕林有2.7%的交叉反应率,与沃尼妙林、氟罗沙星等其他抗生素均无交叉反应。结论成功研制了抗TML单克隆抗体。     

雪卡毒素单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备雪卡毒素的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以雪卡毒素类似物莫能菌素为半抗原,分别采用混合酸酐法将其与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联合成免疫抗原M-BSA,碳二亚胺法与卵清白蛋白(OVA)偶联合成包被抗原M-OVA。以M-BSA免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合制备杂交瘤。以自制雪卡毒素提取物为竞争抗原,间接竞争ELISA法筛选稳定分泌雪卡毒素抗体的特异性细胞株。小鼠体内诱生腹水,辛酸硫酸铵沉淀法进行纯化。采用抗体亚型鉴定试剂盒鉴定所得抗体的亚型,间接竞争ELISA法鉴定抗体的特异性和交叉性。结果获得3株稳定分泌抗雪卡毒素抗体的杂交瘤细胞株1D5、2G11、3G11,其Ig亚型均属于IgG1亚型。交叉反应结果表明3株单克隆细胞产生的抗体除与莫能菌素有较高的交叉反应外,与其他雪卡毒素类似物均无明显交叉反应。结论成功筛选到了分泌雪卡毒素抗体的细胞株,为雪卡毒素免疫分析方法的进一步研究奠定基础。     

Trim22 B细胞表位预测及多克隆抗体制备与鉴定

目的:预测人Trim22的B细胞抗原表位,制备并鉴定其多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件分析Trim22的氨基酸序列,确定抗原表位并人工合成多肽。将合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联,免疫大白兔制备抗Trim22的抗体。经饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并对抗体进行ELISA、Western blot鉴定。结果:获得抗Trim22的多克隆抗体,抗体效价为1∶16 000,该抗体能特异性地识别包含(382～397)区段的Trim22缺失突变体,同时该抗体不能识别Trim22旁系同源分子Trim5α、Trim6和Trim34α。结论:采用人工合成多肽作为半抗原制备出抗Trim22的多克隆抗体,对研究内源性Trim22与HIV-1衣壳蛋白的相互作用机制具有重要价值。     

玉米赤霉烯酮半抗原及全抗原的合成与鉴定

目的:合成玉米赤霉烯酮(ZEN)半抗原及全抗原,并鉴定其是否合成成功,为制备ZEN抗体奠定基础.方法:将ZEN与羧甲氧基胺半盐酸盐(0-( carboxymethyl)hydroxylamine hemihydrochloride)反应,合成半抗原ZEN-6-羧甲氧基胺(ZEN-oxime),采用TLC、HPLC和液相-质谱联用技术进行半抗原的纯化、鉴定;通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备ZEN全抗原,采用紫外光谱法、TNBS法结合比的测定以及免疫学方法进行全抗原鉴定.结果:鉴定结果表明目标半抗原及全抗原合成成功.结论:本研究采用多种方法进行半抗原及全抗原的鉴定,结果皆表明目标半抗原及全抗原合成成功,说明本研究合成ZEN半抗原及人工抗原的技术路线是可行的,为进一步研制ZEN的抗体奠定良好基础.     

罗丹明B单克隆抗体的的制备及鉴定

目的制备抗罗丹明B[9-(2-羧基苯基)-3,6-双(二乙氨基)]小鼠单克隆抗体(mAb),初步鉴定其特性,为罗丹明B快速检测方法的开发奠定基础。方法采用活性酯法使罗丹明B偶联于载体牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA),合成免疫抗原罗丹明B-BSA和检测抗原罗丹明B-OVA。将罗丹明B-BSA免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术获得杂交瘤细胞株17F2,并通过对添加回收率的测定初步建立了罗丹明B的快速检测方法。结果将该细胞株注射Balb/c小鼠制备腹水mAb,腹水纯化后效价为1∶1.28×105,属于IgG1型。罗丹明B mAb的灵敏度为0.05μg/L,IC50为0.42μg/L。mAb与丁基罗丹明B、异硫氰酸罗丹明B、罗丹明6G、5-羧基四甲基罗丹明、罗丹明110、丽丝胺罗丹明B、罗丹明123的交叉反应率均小于0.3%。辣椒油中罗丹明B的添加回收率在80.6%～104.4%之间,变异系数在16.0%～28.8%之间。结论制备出的罗丹明B mAb为研制罗丹明B的快速检测方法奠定了基础。