甲氧基聚乙二醇修饰脐血淋巴细胞抗原的实验研究

用甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰脐血单个核细胞 ,并观察修饰后对淋巴细胞表面某些抗原的遮蔽作用及造血干祖细胞体外集落形成能力的影响。流式细胞仪分析结果表明 ,修饰后的脐血淋巴细胞CD3、CD4和CD8抗原与修饰前相比其相对荧光强度明显下降(P <0 0 1) ,剂量越大 ,遮蔽效果越好。当mPEG的浓度达到 12mg/ml时 ,CD3、CD4和CD8表面抗原被遮蔽达 96 %以上。用 3mg/ml、6mg/ml和 12mg/mlmPEG修饰单个核细胞后在体外人干细胞培养基中培养发现 ,形成CFU GM的数量分别为 2 2 83± 14 4 7、2 2 6 7± 14 6 1和2 5 83± 9 99。与对照组 (2 4 0 0±18 4 2 )相比差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。提示mPEG修饰脐血淋巴细胞后几乎可以完全遮蔽其表面抗原 ,但不影响干祖细胞在体外的增殖、分化能力。     

脐血与成人外周血,骨髓中造血干／祖细胞数量汲增殖比较

应用免疫磁珠分离法及甲基纤维素体外集落培养法分别观赏了脐血、成人外周血及骨骨右ＣＤ３４＾＋细胞数疸和ＣＦＵ－Ｍｉｘ、ＣＦＵ－ＧＭ、ＣＦＵ－Ｅ及ＢＦＵ－Ｅ集落形成情况，并进行了比较研究，结果显示脐血造血干／祖细胞数量及增殖能力明显高于成人外周血和骨髓，脐血中ＣＤ３４＾＋细胞数分别是成人外周血和骨髓的２０￣４０倍和４￣５倍，脐血外周血的４倍和３倍，而与骨髓基本相当。     

真皮多能干细胞促进大鼠急性放射损伤造血恢复的研究

目的 观察真皮多能干细胞移植对大鼠急性放射损伤后造血恢复的作用。方法 分离新生大鼠真皮多能干细胞体外培养至第10代用于研究，观察干细胞层体外对正常大鼠骨髓粒-巨噬系祖细胞和红系祖细胞集落生长的影响；进一步将真皮多能干细胞经尾静脉输入5Gyγ射线全身照射的大鼠体内，检测移植后骨髓有核细胞、粒-巨噬系祖细胞集落CFU—GM、红系祖细胞集落CFU—E和外周血白细胞数量、血红蛋白含量等指标的恢复情况，观察4周后动物的存活率。结果 真皮多能干细胞层体外可促进正常大鼠CFU—GM和CFU—E集落的生长；全身输入干细胞促进了5Gyγ射线全身照射动物的外周血白细胞和骨髓有核细胞、CFU-GM和CFU—E集落数的恢复。实验组动物4周后的存活率也明显高于对照组。结论 真皮多能干细胞具有一定支持造血的功能，可促进急性放射损伤大鼠的造血恢复，为造血损伤相关疾病的干细胞治疗提供新的细胞来源途径。     

TPO基因修饰的基质细胞对巨核系细胞的定向扩增作用

目的研究TPO基因修饰的基质细胞对CD34+造血细胞向巨核系细胞定向增殖分化的影响.方法将TPO cDNA构建到pBabe/pura中,通过"乒乓转染法"获得产高滴度逆转录病毒载体的包装细胞;利用所获的病毒上清转染基质细胞HFCL,用Northern blot检测细胞中TPO基因的表达,并利用TPO依赖株检测上清中的TPO活性;以未转基因的HFCL为对照,将CD34+造血细胞在TPO基因修饰的HFCL支持下扩增,用流式细胞仪检测扩增细胞中表型为CD34+CD41+和表型为CD41-CD61+细胞的比例.结果基质细胞HFCL能够有效表达外源性TPO基因,在HFCL/TPO培养上清中有0 75 ng/ml水平的TPO活性;并且在HFCL/TPO支持下,CD34+造血细胞经过7 d扩增后,CD34+CD41+细胞的比例为(13.7±2.0)%,HFCL为(6.5±1.8)%(P＜0.01);CD41+CD61+细胞的比例为(11.9±0.7)%,略高于HFCL的(10.6±1.5)%(P＞0.05).结论基质细胞能够有效表达外源性TPO基因和其蛋白,而且TPO基因修饰的基质细胞能显著促进CD34+CD41+巨核祖细胞的扩增,但对较成熟的CD41+CD61+巨核细胞影响不明显.     

胚胎期受辐射对子鼠造血基质细胞功能的影响

目的　研究胚胎期 2 0Gy137Csγ射线照射后对子鼠造血基质细胞的远期影响。方法　建立胚胎期受辐射小鼠模型 ;以细胞计数检测股骨骨髓有核细胞 (BMNCs)数 ;用免疫组化ABC法检测基质细胞粒单系集落刺激因子 (GM CSF)和干细胞因子 (SCF)的表达 ;用体外小鼠骨髓细胞培养法以粒单细胞系祖细胞集落形成单位 (CFU GM )为指标观察基质细胞对正常骨髓造血的支持功能。结果　胚胎期受辐射小鼠BMNCs数明显低于正常小鼠 (P <0 0 1) ,其骨髓基质细胞生长因子GM CSF和SCF的表达均高于正常小鼠 (P <0 0 5 ) ,同时 ,胚胎期受辐射小鼠骨髓基质细胞对正常骨髓造血的支持能力也高于正常小鼠 (P <0 0 5 )。结论　 2 0Gy137Csγ射线对发育中的小鼠胚胎的造血基质细胞产生了明显影响。     

程控降温后液氮保存对自体外周血造血干细胞含量和活性的影响

目的：观察程控降温后液氮保存对自体外周血干细胞含量和活性的影响。方法：13例接受APBSCT患者分离的造血干细胞利用程控降温仪进行冷冻,然后置液氮液相内（－196℃）保存,检测患者冻存前后的有核细胞数,CFU－GM,CD34＋细胞。结果：冻存前后CFU－GM,有核细胞数,CD34＋细胞统计学之间无显著性差异。结论：自体外周血干细胞体外冷冻处理和保存是有效和适当的。     

重组人造血增效因子对猴外周血干细胞的快速动员作用

目的观察重组人造血增效因子(rhHSF)对外周血造血干/祖细胞的快速动员作用。方法4只正常成年雄性猕猴连续4天皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子(rhGCSF)10μg/(kg·d)后,第5天用rhHSF250μg/kg一次皮下注射。另4只正常成年雄性猕猴仅皮下注射rhHSF500μg/kg一次。观察两组外周血造血干细胞的动员效果。结果一次皮下注射rhHSF后45min、1h和3h,外周血CD34+细胞、CFUGM和中性粒细胞数明显升高并达高峰,其幅度分别为药前值的1.8、3.3和24.9倍。单独应用rhGCSF后4天,对外周血CD34+细胞、CFUGM和中性粒细胞数分别为基值的34.8、4.2和2.7倍;联合应用rhHSF和rhGCSF的动员作用更加明显,CD34+细胞、CFUGM数和中性粒细胞数分别增至基值的41.3、8.3和4.9倍。结论rhHSF能快速动员造血干/祖细胞和中性粒细胞至外周血,并与rhGCSF有明显的协同作用。     

以人胎肝基质细胞为饲养层有效扩增脐带血CD34~＋细胞

目的以人胎肝基质细胞（fetal liver stromal cell,FLSC）作为饲养层,进行脐带血CD34＋细胞的扩增培养,寻找更加有效的体外扩增方法。方法比较脐带血CD34＋细胞在无饲养层和人FLSC饲养层条件下,培养7,13,15d的细胞增殖状况;并利用流式细胞仪检测不同时间点CD34＋细胞的比例。结果随着培养时间的延长,脐带血CD34＋细胞的扩增呈现时间依赖性改变;在FLSC饲养层条件下,CD34＋细胞培养7,13,15d的扩增数量分别为（11.83±0.76）×105,（14.37±0.32）×105和（18.73±0.25）×105,而在无饲养层条件下的扩增数量分别为（2.90±0.10）×105,（8.87±0.15）×105和（11.97±0.15）×105,两者相比有显著性差异（P（0.01）;此外,流式细胞仪检测各时间点CD34＋细胞的比例,在培养第13天,FLSC饲养层条件下CD34＋细胞的比例为10.21%,而在无饲养层为1.01%,两者存在显著差异。结论以人FLSC作为饲养层可以有效扩增脐带血造血干/祖细胞,为今后临床造血干细胞移植提供充足的细胞来源。     

重组人Delta-like-1胞外区促进细胞因子对脐带血造血祖细胞的扩增

目的：Notch信号通路对造血干／祖细胞的增殖分化具有重要调控作用。Delta-like-1(Dll-1)是Notch的配体之一，本研究观察了重组人Dll-1胞外区(hDll-1^ext)对细胞因子扩增脐带血造血祖细胞的促进作用。方法：RT-PCR用于检测Notch-1及其配体在脐带血细胞上的表达情况。利用免疫磁性分离(MACS)的方法分离人脐带血CD34 细胞。在无血清培养体系中，hDll-1^ext分别和不同的细胞因子组合联合培养CD34^ 细胞，通过集落形成实验检测hDLl-1^ext对造血祖细胞的扩增作用。结果：RT-PCR方法检测到脐带血单个核细胞表达Notch-1和它的配体Dll-1,Jagged-1，表明在生理条件下，脐血细胞的增殖分化可能受到Notch信号的调控。hDll-1^ext“能促进细胞因子组合对脐带血HPP-CFC的扩增，其中hDll-1^ext和SCF，IL-3，IL-6联合的扩增作用最强，无血清培养8，12d后，HPP-CFC分别增加为培养前的9．7和43倍。结论：重组hDll-1^ext能促进细胞因子对脐带血原始造血祖细胞的扩增作用。     

抗CD49d单克隆抗体与rhG-CSF动员的外周血干细胞移植重建小鼠造血功能的比较研究

为比较研究抗CD49d单克隆抗体和重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)动员的外周血干细胞对造血功能重建的影响 ,经放、化疗预处理的BALB/c小鼠分别接受经生理盐水(对照组 )、rhG CSF(实验 1组 )、抗CD49d单克隆抗体 (实验 2组 )动员的同系小鼠的外周血干细胞移植 ,观察受体小鼠的 4周存活率、外周血白细胞 (WBC)、骨髓有核细胞 (BMNC)、粒细胞巨噬细胞集落形成单位 (CFU GM)及脾集落形成单位 (CFU S)等指标。结果显示 ,实验 1、2组小鼠的 4周存活率、WBC、BMNC ,CFU GM和CFU S均明显高于对照组(P <0 0 1) ,实验 1、2组之间比较差异无显著性意义 (P >0 0 5 )。提示抗CD49d单克隆抗体或rhG CSF均能动员小鼠外周血干细胞 ,并能重建同系小鼠的造血功能。     

体外培养扩增的人脐血CD34+/细胞形成HPP-CFC的能力

目的：评价ＣＤ３４＾＋细胞体外扩增时高增殖潜能集落形成细胞（ＨＰＰ－ＣＦＣ）的变化。方法：利用ｍｉｎｉ－ＭＡＣＳ分离脐血ＣＤ３４＾＋细胞,流式细胞仪（ＦＡＣＳ）测定细胞纯度（８６％～９５％）。应用含ｒｈＳＣＦ、ｒｈＩＬ－３、ｒｈＩＬ－６和ｒｌＧＭ－ＣＳＦ的培养体系扩增ＣＤ３４＾＋细胞。分别于培养的第１,２和４周收取细胞进行ＨＨＰ－ＣＦＣ测定,测试体系为含重组人ＳＣＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＥＰＯ等细胞因子的半固体甲基纤维素。结果：测试体系中加入单个细胞因子不能产生ＨＰＰ－ＣＦＣ,含ｒｈＩＬ－３和ｒｈＧＭ－ＣＳＦ体系产生的集落小且主要为巨噬细胞集落,由所有因子组成的体系产生的集落大而致密,包含粒系３种类型。此外,尽管细胞总数量显著增加,扩增的ＣＤ３４＾＋细胞ＨＰＰ－ＣＦＣ形成率随培养时间的延长而减少。结论：本方     

辐射小鼠骨髓CD34~ 细胞的变化及其意义

目的　研究γ射线照射后C5 7小鼠骨髓中CD34 细胞的数量变化规律及其意义。方法　流式细胞仪测定CD34 细胞在骨髓有核细胞中的比例 ;AnnexinV FITC试剂盒检测骨髓细胞的凋亡 ;细胞固定后PI染色测定细胞周期。结果　①CD34 细胞在骨髓有核细胞中的比例随照射剂量的加大而降低 ,在 5 5Gy照射后 14d内小鼠CD34 细胞的减少表现为持续性 ;②小鼠照射后6h骨髓细胞凋亡率最高 ,以 5 5Gy照射组最为明显 ;③ 5 5Gy照射后小鼠骨髓细胞周期紊乱。 结论　γ射线损伤骨髓中的干祖细胞 ,造成骨髓中干祖细胞的数量减少 ,其途径之一是诱导骨髓细胞凋亡。     

Effects of peritoneal lavage fluid from radiation or/and burn injured rats on the growth of hematopoietic progenitor cells

PURPOSE: To evaluate the effects of peritoneal lavage fluids from radiation injury, burn injury and combined radiation-burn injury on the growth of hematopoietic progenitor cells (HPC). MATERIALS AND METHODS: Rats were divided into four groups: A radiation group (RG), a burn group (BG), a combined radiation-burn group (CRBG) and normal control group (NG). RG and CRBG rats were irradiated with 12 Gy, and burns of 30% total body surface area were generated in group BG and group CRBG. Peritoneal lavage fluids were collected and tested for their effects on the growth of erythrocyte progenitor cells or granulocyte-macrophage progenitor cells of BALB/c mice in vitro. RESULTS: The numbers of colony forming units-erythroid (CFU-E), burst forming units-erythroid (BFU-E) and colony-forming units-granulocyte-macrophage (CFU-GM) formed after treatment with lavage fluids from BG or CRBG were significantly higher than those from NG. However, fewer CFU-E, BFU-E or CFU-GM colonies were found after treatment with lavage fluid from the RG. In lavage fluid from BG and CRBG, the concentration of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor alpha (TNFalpha) was increased in comparison to NG and RG. Treatment with these cytokines had similar promoting effects on the growth of hematopoietic colonies and neutralizing antibodies inhibited these effects significantly. CONCLUSIONS: Burns increase the responsiveness of the system and help the proliferation of hematipoietic progenitor cells, while radiation decreases all these responses relative to both the controls and the burn plus radiation group.     

Effects of peritoneal lavage fluid from radiation or/and burn injured rats on the growth of hematopoietic progenitor cells

Purpose:?To evaluate the effects of peritoneal lavage fluids from radiation injury, burn injury and combined radiation-burn injury on the growth of hematopoietic progenitor cells (HPC).

Materials and methods:?Rats were divided into four groups: A radiation group (RG), a burn group (BG), a combined radiation-burn group (CRBG) and normal control group (NG). RG and CRBG rats were irradiated with 12 Gy, and burns of 30% total body surface area were generated in group BG and group CRBG. Peritoneal lavage fluids were collected and tested for their effects on the growth of erythrocyte progenitor cells or granulocyte-macrophage progenitor cells of BALB/c mice in vitro.

Results:?The numbers of colony forming units-erythroid (CFU-E), burst forming units-erythroid (BFU-E) and colony-forming units-granulocyte-macrophage (CFU-GM) formed after treatment with lavage fluids from BG or CRBG were significantly higher than those from NG. However, fewer CFU-E, BFU-E or CFU-GM colonies were found after treatment with lavage fluid from the RG. In lavage fluid from BG and CRBG, the concentration of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor α (TNFα) was increased in comparison to NG and RG. Treatment with these cytokines had similar promoting effects on the growth of hematopoietic colonies and neutralizing antibodies inhibited these effects significantly.

Conclusions:?Burns increase the responsiveness of the system and help the proliferation of hematipoietic progenitor cells, while radiation decreases all these responses relative to both the controls and the burn plus radiation group.     

抗CD25单克隆抗体对肾移植受者CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞的影响

目的 评价抗CD25单克隆抗体对肾移植受者术后早期CD4~+ CD25~(high)调节性T细胞(CD4~+ CD25~(high)Treg)的影响.方法 2007年2-9月接受初次亲属活体供肾移植的受者41例,根据是否使用抗CD25单克隆抗体(商品名daclizumab)分为抗体组(21例)和对照组(20例).其中抗体组在肾移植术前2h及术后第14天分别给予抗CD25单抗各50mg.在移植前及移植后第13、17、60天分别留取肝素抗凝外周血15ml.应用流式细胞仪测定两组受者外周血CD4~+T细胞和CD4~+ CD25~(high)Treg比例的变化,半定量RTPCR检测CD25 mRNA的表达变化.结果 肾移植术后13、17、60d抗体组的CD25~+ T细胞占CD4~+ T细胞的比例(20%±8%、13%±7%、24%±9%)低于对照组(45%±6%、41%±5%、40%±6%),差异有统计学意义(P<0.05).抗体组术后第17天CD4~+ CD25~(high)Treg占CD4~+ T细胞的比例为4.40%±0.26%,明显低于对照组(8.56%±0.36%,P<0.01);而术后13、60d抗体组CD4~+ CD25~(high)Treg所占比例分别为7.00%±0.47%、3.75%±0.19%,与对照组(分别为8.04%±0.32%、3.66%±0.31%)比较差异无统计学意义(P>0.05).抗体组CD25 mRNA相对表达水平在给予第二次抗体前(术后第13天)为1.65±0.22,术后第17天为1.84±0.27,两者间差异无统计学意义(P>0.05).对照组术后第17天CD25 mRNA相对表达水平为1.70±0.23,与抗体组比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 两剂共100mg抗CD25单抗仅一过性地降低CD4~+ CD25~(high)Treg,不会影响其活化扩增,无损于术后早期的免疫耐受诱导及维持.     

脐带血造血干细胞的“质”“量”研究

目的 对脐带血造血干细胞移植的“质”“量”作出评估，使其更广泛有效地应用于临床。 方法 利用免疫磁珠分离法、ＦＡＣＳ分析与分选、体外液体培养，铺展贴壁等方法对脐带血ＣＤ３４＾＋造血干、粗细胞及其的数量、体外增殖分化性能、生长因子扩增效应，植入成人骨髓基质效率等进行研究，数据经ｔ检验。结果 脐带血有核细胞、ＣＦＣｓ、ＣＤ３４＾＋细胞及其亚群等的绝对数量明显低于常规骨髓移植所需的细胞数量，但脐带血ＣＤ     

人正常骨髓CD34~ 造血细胞体外扩增形成红系及混合系造血祖细胞的能力

根据阳性选择策略，采用ＣＩＭＳ－１００免疫磁性无菌分离系统富集人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞，然后将其在含Ｅｐｏ＋ＧＭ－ＣＳＦ＋ＩＬ－３＋ＩＬ－６＋ＳＣＦ（简ＥＧＩＳ）组合造血生长因子的无基质液培体系中扩增４周，定期进行单个核细胞计数、ＢＦＵ－Ｅ及ＣＦＵ－Ｍｉｘ的培养。经ＦＡＣＳ鉴定所富集的ＣＤ３４＋造血细胞纯度平均＞９０％。人正常骨髓ＣＤ３４＋造血细胞在该条件下均可持续产生大量单个核细胞，最高可扩增１７７０倍。与ＨＰＰ－ＣＦＣ和ＣＦＵ－ＧＭ相反，ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｍｉｘ扩增量较低，最高仅为２．３６和２．４倍，且仅在第１周出现，随后迅速减少至停止。     

Human bone marrow mesenchymal stem cells expressing SDF-1 promote hematopoietic stem cell function of human mobilised peripheral blood CD34+ cells in vivo and in vitro

Purpose:?There is mounting evidence demonstrating that stromal cell derived factor-1 (SDF-1) plays an important role in homing of hematopoietic progenitor cells to bone marrow. This study was aimed to assess whether bone marrow mesenchymal stem cells overexpressing exogenous SDF-1 could synergistically promote the homing of CD34⁺ (Cluster of Differentiation [CD]) cells to bone marrow of lethally irradiated severe combined immunodeficiency (SCID) mice.

Methods:?Human SDF-1 complementary Deoxyribonucleic acid (cDNA) was transfected into bone marrow-derived mesenchymal stem cells with recombinant lentiviral vector. The expression of SDF-1 was detected by real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), and the ex vivo chemotaxis function on CD34⁺ cells was measured by coculture system and Transwell system. SDF-1 gene-modified mesenchymal stem cell (MSC) and CD34⁺ cells were infused into lethally irradiated SCID mice and the hematopoietic reconstitution in the recipient mice was examined.

Results:?Messenger ribonucleic acid (mRNA) and protein of SDF-1 in infected MSC were significantly higher than that of the non-infected control MSC (p?<?0.05). The infected MSC have significant chemotaxis effect on CD34⁺ cells in?vitro and promote hematopoietic reconstitution after CD34⁺ cell transplantation in?vivo.

Conclusion:?MSC with high-level expression of SDF-1 can synergistically promote hematopoietic reconstitution after CD34⁺ cell transplantation in lethally irradiated SCID mice.