抗人B7（CD80）分子单克隆抗体的制备及鉴定

为了利用抗Ｂ７ｍＡｂ深入研究Ｂ７分子的作用，我们用融合蛋白Ｂ７Ｉｇ免疫小鼠，用细胞ＥＬＩＳＡ及间接膜免疫荧光法进行筛选，得到了两株抗Ｂ７ｍＡｂ３Ａ２和３Ｂ６克隆，其Ｉｇ类别分别属于ＩｇＭ和ＩｇＧ２ａ型。在功能上３Ａ２能明显抑制抗ＣＤ３ｍＡｂ诱导的Ｂ７分子协同刺激的Ｔ细胞增殖     

环磷酰胺免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体小鼠模型的建立

目的:观察不同剂量环磷酰胺(CP)诱导免疫耐受的作用, 建立一个免疫删减法制备细胞表面抗原单克隆抗体(mAb)的动物免疫模型.方法:雌性 BALB/c小鼠经CHO细胞免疫后分别给予不同剂量的CP诱导免疫耐受, 选择血清抗体效价最低的一组小鼠按常规方式腹腔注射CHO-TM5细胞进行免疫.ELISA测定各小鼠血清中CHO抗体及CHO-TM5抗体效价, 检测血清抗体对CHO细胞与CHO-TM5细胞结合反应的差异性.结果:BALB/c小鼠腹腔注射不同剂量的CP后, 各剂量组均出现不同程度的免疫耐受作用.CP 100 mg/kg组与CP 125 mg/kg组小鼠血清抗体效价较低, 接近阴性对照组.ELISA检测显示CP 100 mg/kg组血清抗体与CHO-TM5细胞呈阳性结合反应, 不与CHO细胞结合;而CP 0 mg/kg组血清抗体与CHO细胞与CHO-TM5细胞的结合反应均呈阳性.结论:CP 100 mg/kg具有良好诱导小鼠对CHO和CHO-TM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受, 相对增强对CHO-TM5细胞目的抗原hTM的免疫应答的作用, 为免疫删减法制备细胞表面抗原mAb提供了一个理想的动物免疫模型.     

CD80和CD86介导的共刺激信号的比较及其生物学作用

共刺激信号在T细胞的活化中具有重要的作用,CD80和CD86是两个重要的共刺激分子。尽管两者存在许多相似之处,但随着研究的深入,发现两者在分子结构、所介导的生物学功能等方面均存在着诸多的不同。研究两者区别对于更好的了解它们的功能具有重要的意义。     

抗CD59单克隆抗体的制备及鉴定

本实验应用杂交瘤技术，首次在国内建立了两株抗人补体终末阶段同源限制因子的杂交瘤细胞系。经抗原特异性及功能分析提示它们所针对的抗体分子具有相似的功能，但抗原性和分子量不同：２Ａ７－Ａｇ为１８－２２ＫＤａ，１Ｆ１０－Ａｇ为６５ＫＤａ。进一步应用免疫荧光流式细胞分析、促同源补体溶血试验、中和实验、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ，ＰＩ－ＰＬＣ处理等实验手段系统地鉴定了２Ａ７抗原的细胞分布、抗原特异性、分子     

阻断型CD154抗体和CD80抗体生物学作用的研究

为比较阻断型抗人CD154单克隆抗体(1B1)和抗人CD80单克隆抗体(3H8)的单独及联合应用在调节CD4+T细胞对同种抗原的初次和再次免疫应答中的作用。采用免疫磁珠阴性选择法分离获得人外周血CD4+T细胞、将纯化的CD4+T细胞与刺激细胞体外共培养,通过检测培养上清IL-2、IFN-γ水平以及CD4+T细胞的增殖来评价1B1和3H8的生物学作用。结果显示,1B1和3H8单独或联合应用能不同程度地抑制混合淋巴细胞反应中CD4+T细胞对同种抗原刺激的增殖,下调CD4+T细胞分泌IL-2和IFN-γ,并且在再次反应中能有效诱导CD4+T细胞对同种抗原的免疫低反应性。因此,1B1和3H8的单独及联合应用在移植排斥的免疫干预及同种抗原免疫耐受的诱导中具有潜在的应用前景。     

抗CD1d单克隆抗体的制备及其识别结构域的鉴定

目的：制备抗人CD1d单克隆抗体（mAb）并研究其结合特性。方法：应用淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠源性抗人CD1dmAb。用免疫荧光染色和流式细胞术鉴定其识别位点。结果：获得1株分泌抗CD1dmAb的杂交瘤细胞株。mAb的腹水ELISA效价达10^-6，为IgG1亚类，可识别293T细胞转染的CD1d分子的α1结构域。结论：获得1株可特异性识别CD1d α1结构域的mAb，为进一步研究CD1d的结构及功能提供了手段。     

抗人CD38单克隆抗体的制备、鉴定及其功能的初步研究

目的：研制抗人CD38抗原分子的单克隆抗体,进一步研究其生物学功能。方法：采用高表达CD38抗原的Daudi细胞免疫Balb/c小鼠;取其脾细胞与SP2/0细胞融合;用间接免疫荧光法进行杂交瘤筛选;流式细胞术、免疫沉淀法与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析鉴定单克隆抗体的特异性。以MTT（四甲偶氨唑盐）法检测单克隆抗体抑制细胞增殖以及介导补体杀伤靶细胞的功能。结果：获得了一株抗人CD38分子的单克隆抗体1C6,流式细胞术显示它具有CD38抗原特异的细胞反应谱,其识别的抗原分子质量为45000u。与CD38分子原核表达产物的Western-blot分析表明,其可特异识别CD38分子胞外结构域。MTT法显示其可介导补体杀伤靶细胞。结论：成功制备了抗人CD38分子的单克隆抗体,并进行了初步的功能研究。     

抗人CD100单克隆抗体的制备与初步鉴定

目的：研制可识别天然CD100分子的单克隆抗体（mAb)。方法：采用真核表达的CD100分子免疫BALB/c小鼠，以间接ELISA法筛选阳性杂交瘤，并分别用人急性T淋巴细胞性白血病细胞系MOLT-4，猿T淋巴细胞系MLA-144及猴EB病毒转化的B淋巴细胞系（BLCL），进行间接免疫荧光染色和流式细胞术鉴定mAb的特异性。结果：共获得7株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。所有mAb均可识别人和猴细胞系的膜表面天然CD100分子，其中6株可识别猿细胞系膜表面的天然CD100分子，结论：成功地制备了7株抗CD100分子的特异性mAb。为研究人和猿，猴CD100分子的结构与功能提供了新的手段。     

抗CD30L/CD153单克隆抗体的制备与初步鉴定

CD30L（CD153）是肿瘤坏死因子超家族（TNFSF）中的一个成员，属Ⅱ型跨膜蛋白，其胞膜外区与其他TNFSF成员（如TNF—α、LT—α和CIMOL等）有较高同源性，主要表达于活化T细胞、单核／巨噬细胞、中性粒细胞，以及某些髓系和淋巴系起源的造血系统的恶性肿瘤细胞。CD30L结合其受体CD30，介导分化和活化信号，促进细胞增殖和活化，     

鼠抗人B7-1分子功能性单克隆抗体的制备及生物学特性

目的：制备鼠抗人Ｂ７－１分子的功能性单克隆抗体,研究其对高表达相应配基分子细胞的生物学效应。方法：用两株转入Ｂ７－１基因细胞株ＸＧ７－Ｂ７和Ｌ－Ｂ７分别作为免疫原及检测细胞株,利用Ｂ淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以快速定性试纸分析法鉴定单抗所属的小鼠ＩｇＧ亚类,采用竞争抑制及间接免疫荧光法分析单抗的特异性和亲和力。以高表达Ｂ７－１分子的恶性淋巴瘤细胞Ｒａｊｉ和Ｄａｕｄｉ为靶细胞,分析单抗对其生     

CD80鼠-人嵌合抗体的CHO细胞表达及体外生物学功能的初步研究

目的:CHO细胞表达抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,并研究其在体外阻断CD80介导的共刺激信号转导的生物学功能.方法:构建含有嵌合重、轻链基因的表达载体pIRES/ch4E5;表达载体先转染293T细胞,FCM检测到ch4E5抗体的瞬时表达后,表达载体再转染CHO细胞,构建稳定表达细胞株CHO-ch4E5;Protein G亲和层析法从CHO-ch4E5细胞无血清培养上清中纯化ch4E5抗体,FCM检测ch4E5抗体对膜型CD80的识别;以丝裂霉素处理的正常人外周血单核细胞PBMCs为刺激细胞,以异体正常人外周血淋巴细胞PBLs为反应细胞,用MTT法分析ch4E5抗体的阻断作用.结果:ch4E5抗体在293T细胞的瞬时表达于48小时达到高峰,上清与L929-B7-1细胞结合率为96.0%;CHO-ch4E5细胞持续表达ch4E5抗体,其培养上清与L929-B7-1细胞结合率为95.7%;3天培养上清中,ch4E5抗体的产率约为5.56 mg/L;ch4E5抗体和L929-B7-1、Daudi、Sub-T细胞结合率分别为94.1%、25.7%、23.5%;ch4E5抗体可以阻断CD80介导的共刺激信号转导,抑制异体PBLs的体外增殖.结论:在CHO细胞中成功表达了抗人CD80鼠-人嵌合抗体ch4E5,在体外该嵌合抗体具有亲本抗体阻断CD80介导的共刺激信号的生物学活性.     

肝癌靶向性SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及表达鉴定

目的:构建肝癌靶向性葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体。方法:首先利用现有的腺病毒穿梭质粒pShuttle和pShuttleCMV,构建新的不带CMV增强子/启动子而带有polyA加尾信号穿梭质粒,命名为pShuttle2。将AFP增强子、启动子、SEA及CD80基因分别从已构建的pKSEP载体和pMD18TBIS载体上,分别亚克隆至pShuttle2中,再与腺病毒骨架质粒pAdEasy1共转化E.coliBJ5183。以获得的重组子转染HEK293细胞后制备重组腺病毒,然后感染高表达AFP的肝癌细胞系Hepa16和不表达AFP的黑色素瘤细胞系B16、成纤维细胞系NIH3T3。采用间接免疫荧光法,激光共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达。采用3H掺入法检测膜表达的SEA诱导淋巴细胞增殖的活性。结果:以制备的重组腺病毒感染肿瘤细胞后,SEA和CD80能够靶向性地共表达在高表达AFP的Hepa16细胞膜上,而在不表达AFP的B16、NIH3T3细胞膜上不表达。结论:成功地构建肝癌靶向性SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,为进一步研究SEA和CD80在肝癌靶向基因治疗中的联合应用及其抗肿瘤免疫机制奠定了基础。     

利用基因重组抗原研制人CD20单克隆抗体及其功能的研究

目的　利用基因重组抗原免疫小鼠 ,制备人CD2 0单克隆抗体 ,研究其特异性和功能。方法　用表达重组人CD2 0基因的细胞NIH 3T3免疫BALB c小鼠 ,取其脾细胞与Sp2 0细胞融合 ,以间接免疫荧光法筛选杂交瘤上清。免疫沉淀法及流式细胞术鉴定其识别抗原的相对分子质量 (Mr)和特异性 ;以MTT法、流式细胞术及形态学方法检测诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的功能。结果　利用杂交瘤技术获得了 1株抗人CD2 0的单克隆抗体 1 2 8,它具有CD2 0抗体特异的细胞反应谱 ,其识别的抗原Mr 为 33× 10 3 。MTT实验证实 1 2 8能显著抑制Daudi和Raji细胞生长。结论　利用基因重组抗原制备了 1株能够稳定分泌抗人CD2 0的单克隆抗体的杂交瘤细胞株 1 2 8,此单抗具有抑制CD2 0阳性细胞增殖和诱导其凋亡的功能。     

小鼠TERT启动子调控的CD80-SEA基因重组腺病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达鉴定

目的:构建小鼠端粒酶反转录酶(mTERT)启动子调控的葡萄球菌肠毒素A(SEA)和CD80基因共表达重组腺病毒载体,并观察其介导的SEA和CD80在小鼠肝癌细胞Hepa1-6中的表达情况。方法:采用AdEasy腺病毒体系,亚克隆mTERT核心启动子区至穿梭质粒pShuttle2,并在其上游插入myc-Max反应元件MMRE,用来调控SEA及CD80基因的表达,构建SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS,制备病毒并纯化,然后将病毒以感染复数为100的浓度分别感染肝癌细胞系Hepa1-6和成纤维细胞系NIH3T3。采用免疫荧光染色法检测SEA和CD80在细胞膜表面的表达情况。结果:重组腺病毒载体Ad-MMRE-mTERT-BIS感染的Hepa1-6肝癌细胞膜上能够共表达SEA和CD80;而病毒感染的NIH3T3细胞不能表达SEA和CD80。结论:成功地构建了mTERT启动子调控的SEA和CD80基因共表达重组腺病毒载体,能够调控SEA和CD80基因在肝癌细胞中的靶向表达,为进一步研究肝癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

人CD80胞外区在大肠杆菌中的表达和鉴定

目的在人大肠杆菌中表达人ＣＤ８０胞外区蛋白质。方法采用ＰＣＲ扩增人ＣＤ８０胞外区基因ｃＤＮＡ，先后经Ｋｌｅｎｏｗ和ＨｉｎｄⅢ酶切并纯化，再定向克隆至高效表达载体ｐＫｐＬ－３ａ中，构建成ｐＫｐＬ－ＣＤ８０。转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６后，温度诱导表达，再用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定之并检测其活性。结果转化菌表达出分子量为２４０００的蛋白质，免疫学鉴定为ＣＤ８０，并证实有一定生物学活性。结论大肠杆菌中可以成功表达出具有生物学活性的ＣＤ８０，为进一步研究和开发ＣＤ８０打下了基础。     

抗人CD80双价抗体的构建、表达及生物学功能初步研究

构建及表达抗人CD80双价抗体(dimeric antibody fragment,diabody),并初步研究其生物学功能.PCR法获得轻重链可变区基因,构建表达载体pIRES2-EGFP/diabody.将pIRES2-EGFP/diabody转染中华仓鼠卵巢细胞(CHO),G418加压,筛选稳定高表达细胞株,扩大...     

胃癌单抗与柔红霉素和氨甲喋呤交联物的制备及其细胞毒作用

采用葡聚糖氧化将胃癌单抗(McAb)与抗癌药物柔红霉素(DNR)和氨甲喋呤(MTX)同时交联(McAb-PAD<分别采用噻唑蓝活细胞染色法(MTT 法)及~3H-TR 掺入法检测交联物的细胞毒作用,结果表明两种检测方法敏感性无明显差异,并且证实文联物对肿瘤靶细胞具有较强的选择性杀伤效应。     

鼠抗人CD28分子单克隆抗体的研制及生物学特性研究

目的 制备鼠抗人CD28分子的单克隆抗体（mAb),研究其在T细胞的活化、增殖及信号传导中的作用。方法 以小鼠淋巴瘤细胞转染人CD28基因的细胞株（CD28-T）为免疫原,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌特异性mAb的杂交瘤细胞株,以体内诱生法生产腹水,并以免疫亲和层析法对其纯化,以快速定性试纸法鉴定mAb的Ig亚类,竞争抑制法分析mAb识别的抗原表位,3H-TdR掺入法研究mAb对T细胞的刺激效应,结果 成功地获得了5株分泌特异性抗入CD28mAb的杂交瘤细胞株,鉴定的1株（克隆18G8）属IgG2a,腹水效价（流式细胞仪分析）达1：2400以上,该mAb能60%阻断标准鼠抗入CD28抗体与相应抗原的结合,提示其识别的抗原表位与标准mAb不完全相同,mAb18G8可取代B7-1分子介导的协同刺激信号,促进人外周血T细胞增殖（ST=7）。结论 18G8是12株功能性mAb,具有重要的研究和应用价值。     

一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析

目的：研制功能性抗人ＣＤ４０单克隆抗体,从而探讨其对Ｂ细胞、ＤＣｓ表达的ＣＤ４０分子激发所产生的生物学效应。方法：采用细胞融合、单克隆抗体筛选、荧光标记、免疫印迹和竞争抑制等方法获得鼠抗人ＣＤ４０ｍＡｂ,以细胞增殖、分化抗原表达观察ＣＤ４０ｍＡｂ对Ｂ细胞和ＤＣｓ的作用诳应。结果：经表型分析、Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ鉴定和竞争抑制试验,证实５Ｃ１１是识别人ＣＤ４０分子的特异性单抗;５Ｃ１１与转