结核分支杆菌耐药基因检测对获得性耐药性的研究

了解不同年龄段肺结核病人的结核分支杆菌获得性耐药情况, 比较两种耐药性检测方法的检测效果, 评价它们的临床应用价值.用药敏试验(绝对浓度法)检测了结核分支杆菌株对RFP、INH、SM、PZA和EMB耐药情况, 采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测结核分支杆菌耐药rpoB、katG、 rpsL、pncA和embB基因突变, 用绝对浓度法作药物敏感试验.青年组、中年组和老年组获得性耐药率分别为89.2%、85.3%和67.6%, 耐药基因突变率分别为76.2%、81.3%和63.2%,青年组耐药率和耐多药率显著高于其他组.结核杆菌耐药基因突变与耐药水平联系密切, 多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药区,也有少数基因突变发生在低耐药区.不规律用药时间越长耐药率越高.不同年龄组获得性耐药情况有差别, 应重视不同年龄组, 特别是青年组耐药率检测.PCR-SSCP是一种快速检测结核杆菌rpoB、katG、rpsL、pncA和embB基因突变敏感、特异的方法.     

异烟肼耐药结核分支杆菌katG基因分析

结核分支杆菌 (Mtuberculosis,TB)的katG基因是位于细菌染色体上的结构基因 ,全长 2 2 2 3bp ,它的编码产物是过氧化氢 过氧化物酶 ,而后者在维系异烟肼 (Isoniazid ,INH)杀菌毒性中 ,发挥重要作用。因此 ,katG基因结构的正确性是编码产生功能正常的过氧化氢 过氧化物酶的先决条件 ,也是发挥INH特有的药理作用的重要基础。通过检测katG基因的分子结构 ,尤其是检测某些关键位点的碱基突变 ,可以快速发现TB对INH耐药的变异情况 ,对及时的指导临床用药 ,具有重要的意义。作者单位 :山东省医药生物技术研究中心 (黄海南 ,韩金祥 ,高雪芹…     

结核分支杆菌3种不同靶基因传统PCR巢式PCR检测比较研究

本文以结核分支杆菌的插入序列基因、6 5KDa抗原基因和rpoB基因为靶基因 ,系统地比较了以 1对引物扩增的传统PCR和以 2对引物扩增的巢式PCR的灵敏度和特异性。结果为本文所采用的引物均为人结核分支杆菌复合群特异 ;巢式PCR灵敏度高于传统PCR ,其中以rpoB基因为靶基因的巢式PCR灵敏度达一个结核分支杆菌。rpoB基因巢式PCR产物经DNA测序并可确认对利福平敏感与否。rpoB基因巢式PCR可作为结核病和利福平耐药的辅助诊断方法     

rpoB基因套式PCR直接测序判别结核分支杆菌利福平耐药

目的 探讨rpoB基因套式PCR直接测序判别结核分支杆菌（Mrb)利福平耐药。方法 收集肺结核患者痰标本进行rpoB基因套式PCR检测并测序。结果 6例rpoB基因套式PCR扩增阳性者（其中4你为Bactec460培养阴性者），经DNA测序除1例rpoB基因无突变外，另5例均存在突变，3例为氨基酸密码子的第499位和第522位至第524位同时出现有义突变，其中第499位的基因突变为首次发现。结论 rpoB基因套式PCR检测在可辅助诊断结核病的同时，对其产物进行测序可直接判别对利福平耐药与否。     

蜡样芽胞杆菌DNA分子分型研究

目的 建立蜡样芽胞杆菌分子分型方法，用于蜡样芽胞杆菌食物中毒的快速溯源。方法15株蜡样芽胞杆菌进行生化分型，同时进行vrrA基因PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染检测PCR扩增产物，所有PCR扩增产物进行序列分析，并用ClustalW(ebi．ac．uk)分析软件对DNA序列进行同源性比较。结果传统生化分型：15株蜡样芽胞杆菌中12株可分为3个型，3株不能分型；主要生化型为1型、2型和4型。分子分型：15株蜡样芽胞杆菌都可分为7个型。结论、vrrA基因可作为蜡样芽胞杆菌分子分型的一个多态性遗传标记。蜡样芽胞杆菌分子分型方法与传统生化分型方法相比，将传统生化分型所需的48h甚至更长时间缩短到5h，具有简便快速准确的优点，可做到快速溯源。     

结核分支杆菌Rv0901基因置换型打靶载体的构建

目的：对结核杆菌H37Rv的Rv0901基因进行体外扩增，构建基因打靶载体，利用基因打靶技术进行结核分支杆菌基因Rv0901功能的研究。方法：结核分支杆菌标准毒力株H37Rv体外培界，扩增目的基因，连接载体及目的片段，切除目的基因，筛选阳性克隆，酶切鉴定。结果：经酶切鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符，鉴定证实PCR产物及插入片段为所需目的基因片段，成功切除靶片段。证实标记基因插入片段插入方向正确。结论：成功构建了用于结核分支杆菌基因打靶的置换型载体，为随后将进行的Rv0901基因敲除株的建立，Rv0901基因功能的研究奠定了基础。     

PCR—SSP用于上海地区汉族人群HLA—DRB1基因分型的研究

通过建立顺序特异特异引物聚合酶链反应方法，对１０２名上海地区汉族人，１１２例肾移植供受者和１４份标准ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因分型。每份样本同时２０管ＰＣＲ反应，扩增条件为９４℃３０秒，６０℃５０秒，７２℃４０秒，共３４个循环。即可对ＤＲＢ１各等位基因作出准确分型，总耗时５小时。分型结果限制性内切酶分析和特异性探针杂交等予以确证，无一例假阳性和假阴性。     

用于研究DLA—DRB1基因分型的寡核苷酸引物对的选择

我们用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法研究了ＤＬＡⅡ类基因。为寻找合适的引物，用四对不同的引物：ＤＬＡ－ＤＲ－ＳＰ／Ｓｔｏｐ，ＤＬＡ－ＳＰ／Ｐ３，ＨＬＡ－ＤＲＢ－ＧＨ４６／５０及ＨＤＡ－ＤＲＢ－ＡＭＰ－Ａ／Ｂ进行了一系列扩增，只有引物对ＨＬＡ－ＤＲＢ－ＡＭＰ－Ａ／Ｂ获得了满意的结果，其类似核苷酸序列在ＤＬＡ－ＤＲＢｃＤＮＡ的核苷酸序列内被发现，特异性也为Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析所证实，内切酶ＨａｅⅡ类基     

MLVA和Spoligotyping用于西藏地区216株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型研究

目的评价间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）两种分型方法在西藏地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集西藏地区结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）临床分离株，应用Spoligotyping及MLVA两种分型方法进行比较分析。结果共在西藏地区收集到216株结核分枝杆菌临床分离株，采用Spoligotyping分型方法，216株菌可分为3个基因群13种基因型，其中最大的1个基因群即北京家族（8eijingfamily）含有195株菌，占90．28％。北京家族菌株中，有BCG接种史者占45．64％（89／195），无BCG接种史者占54．36％（106／1195），两者间的差异无统计学意义（X^2=0．059，P〉0．05）。采用MLVA分型方法，216株菌可分成19个基因群108种基因型，其中80种基因型只有1株菌，占37．03％（80／216），另有136株菌表现出28种基因型，成簇数为28，占62．96％（136／216）。在20个VNTR位点的等位基因多态性发现Miru31位点的多态性最高，多态性指数（h）达到0．77，而Mtub29、Mtubl2位点的多态性较差，都低于0．05。其中Mtuh02位点可鉴别北京家族和非北京家族，它鉴别的北京家族与Spoligotyping鉴别的北京家族符合率达到100％。结论西藏地区结核分枝杆菌具有明显的接引多态性，其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与BCG接种无相关性。应用Spoligotyping和MLVA两种分型方法进行结核病流行病学研究，将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。     

PCR－SSP用于上海地区汉族人群HLA－DRB1基因分型的研究

通过建立顺序特异引物聚合酶链反应方法（ＰＣＲ－ＳＳＰ），对１０２名上海地区汉族人，１１２例肾移植供受者和１４份标准ＤＮＡ进行ＨＬＡ－ＤＲ基因分型。每份样本同时２０管ＰＣＲ反应，扩增条件为９４℃３０秒，６０℃５０秒，７２℃４０秒，共３４个循环。即可对ＤＲＢ１各等位基因作出准确分型，总耗时５小时。分型结果经限制性内切酶分析和特异性探针杂交等予以确证，无一例假阳性和假阴性。显示该方法快速、精确，适合于临床应用     

新疆南疆地区维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌临床分离株的基因分型研究

目的 应用多位点数目可变串联重复序列(VNTR)分析技术,对新疆南疆地区维吾尔族结核病患者结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,探讨其数目VNTR基因型种类及其分布.方法 收集结核分枝杆菌,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术,结合BioNumerics 5.0软件,对其24个VNTR位点进行结果分析.结果 分离出151株结核分枝杆菌,分为8个基因群151个基因型,其中Ⅵ群为主要基因群,占44.4%,有67个基因型,其次是Ⅷ群(23.2%)和Ⅳ群(20.5%).结论 新疆南疆地区维吾尔族结核病患者的结核分枝杆菌存在明显基因多态性,且存在主要流行菌群.     

Spoligotype patterns of Mycobacterium tuberculosis isolated from extra pulmonary tuberculosis patients in Puducherry,India

Purpose: Genotyping studies like spoligotyping are valuable tools in understanding the genetic diversity and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis. Though there are reports of spoligotyping of M. tuberculosis isolates from pulmonary specimens from different parts of India, spoligotyping of extra pulmonary tuberculosis isolates are very few. Puducherry has not yet recorded spoligopatterns of M. tuberculosis from either pulmonary or extra pulmonary (EPTB) specimens. The aim of this study is to analyze the spoligotype patterns of EPTB strains circulating in Puducherry and neighboring districts of Tamil Nadu. Materials and Methods: During June 2011 to December 2013, 570 EPTB specimens were processed by culturing on to Lowenstein Jensen (LJ) medium and automated Mycobacterium Growth Indicator Tube system (MGIT960). Identification of M. tuberculosis was carried out as per standard procedures, and MPT 64 antigen positivity in a commercial immunochromatography kit. Spoligotyping was carried out at National Institute of Research in Tuberculosis (ICMR), Chennai. Results: M. tuberculosis was isolated from 67 single EPTB specimens (11.8%) like pus/cold abscess (34), TB spine (10), pleural fluid (10), urine (5), tissue bit (2), lymph nodes (2), ascitic fluid (2), synovial fluid (1) and endometrial curetting (1). Among 67 isolates with 41 spoligopatterns, EAI lineage with 28 isolates (41.8%) predominated followed by 18 orphans (26.9%), 10 Beijing (14.9%) and 8 U (11.9%). BOVIS1_BCG (ST482), T1-T2 (ST78) and H3 (ST50) were represented by one strain each (1.5%). Conclusions: Spoligotyping plays a significant role in the epidemiology of tuberculosis. Three spoligotypes, T1-T2 (ST78), EAI6 (ST292) and U (ST1429) are reported for the first time in India.     

Acquired drug resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from treated patients in the province of Bursa, Turkey

Objective: To evaluate the distribution of acquired resistance in isolates of Mycobacterium tuberculosis from treated patients in two periods, 1984–89 and 1990–95, in the Bursa (Southern Marmara) region.
Method: Susceptibility of 531 M. tuberculosis isolates to four commonly used drugs (isoniazid (INH), streptomycin (SM), ethambutol (EMB) and rifampin (RMP)) was determined by the absolute concentration method of Canetti et al.
Results: In 203 strains isolated in the years 1984–89, the total acquired resistance was 32.5%, and it was 37.5% in 328 strains isolated in 1990–95 ( p >0.05). Resistance to INH, SM, RMP and EMB was found in 23.6%, 16.7%, 6.4% and 3.9%, respectively, in the first period (1984–89), and in 26.2%, 20.4%, 25.3% and 8.2%, respectively, in the second period (1990–95). The increase in RMP resistance was statistically significant ( p <0.001). The incidence of multidrug-resistant strains was 12.3% in the first period, and 24.4% in the second period, a significant increase ( p <0.001).
Conclusions: We believe that progressive emergence of phenotypes resistant to INH+RMP in our region is caused by inadequate treatment for various reasons. In the present study, the fact that multidrug resistance occurred in nearly 25% of patients treated previously but still infective suggests that the approach to surveillance, patient therapy and follow-up programs should be fundamentally reconsidered in our region.     

7个VNTRs用于65株中国分离的结核分枝杆菌基因多态性研究

目的　应用数目可变串联重复位点 (variablenumberoftandemrepeats ,VNTRs)分子分型技术 ,初步探讨我国结核分枝杆菌的基因多态性特征。方法　采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术 ,对结核分枝杆菌的 11个数目可变重复位点进行检测 ,并应用Gel Proanalyzer 3.1软件和BioNumerics(Ver sion 3.0 )软件进行结果分析 ,分析结核分枝杆菌DNA多态性特征。结果　选取结核分枝杆菌基因组中的 7个 (ETR A、ETR B、ETR C、ETR D、ETR E、ETR F、MPTR A)具有明显多态性特征的串联重复位点 ,检测分析了 6 5株来自安徽、湖南和江苏省的结核分枝杆菌 ,结果显示被测菌株可分为 10个不同的基因型 ,其中以 2个型别为主 ,占总菌株数的 6 9.2 % ,其他菌株呈散在分布。结论　采用VNTR分型技术初步分析表明 ,中国结核分枝杆菌具有明显的基因多态性 ,且存在主要流行菌群。     

基因型分析法快速检测耐药结核分枝杆菌

目的 探讨基因型分析法检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药性的价值.方法 采用多重PCR和线性探针反向膜杂交法来检测异烟肼耐药基因katG S315T和inhA C-15T突变以及利福平耐药基因rpoB D516V,H526Y,H526D,S531L突变来判断78株结核分枝杆菌临床分离株的耐药性,并与金标准L-J固体培养基药敏法以及BACTEC960液体培养药敏法进行对比分析.结果 基因型分析法在6h内可以完成;结核分枝杆菌常规药敏检测需要3个月.与后者相比,基因型分析法检测异烟肼耐药的敏感性和特异性分别为89％ （16/18）和99％ （77/78）;检测利福平耐药的敏感性和特异性均为100％（13/13,78/78）.结论 基因型分析法检测结核菌耐药性快速准确,对耐药结核病的早期诊断和治疗很有帮助,有望在临床实验室广泛开展.     

IS6110-RFLP、Spoligotyping和MLVA在结核分枝杆菌基因分型中的应用研究

目的 评价156110限制性片段长度多态性（IS6110-RFLP）、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）3种方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法 分别采用IS6110-RFLP、Spoligotyping及MLVA对40株结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型研究，比较3种方法的分型效果。结果 使用IS6110-RFLP方法，40株结核分枝杆菌呈现出35种基因型，33株具有独特的基因型；使用Spoligotyping方法，40株结核分枝杆菌呈现出17种基因型，11株具有独特的基因型；使用MLVA方法时，40株结核分枝杆菌呈现出34种基因型，29株具有独特的基因型；当3种方法联合使用时，40株结核分枝杆菌呈现出39种基因型，38株具有独特的基因型。结论 MLVA和IS6110-RFLP方法的分辨率高于Spoligotyping，但是对于IS6110单拷贝或低拷贝的菌株，MLVA方法的分辨率要高于IS6110-RFLP。MLVA、IS6110-RFLP和Spoligotyping联合应用可有效地进行结核病的流行病学调查和病原学监测。     

Application of four molecular techniques for typing outbreak-associated Mycobacterium tuberculosis strains

We applied four molecular techniques for the typing of strains of Mycobacterium tuberculosis associated with outbreaks: RFLP of the IS6110 insertion sequence, spoligotyping, RAPD, and PCR-IS6110. All 4 techniques were applied to 18 strains which were shown by epidemiological data to be involved in 6 outbreaks. All the methods classified the strains into the same groups as the classical epidemiological data did, but RFLP of the IS6110 insertion sequence and spoligotyping are laborious techniques requiring more than a full day's work, whilst RAPD and PCR IS6110 are simple methods easily incorporated into the daily routine. Nevertheless, a large-scale process of standardization and evaluation is necessary in order to be able to establish the true value of the latter two methods as intraspecific characterization markers for M. tuberculosis isolates.