TaqMan实时荧光PCR快速检测人HLA-B*27

目前,已有多种分子生物学技术被用于HLA-B * 27检测,如PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)和PCR-SSP等.但是这些方法都需要在PCR后进行凝胶电泳或杂交分析,不仅耗时,且易造成遗留污染与假阳性,还可能因使用强诱变剂溴乙锭为示踪剂,使其应用受到一定限制[1].TaqMan实时荧光PCR是20世纪90年代的新型核酸检测方法,其能实时监测PCR的荧光强度,同时进行扩增与检测,因而无需在PCR完成后进行凝胶电泳或杂交分析,不仅能有效避免遗留污染与假阳性,而且不用溴乙锭等强诱变剂[2-3].因此,其一出现即备受青睐,并被认为是基因分型、基因表达及基因突变检测的强有力工具.然而,目前尚鲜见TaqMan实时荧光PCR检测HLA-B*27的研究报道,本研究用其检测人HLA-B*27,以探讨其应用价值.     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测survivin甲基化状态

目的建立SYBR Green Ⅰ实时荧光聚合酶链反应（PCR）检测survivin甲基化的方法。方法25例胃癌组织标本及与其配对的正常胃组织经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后，再用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对survivin外显子1进行检测。实时荧光定量PCR检测survivin基因内含子2，用于监测经限制性酶消化的基因组DNA浓度变化，10倍系列稀释的基因组标准物用于检验实时PCR的敏感度，PCR产物通过凝胶电泳分析证实。结果经Hpa Ⅱ酶切后，甲基化的目的基因PCR产物在熔解曲线上有Tm值为（91．5±0．5）℃的峰，电泳证实为338bp的条带。所有经酶消化的样本都能扩增出以Tm值（79．5±0．5）℃为特征的对照基因（survivin基因内含子2），表明基因组DNA未产生严重的非特异性降解。SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测甲基化目的基因的灵敏度为10^0拷贝／μL。用以上新建的体系检测25例胃癌标本，发现其survivin基因外显子1的去甲基化频率为96％。结论SYBR GreenⅠ荧光PCR法具有快速、准确、敏感、实时、简单和敏感的特点，是检测survivin外显子1甲基化状态的一种可靠的新方法。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测生存素基因的方法建立及条件优化

目的建立SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测生存素（Survivin）基因定量的方法。方法根据PCR产物荧光强度、循环阈值（Ct值）、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件，对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况。结果SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是：Taq酶2．5U／100μl、MsCl2 2mmol／L、引物浓度0．2μmol／L和退火温度58℃；在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度，能有效消除引物二聚体对定量检测的影响；以二次倒数最大值方式确定Ct值，能避免主观因素所致误差。研究建立的SYBRGreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝／μl，线性范围10^1～10^4拷贝μl（r=0．9997），批内变异系数（CV）1．13％-1．91％，批间CV3．31％-4．50％；胃癌组织中Sttrvivin基因扩增率为13．9％（6／43）。结论优化后的SYBRGreenI实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性，可用于Survivin基因含量分析。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测尿液中大肠埃希菌方法的建立

大肠埃希菌(Escherichia coli,E. coli)是引起尿路感染的最常见病原菌,其病原学诊断主要依据细菌培养的结果[1],然而常规的培养法检测和鉴定大肠埃希菌需2～3 d的时间,常常延误诊断和治疗.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。     

实时荧光PCR法和流式细胞术检测HLA-B27的结果分析

目的比较实时荧光PCR法和流式细胞术两种方法检测人类白细胞抗原B27(HLA-B27)的临床应用价值。方法分别采用实时荧光PCR法和流式细胞术两种方法检测225例疑似强直性脊柱炎患者血中HLA-B27,比较和分析两种方法的检测结果。结果 95.11%样本检测结果相同,差异不具有统计学意义(P0.05),将存在差异的标本进行基因测序后,结果与实时荧光PCR的检测结果一致。结论两种方法检测HLA-B27均具有较高的灵敏度和特异度,实时荧光PCR法在结果的准确性上更优于流式细胞术。     

乙型肝炎病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及临床应用

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的快速方法,并探讨其临床应用价值。方法根据GenBank公布的Hepatitis B virus gp1基因序列设计引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,并对反应体系和扩增程序进行优化。定量标准品通过基因克隆方法获得,同时以浙江省夸克公司HBV DNA定量检测试剂盒作对照,应用于随机选取的100份乙型肝炎患者血清检测。结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检出限范围为5×10~2copies/ml~5×10~8copies/ml,HBV DNA浓度与CT值有良好线性关系,无交叉反应,整个过程仅需2.5 h。在随机抽取的100份临床标本应用中,与浙江省夸克公司的HBV荧光定量PCR检测试剂相比,建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR体系灵敏度100%,特异度92.5%。结论 SYBR Green实时荧光定量PCR快速、简便、灵敏度高、特异度强,可用于乙型肝炎患者病情监测,有效指导临床用药,准确评价HBV感染者的病情。     

SYBR Green Ⅰ聚合酶链反应检测人白细胞抗原-DRB1*12

目的 建立一种人白细胞抗原(HLA)基因分型方法。方法 用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ聚合酶链式反应(PCR)方法，对1份已知HLA—DRB1*12的标本和12份未知型别的临床标本进行HLA—DRB1*12位点检测和分型。结果 12份标本的扩增产物经熔解曲线分析，有3份标本为DRB1*12，产物用离心柱纯化后，直接进行DNA测序，结果证实为DRB1*12阳性。结论 SYBR Green Ⅰ PCR操作简便，结果准确，可成为一种HLA基因分型的新方法。     

SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR定量检测前列腺癌患者外周血DD3mRNA

目的建立一种新的方法定量检测前列腺癌(PC)患者外周血DD3 mRNA方法扩增LNCaP细胞株阳性表达的DD3mRNA,并以其扩增产物为外标准,通过优选引物及优化PCR的各项参数,建立了SYBR Green实时RT-PCR定量检测PC患者外周血DD3 mRNA的方法,并以此方法检测了健康男性志愿者、良性前列腺炎(BPH)患者和PC患者外周血DD3 mRNA。结果所建立的SYBR Green实时RT-PCR方法最少可检测到10拷贝的核酸,在每反应108-103copies/ml范围内,CT值与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为-0.992~-1;扩增后仅有的熔解曲线特异峰显示很好的特异性;不同标准点批间变异系数范围为6.1%-13.7%(n=5)。结论基于双链嵌合染料SYBR Green建立的RT-PCR定量检测DD3 mRNA方法具有敏感性高、线性检测范围广、特异性强、重复性较好的特点;PC患者外周血中可检测到DD3 mRNA表达。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测宫颈癌血清中miR-21的表达

摘要：目的：建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法检测宫颈疾病患者血清中miR-21的表达水平,探讨miR-21在宫颈癌临床监测中的意义。 方法：设计miR-21、U6茎环逆转录引物和PCR扩增引物,以U6为内参,用实时荧光定量PCR检测32例不同宫颈疾病患者血清中miR-21表达水平。 结果：建立的实时荧光定量PCR法能特异地检测血清中的miR-21扩增信号,熔解曲线单一,产物特异。宫颈癌患者血清中miR-21水平明显高于子宫肌瘤、宫颈炎等其他良性宫颈疾病（P<0.05）,而宫颈癌患者手术切除后血清中miR-21水平明显下降（P<0.05）。 结论：SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR是一种快速简便、敏感性高、特异性好的检测方法,对宫颈癌早期诊断、分子分期和预后判断有很好的应用前景。     

RT-PCR与SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒的比较

目的:比较RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法检测乙型脑炎病毒(JEV)的敏感性、特异性和时效性.方法:采用RT-PCR和SYBR GreenⅠ实时RT-PCR方法对连续10倍稀释的JEV核酸样品平行检测,比较两种方法的敏感性.同时以登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸进行两种方法的特异性测试.结果:SYBRGreen Ⅰ实时RT-PCR方法可检测出 40 copies/μL的核酸分子水平,与普通RT-PCR方法相比,敏感度提高了10倍,检测时间节省2 h.两种检测方法在检测JEV方面,与登革2型病毒、诺如病毒和狂犬病毒核酸均无交叉反应.结论:与普通RT-PCR相比,SYBR Green Ⅰ实时RT-PCR是一种更敏感、快速检测JEV的方法.     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物(简称茎环引物)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR),并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4+T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒(HPV)基因型别的关系,其聚合酶链反应(PCR)反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10-7nmol/L,在10-1~10-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数(r)为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4+T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关(P<0.05),但与本研究涉及的HPV基因型别无关(P>0.05)。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

茎环引物的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测miR-155表达及其临床初步应用

目的建立茎环状逆转录引物（简称茎环引物）的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）,并作初步应用。方法应用SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR检测CD4＋T细胞株的miR-155,初步验证方法的可行性。用所建立的方法对60份临床宫颈刮取物标本进行检测,分析miR-155与宫颈癌及感染的高危型人类乳头状瘤病毒（HPV）基因型别的关系,其聚合酶链反应（PCR）反应产物通过电泳验证产物特异性。结果所建方法能特异的检测到miR-155的扩增信号,最低检出限为10^-7nmol/L,在10^-1-10^-6nmol/L之间有良好的线性关系,相关系数（r）为0.99,扩增后惟一的熔解曲线特异峰显示很好的特异性。CD4^＋T细胞株及60例临床宫颈刮取物标本miR-155均显示阳性,PCR反应产物电泳可获得单一条带。宫颈刮取物miR-155与宫颈癌有关（P〈0.05）,但与本研究涉及的HPV基因型别无关（P〉0.05）。结论所建立的茎环引物的SYBR GreenⅠ实时FQ-PCR能快速、敏感、特异地检测细胞株和临床宫颈刮取物miR-155的表达水平,为进一步研究miR-155及其临床应用奠定了基础。     

SYBR Green实时定量PCR检测SDF-1α基因在乳腺癌中的表达

目的 探讨SDF-1α基因在人乳腺癌中的表达及其与肿瘤恶性程度之间的关系.方法 SYBR Green实时定量PCR方法定量检测SDF-1α mRNA在63例乳腺癌（TNM分期：I期9例,IIA期25例,IIB期13例,IIIA期16例）和20例正常乳腺组织中的表达;采用Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney检验等分析SDF-1α mRNA表达在不同临床参数间的表达差异.结果 乳腺癌中SDF-1α mRNA表达水平（1.41±1.18）低于正常乳腺组织（2.02±0.71）,P=0.031.SDF-1α mRNA在乳腺癌中表达下调与淋巴结转移数目（〉3个腋窝淋巴结转移）、ER表达情况（0,1＋,2＋）密切相关（P值分别为0.017、0.047）.但SDF-1α mRNA在不同年龄、绝经情况、组织学分级、病理类型、肿瘤大小以及其他免疫组化指标（PR、Her-2、p53和Ki-67）组间的差异均无统计学意义（P〉0.05）.结论 趋化因子SDF-1α表达下调参与乳腺癌的转移,有望成为乳腺癌治疗的新靶点.     

人类Gfi1基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础.方法 以Gfi1基因为靶基因设计引物.构建携带GficDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品.应用ABI stepone PCR仪对Cfi...     

人类Gfi1基因SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础.方法 以Gfi1基因为靶基因设计引物.构建携带GficDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品.应用ABI stepone PCR仪对Cfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线.结果 建立了Cfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数y2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%.结论 本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测.     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肺炎链球菌

目的利用实时荧光定量聚合酶链反应（实时PCR）方法进行肺炎链球茵的检测和流行病学调查。方法用实时PCR技术扩增并检测400例临床标本的肺炎链球菌的自溶素（1yt）基因,并将其与传统的培养法进行对比。结果400例,临床标本中,实时PCR检测肺炎链球菌为阳性的有78例（阳性率为18％）,传统培养法结果为阳性的有29例（阳性率为7．25％）。结论实时PCR是一种灵敏、特异、快速的检测肺炎链球菌方法,其可用于肺炎链球菌的诊断和流行病学调查。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌

目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染（CDI）的小鼠进行粪便含菌量检测评价。方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义。建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法。结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测。     

流式细胞术与定量PCR法检测HLA-B27的比对

目的评价实时荧光定量PCR法和流式细胞术两种方法检测人类白细胞抗原HLA-B27对强直性脊柱炎的临床诊断价值。方法将疑似强直性脊柱炎患者199例全血分别采用实时荧光定量PCR和流式细胞仪法检测HLA-B27,以流式细胞术HLA-B27阳性作为判断标准,确定实时荧光定量PCR法检测HLA-B27的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值。将流式细胞术HLA-B27阳性的样本44例,按照实时荧光定量PCR检测结果将其分为疑似组、阴性组及阳性组,确定有无表达抗原表达强度的差异。结果91.5%样本分型结果相同,差异不具有统计学意义（P〈0.05）。实时荧光定量PCR检测HLA-B27的敏感度为95.1%,特异度达到96.8%,阳性预测值为88.6%,阴性预测值为98.7%。实时荧光定量PCR检测疑似组、阴性组及阳性组,无显著表达抗原表达强度的差异。结论实时荧光定量PCR与流式细胞术检测HLA-B27具有相似敏感度和特异度,是一种较为快速、简单、有效的检测方法。