海马神经元谷氨酸损伤研究

目的:本研究通过观察体外培养的大鼠胚胎海马神经元在谷氨酸损伤后,细胞活力变化及细胞损伤的方式,初步探讨谷氨酸对神经元的损伤机制。方法:通过MTT,观察不同浓度(62.5μM、125μM、250μM、500μM)的谷氨酸损伤后不同时间(6 h、12 h、18 h、24 h)海马神经元活力的变化。经相差显微镜观察谷氨酸对海马神经元胞体及突起的影响。通过TUNEL、Hoechst染色比较正常培养组和损伤组的凋亡率,分析谷氨酸对海马神经元的损伤作用。结果:MTT结果显示,谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,在所观察的剂量范围内,随着谷氨酸浓度的增加,作用逐步增强,至500μM达峰值,随着损伤后孵育时间的延长,海马神经元活力逐渐下降。TUNEL和Hoechst染色结果也显示,125μM谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,主要引起海马神经元的凋亡。结论:谷氨酸对体外培养的胎鼠海马神经元有兴奋毒性,且这种作用呈现剂量相关性。中等剂量(125μM)谷氨酸损伤主要引起海马神经元的凋亡。     

谷氨酸对大鼠海马神经元的神经毒性反应

目的为明确谷氨酸作为一兴奋性氨基酸对中枢神经系统兼有兴奋性和毒性作用的机理.方法实验 选择具有较多NMDA受体的海马作为研究对象,选用SD种大鼠,给予MSG(MonosodiumL-glutamate剂量为 18mmol/kg)皮下注射,在不同的时间内观察大鼠的行为表现和其海马神经组织受损的超微结构的变化.结果大 鼠的早期行为表现较为兴奋,而后随时间的延长表现为迟钝;神经细胞早期为水肿,后期为水肿明显和细胞器的破 坏直至细胞的固缩,这些损伤主要表现在CA1区;同时在损伤的神经元周围常可见小胶质细胞的存在.结论表明 边缘系统的海马结构易受谷氨酸的影响,同时也表明了谷氨酸对神经细胞的兴奋毒性作用,此为临床药物和食物 添加剂的运用可提供一定的依据.     

白黎芦醇对离体培养的大鼠海马CAl区神经元谷氨酸神经毒性的保护作用

目的研究白黎芦醇对谷氨酸神经毒性损伤的离体大鼠海马CA1区神经元的保护作用及其机制。方法将1．5mmol·L-1的谷氨酸加入到原代培养的新生大鼠海马CA1区神经元培养液中,制造神经元毒性损伤模型;将20μmol·L-1的白黎芦醇分别加入到原代培养正常的和兴奋性毒性损伤的海马CA1区神经元培养液中,观察细胞形态和存活率变化（噻唑蓝法和Hoechst33324荧光染色法）;Westernblot检测细胞色素C来反映谷氨酸对神经元的损伤作用,同时观察白黎芦醇对抗损伤的机制。结果谷氨酸对海马CA1区神经元产生强烈的兴奋性毒性,导致神经元大量凋亡和死亡;20μmol．L-1的白黎芦醇对正常神经元的形态和存活率均无明显影响,但能对抗谷氨酸损伤和减轻谷氨酸的兴奋性神经毒性,同时抑制谷氨酸诱发的细胞色素C表达上调。结论白黎芦醇可通过下调海马CA1区神经元细胞色素C的表达水平,降低谷氨酸的兴奋性毒性,对神经元起到保护作用。     

右美沙芬对培养神经元谷氨酸兴奋毒性的拮抗作用

目的 研究过量谷氨酸对皮层神经元的影响以及右美沙芬对此的拮抗作用。方法 采用１６￣１８ｄ胎龄的大鼠皮层细胞进行分离培养。以培养上清液中乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性作为细胞损伤的指标。 结果 外源性谷氨酸（１０和５０μｍｏｌ／Ｌ）引起ＬＤＨ释放增加，而这种作用皆被右美沙芬所抑制。结论 右美沙芬对外源性谷氨酸引起的神经元损伤有保护作用。     

缺氧及谷氨酸对大鼠海马神经元NMDA通道的影响

目的 观察大鼠海马神经元模拟缺血缺氧时谷氨酸诱发电流的改变,研究缺氧和谷氨酸对大鼠海马神经元N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)通道开放动力学的影响,为中枢神经损伤的康复提供理论依据.方法 实验分为6组;①对照组通氧 20μmol/LL-Glu 1.0μmol/L Gly;②组1通氧 50μmol/LL-Glu 1.0 μmol/L Gly;③组2通氧 100 μmol/L L-Glu 1.0 μmol/L Gly;④组3通氧 200μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly;⑤组4缺氧 20 μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly;⑥组5缺氧 20 μmol/L L-Glu 1.0μmol/L Gly 30 μmol/L MK-801.以原代培养的大鼠海马神经元为标本,运用膜片钳技术的细胞吸附式方法记录NMDA通道的单通道电流.结果 在急性缺氧条件下,NMDA通道的开放时间常数τ1,τ2较对照组延长,分别由(0.47±0.12)ms,(5.42±0.33)ms变为(1.02±0.17)ms,(7.47±0.93)ms;关闭时间常数τ1,τ2较对照组明显缩短,分别由(21.13±4.21)ms,(167.83±23.23)ms变为(6.54±1.44)ms,(21.32±2.87)ms;平均开放概率增大,由0.17±0.11变为0.79±0.32,差异有显著意义(P＜0.05).谷氨酸浓度增加时,NMDA通道开放时间常数增大,关闭时间常数减小,开放概率增大.结论 缺氧及谷氨酸能提高海马神经元NMDA通道的兴奋性,促进NMDA通道开放增加.     

吡咯喹啉醌对谷氨酸损伤大鼠海马神经元Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察吡咯喹啉醌(PQQ)对谷氨酸损伤海马神经元存活和Bcl-2、Bax表达的影响。方法:原代培养胚鼠海马神经元,谷氨酸损伤15min后加入不同浓度的PQQ(50、100、200μmol/L)孵育24小时,采用MTT法检测细胞活性;Western blot法检测Bcl-2、Bax的表达。结果:不同浓度PQQ均可明显改善谷氨酸损伤后细胞的活力,增加Bcl-2/Bax的比值,且随浓度增加比值增高。结论:PQQ对谷氨酸损伤的海马神经元具有一定保护作用。     

丹参酮对原代大鼠海马神经元细胞缺氧缺糖损伤的保护作用

目的观察缺氧缺糖对大鼠海马神经元细胞的影响及丹参酮的保护作用。方法取体外培养12天的海马神经元细胞随机分为正常对照组、缺氧缺糖组、丹参酮20μmol／L组、丹参酮40μmol／L组、丹参酮80μmol／L组（后3组缺氧缺糖前24h,加入丹参酮预处理）。缺氧缺糖组、各浓度丹参酮组在缺氧缺糖环境中培养2、4、24及36h后,收集其各个时间点的培养液,测定培养液中乳酸脱氢酶（LDH）含量。结果缺氧缺糖后,缺氧缺糖组各个时间点LDH渗出量明显高于正常对照组,经丹参酮预处理的神经元损伤有不同程度的减轻,各个时间点LDH渗出量明显低于对应的缺氧缺糖组。结论缺氧缺糖可引起海马神经元损伤,丹参酮对海马神经元细胞损伤具有保护作用。     

烟碱拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用

[目的]研究烟碱对皮质神经元的保护作用。[方法]在培养至第6天的皮质神经元中以不同浓度(1μmol／L，10μmol／L，100μmol／L)烟碱预孵2h，再加入0．1μmol／L秋水仙碱作用24h。通过相差显微镜形态学观察，Hoechst33258核荧光染色进行凋亡率计数和测定乳酸脱氢酶相对释放量(LDH)的实验，再测试10μmol／L预孵不同时间(0．5，2，8)h的烟碱对秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。[结果]秋水仙碱可诱导皮质神经元调亡，烟碱可拮抗秋水仙碱的此种作用。其中10μmol／L烟碱预孵2h保护作用最强。[结论]烟碱可拮抗秋水仙碱诱导大鼠大脑皮质神经元凋亡的作用。     

白果内酯对谷氨酸兴奋毒性致神经损害的保护作用

目的 观察不同剂量白果内酯对谷氨酸致海马神经元损害的影响,以探讨白果内酯在抗兴奋毒性神经损害中的应用价值。方法 原代培养新生 SD 大鼠海马神经元,建立谷氨酸诱导的兴奋毒性模型;采用台盼蓝染色、TUNEL 染色凋亡神经元测定及乳酸脱氢酶 (LDH) 活性测定的方法观察不同剂量白果内酯的神经保护作用,并与谷氨酸 NMDA (-甲基-D-天门冬氨酸盐) 受体非竞争性拮抗剂 MK-801 的神经保护作用相比较。结果 在一定剂量范围内,白果内酯可提高谷氨酸损伤的海马神经元细胞的存活率、降低细胞凋亡率、减少细胞中 LDH 的漏出,具有剂量依赖性,于 100 μmol/L 剂量下呈现最佳神经保护效果,但弱于 MK-801 (浓度为 10 μmol/L)。结论白果内酯对谷氨酸诱导的兴奋毒性神经损害具有保护作用。     

葛根素对喹啉酸致海马神经元损伤的保护作用

目的研究葛根素对喹啉酸(qinolinic acid,QA)诱导原代培养乳鼠海马神经元兴奋毒损伤的保护作用。方法乳鼠海马神经元原代培养后用QA诱导损伤,采用MTT法测定细胞活力,同时测定培养上清液中乳酸脱氢酶 (LDH)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果葛根素(3×10-4mol／L、10-4 mol／L)剂量能明显提高QA致损伤的原代培养乳鼠海马神经元的细胞活力,降低其上清液中LDH活性和MDA含量,与模型组比较差异均具有显著性(P <0．01)。结论葛根素(3×10-4moL／L,10-4 mol／L)对QA所致的原代培养乳鼠海马神经元损伤有明显保护作用。     

SD乳鼠海马神经细胞原代培养方法的探讨

目的 寻求一种简单、廉价的原代SD乳鼠海马神经细胞培养方法.方法 采用胰蛋白酶消化法制备游离海马神经细胞悬液,进行培养.结果 通过多次探索、观察、成功的进行了原代海马神经细胞培养.结论 本方法适合一般实验室开展海马神经细胞培养.     

救脑益智胶囊水提液对半乳糖老化小鼠海马神经元损伤的保护作用

为观察救脑益智水提液对半乳糖老化小鼠海马神经元的神经元存活信号转导通路和凋亡级联反应中某些蛋白质表达的影响 ,将昆明种小鼠分为 4组 (每组 2 4只 ) :正常对照组 (C组 )、D 半乳糖老化模型组 (D组 )、大剂量药物治疗组 (B组 )和小剂量药物治疗组 (S组 )。除C组外 ,3组小鼠每日皮下注射半乳糖 5 0mg/kg。其中B组和S组每日分别灌胃救脑益智胶囊水提取液 ,相当于生药 1 g/kg和 0 .3 g/kg ,C组和D组分别灌胃等量生理盐水 ,共 3个月。结果 :D组小鼠海马神经元中Akt/PKB(蛋白激酶B)、CREB(cAMPresponseelementbindingprotein)和Bcl 2的免疫组化阳性细胞数明显减少 ,而AIF(凋亡诱导因子 )和Bax明显增加 ,PP 1 (蛋白磷酸酯酶 1 )也明显减少。S组上述改变恢复正常 ,而B组却无此作用。提示 :小剂量救脑益智水提液对半乳糖老化模型小鼠海马神经元的存活信号转导通路和凋亡级联反应的改变具有恢复正常的作用 ,而大剂量则无此作用。     

腺苷对原代培养的大鼠海马神经元大电导钙激活钾通道的作用

目的在离子通道水平研究腺苷对原代培养的大鼠海马神经元大电导钙激活钾通道(BKCa)的作用。方法采用新生24h的乳鼠,取出海马,清除表面血管,以胰酶消化和巴氏管吹打的方法制备海马神经元,细胞培养6～8d后,MAPⅡ染色鉴别神经元表面标志;采用全细胞膜片钳技术,对细胞进行封接、破膜并记录BKCa通道电流,以细胞旁方式给药观察不同浓度腺苷对BKCa通道的作用。结果原代培养的海马神经元上可以成功记录到BKCa电流,其为一组幅值较大,可以快速激活且几乎不失活的外向电流;腺苷(1～100μmol/L)可以增大BKCa电流,浓度越高,增长幅度越大;100μmol/L腺苷对BKCa电流的影响具有电压依赖性,同时它还可以使BKCa电流的激活曲线负向漂移。结论腺苷可以增大海马神经元BKCa电流幅值,这可能是腺苷作为内源性抗癫痫物质发挥抗癫痫作用的机制之一。     

海洋甾体YC-1抑制低钾诱导大鼠小脑颗粒神经元的凋亡

【目的】观察海洋甾体YC 1对低钾 (5mmol/L ,lowK )诱导小脑颗粒神经元凋亡的影响 ,并对其机制进行初步探讨。【方法】小脑颗粒神经元原代培养 ;采用二乙酸荧光素 (fluoresceindiacetate ,FDA)和Hoechst 332 5 8DNA染色法观察神经元存活率及形态学特征 ;用琼脂糖凝胶电泳分析神经元死亡的生化特征。【结果】低钾引起小脑颗粒神经元凋亡。Hoechst332 5 8DNA染色表现出染色体固缩 ,DNA凝胶电泳表现出由大小不一的断裂DNA片段形成的“梯形”条带。YC 1(1 2 5～ 2 0 μmol/L)呈时间和剂量依赖性地抑制上述现象的出现。蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (cycloheximide)不能改变由不同孵育时间造成的YC 1对神经元不同保护效果的差异。【结论】YC 1抑制低钾诱导小脑颗粒神经元凋亡 ,YC 1的这一作用可能属于一非基因效应。     

IGF-1对海马神经元抑制性突触传递的影响

目的观察胰岛素样生长因子1(IGF-1)对原代培养海马神经元抑制性突触传递的影响并探讨其可能机制。方法采用无血清培养基培养海马神经元,在10~14d时用于实验。电生理实验分为正常对照组和IGF-1处理组(实验前24h加入IGF-1,终浓度为10μmol/L)。细胞免疫化学实验分为正常对照组、IGF-1处理组和MAPKS转导通路抑制剂(PD98059)预处理组(IGF-1处理前1h加入PD98059,终浓度为10μmol/L)。采用全细胞膜片钳记录方法观察IGF-1对抑制性突触后电流(IPSC)的影响,用细胞免疫化学方法观察其对γ-氨基丁酸能细胞数目影响。结果IGF-1能够显著降低IPSC的频率,但与对照组比较其幅度差异无统计学意义;IGF-1能够明显减少GABA阳性细胞数目,应用PD98059后可阻断这种作用。结论IGF-1的上述作用可能参与海马对学习记忆功能的调节过程。     

Experimental Study of Effect of Corticosterone on Primary Cultured Hippocampal Neurons and Their Ca2+/CaMK Ⅱ Expression

To explore the effect of different concentrations of corticosterone (CORT) on primary cultured hippocampal neurons and their Ca2+/CaMK Ⅱ expression and possible mechanism, the changes of hippocampal neurons were observed in terms of morphology, activity of cells, cell death,concentrations of cytosolic free calcium, and the expression of CaMK Ⅱ by using MTT assay, flow cytometry, fluorescent labeling of Fura-2/AM and Western blotting after 10-7, 10-6 and 10-5 mol/L of CORT was added to culture medium, The evident effect of 10-6 and 10-5 mol/L of CORT on the morphology of hippocampal neuron was found. Compared with control neurons, the activity of the cells was markedly decreased and [Ca2+]i increased in the neurons treated with 10-6 and 10-5mol/L of CORT, but no change was observed in the neuron treated with 10-7 mol/L of CORT.The death was either by way of apoptosis or necrosis in the cells treated with 10-6 and 10-5 mol/L of CORT respectively. The correlation analysis showed that a reverse correlation existed between[Ca2 ]i and the expression of CaMK Ⅱ. Either apoptosis or necrosis occurs in the hippocampal neurons treated with CORT. The increased hippocampal [Ca2+ ]i is both the result of CORT impairing the hippocampal neurons and the cause of the apoptosis of hippocampal neurons and the decreased CaMK Ⅱ expression.     

人参皂苷Rg1对吗啡依赖海马神经元胞内游离钙离子浓度的影响

目的探讨人参皂苷Rg1对吗啡依赖海马神经元胞内游离钙离子浓度(intracellular free Ca2+concentration,[Ca2+]i)的影响。方法采用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM,利用激光扫描共聚焦显微镜观察低剂量(1μmol/L)、中剂量(10μmol/L)、高剂量(100μmol/L)人参皂苷Rg1处理吗啡依赖原代培养大鼠海马神经元后[Ca2+]i的改变。结果低、中、高剂量人参皂苷Rg1单独处理海马神经元前后并没有引起胞内[Ca2+]i的显著改变(P>0.05),而吗啡依赖海马神经元胞内[Ca2+]i较正常海马神经元细胞明显增高(P<0.01)。此外,低、中、高剂量人参皂苷Rg1处理吗啡依赖海马神经元细胞后,均能显著抑制胞内[Ca2+]i的升高(P<0.01),并呈剂量依赖性,Rg1剂量越大,抑制作用越明显(P<0.01)。结论人参皂苷Rg1可以抑制吗啡依赖海马神经元细胞内[Ca2+]i的增高,对吗啡的成瘾性具有明显的拮抗作用,为合理安全有效地应用人参戒毒提供了实验依据。     

谷氨酸影响培养的海马神经元内钙变化机制

目的:研究谷氨酸对培养的大鼠海马神经元内钙信号的影响及作用机制。方法:用显微荧光测量技术监测神经元内钙信号的动态变化和谷氨酸对其的影响;阻断NMDA、AMPA受体后,观察谷氨酸对神经元内钙信号影响的变化。结果:谷氨酸使神经元内游离钙浓度明显升高,NMDA和AMPA受体拮抗剂、胞外钙离子浓度的降低均可不同程度地降低胞内游离钙离子升高幅度。结论:谷氨酸通过多种途径影响大鼠海马神经元内钙信号,激活NMDA和AMPA受体是其中的重要机制之一。     

3'-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤的保护作用

目的：探讨3'-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤的保护作用的影响。方法：取新生SD大鼠（0~24 h）海马区制成单细胞悬液进行体外培养,待细胞发育成熟后,用去血清的培养基制作海马神经元损伤模型,造模同时给予3'-大豆苷元磺酸钠(3.0,10.0,30.0 µmol•L-1)处理,继续培养24 h,采用MTT法检测细胞活性;并观察细胞形态的改变;取培养上清,测定去血清海马神经元中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）活性。结果：形态学观察模型组海马神经元细胞膜边界相对模糊,细胞皱缩,神经突触回缩,少量细胞贴壁不牢;其上清液中去血清海马神经元中LDH活性升高;MTT法检测结果显示去血清海马神经元活性降低;给予3'-大豆苷元磺酸钠处理后,镜下观察可见细胞膜边界清楚,胞体饱满,神经突触回缩不明显,细胞贴壁良好;去血清海马神经元细胞活性升高,去血清海马神经元LDH活性降低。结论：3′-大豆苷元磺酸钠对去血清所致海马神经元损伤具有显著的保护作用。