甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3,8活性与mRNA表达水平变化

目的:观察甘氨脱氧胆酸盐(Glycodeoxycholate,GCDC)诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspaae-3,8活性与mRNA表达水平的变化,探讨GCDC诱导肝细胞凋亡的机制.方法:体外培养HL-7702细胞,不同浓度的GCDC为处理因素,用Annexin V-FITC/PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase-3,8活性,RT-PCR检测caspase-3,8mRNA表达水平.结果:100-250 μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24 h后,其细胞凋亡率、caspaSe-3,8活性与mRNA表达水平明显升高,并与GCDC呈浓度依赖性.结论:caspase-3,8参与GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的调控,GCDC通过活化caspase-8,并进一步活化caspase-3从而诱导肝细胞凋亡.     

乙肝病毒X基因的转染及表达对HL-7702肝细胞凋亡的影响

目的 探讨乙肝病毒(HBV)X基因及其蛋白产物HBxAg对肝细胞HL-7702凋亡的影响，阐释HBVX基因及产物在包括肝细胞癌(HCC)的HBV感染相关疾病中的作用。方法 用分子克隆方法构建HBVX基因重组质粒pcDNA3-X，并用脂质体转染法将其导入肝细胞HL-7702中，G418选择培养，RT-PCR鉴定以构建稳定表达HBVX基因的肝细胞株HL-7702／HBx．以转染空质粒pcDNA3的HL-7702(HL-7702／pcDNA3)和未转染的HL-7702作对照，用流式细胞分析，TUNEI．技术和电镜来分析细胞凋亡情况。用pcDNA3-X瞬时转染肝细胞HL-7702，在转染后24．48，72．96，120h，分别抽提RNA后用RT-PCR法对HBVX基因表达进行半定量检测，并对不同时段的转染细胞行流式细胞分析探讨肝细胞凋亡的状况。结果 重组质粒pcDNA3-X转染后经G418筛选，肝细胞株HL-7702／HBx经RT-PCR鉴定证实有稳定表达HBVX基因；流式细胞、TUNEL技术显示HL-7702／HBx细胞凋亡明显高于HL-7702／pcDNA3和HL-7702．电镜报告HL-7702／HBx细胞出现凋亡现象．有凋亡小体，对照组未发现；瞬时转染RT-PCR显示转染后72hHBVX基因表达量最高，流式细胞仪分析发现肝细胞凋亡于72h达到最高值，之后随着X基因表达量下降，肝细胞凋亡减少。结论 HBVX基因及其蛋白产物X蛋白有促进HL-7702肝细胞凋亡的作用．二者间存在着量效关系．即X基因表达越高，肝细胞凋亡越明显。HBxAg通过调控肝细胞凋亡在肝细胞的恶性转化中起重要作用。     

甘氨脱氧胆酸盐诱导人正常肝细胞株HL-7702凋亡过程中caspase-3，8，9蛋白活性变化及凋亡机制研究

目的观察甘氨脱氧胆酸盐（glycodeoxycholate,GCDC）诱导人正常肝细胞株HL．7702凋亡过程中caspase．3,8,9活性的变化,探讨其凋亡机制。方法体外培养HL-7702细胞,以GCDC为处理因素,用AnnexinV．F1TC／PI双染色法结合流式细胞技术仪检测细胞凋亡率,比色法测定caspase-3,8,9活性。结果100、150、200、250μmol／L的GCDC处理HL-7702细胞24h后以及250μmol／LGcDc处理细胞4、8、12、24h后,其细胞凋亡率、caspase-3,8,9活性明显升高,与对照组比较,差异有统计学意义（P〈O．05）。结论GCDC可通过活化caspase-8,9,进而激活caspase-3从而诱导肝细胞凋亡。     

甘氨鹅脱氧胆酸盐对人正常肝细胞HL-7702的影响

目的 观察甘氨鹅脱氧胆酸盐(glycochenodeoxcholate,GCDC)对人正常肝细胞HL-7702凋亡诱导作用,探讨GCDC诱导HL-7702细胞凋亡的机制.方法 终浓度分别为50、100、150、200、250 μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞4、8、12、24 h,光学显微镜镜下观察细胞形态学改变、用Am-Blue 细胞活性检测和乳酸脱氢酶活性的测定及AnnexinV-FITC/PI双染色法检测GCDC对HL-7702细胞凋亡的影响,用荧光指示剂Fluo-3/AM测定HL-7702细胞内钙离子浓度.结果 (1)终浓度为150 μmol/L的GCDC处理HL-7702细胞24 h后,细胞出现典型的凋亡细胞形态学改变,包括核固缩、核碎裂和凋亡小体形成等.(2)Am-Blue吸光光度法、GENMED 乳酸脱氢酶(LDH)总活性比色法及 AnnexinV-FITC/PI双染色法定量检测结果均显示, GCDC均可诱导HL-7702细胞凋亡且呈剂量及时间依赖性.(3)GCDC能使HL-7702细胞内钙离子浓度增加且具有浓度和时间依赖性.结论 GCDC可能通过增加HL-7702细胞内钙离子浓度诱导人正常肝细胞HL-7702凋亡,其作用具有浓度和时间依赖性.     

甘薯黄酮对CCl4所致肝细胞损伤的保护作用

目的研究甘薯黄酮对CCl4所致肝细胞损伤的保护作用及其初步作用机制。方法体外培养人正常肝细胞株HL7702,MTT法测定甘薯黄酮对HL7702细胞活性的影响;建立CCl4损伤肝细胞模型,测定甘薯黄酮对CCl4损伤肝细胞增殖活性、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化;琼脂糖凝胶电泳法检测甘薯黄酮对CCl4损伤肝细胞凋亡的影响。结果甘薯黄酮在一定剂量范围(1～1 000μg/ml)内对肝细胞无毒性,超过一定剂量(3 000μg/ml)时,具有细胞毒性;甘薯黄酮可以抑制CCl4所致肝细胞活性降低,能明显抑制CCl4损伤后ALT、AST、MDA水平的升高和SOD活性的减弱;400μg/ml甘薯黄酮能减轻CCl4所致的肝细胞凋亡。结论甘薯黄酮对体外培养正常人肝细胞株的安全剂量范围是1～1 000μg/ml。甘薯黄酮在安全剂量范围内能保护CCl4诱导的HL7702细胞损伤,减轻CCl4所致细胞凋亡。     

HBVX基因在HL-7702肝细胞中的表达促进细胞凋亡并上调HSP70基因的表达

目的研究乙型肝炎病毒X（HBVX）基因在肝细胞HL-7702中的稳定表达对其细胞凋亡和表达HSP70的影响,并探讨二者之间的关联。方法将已构建好的HBVX基因真核表达载体pcDNA3-X转染人肝细胞HL-7702,48h后经G418筛选出稳定表达HBVX基因的肝细胞株（L02/HBx）。RT-PCR、蛋白印迹实验鉴定L02/HBx细胞HBVX基因的稳定表达。以转染空质粒肝细胞（L02/pcDNA3）为对照,运用流式细胞分析、TUNEL分析和DNA ladder观察检测L02/HBx细胞凋亡情况。基因芯片技术筛查L02/HBx和L02/pcDNA3两组肝细胞差异表达的凋亡相关基因,并运用蛋白印迹实验技术对差异表达的HSP70基因进行蛋白水平验证。 结果RT-PCR和蛋白印迹实验显示,L02/HBx细胞中有HBVX基因mRNA和蛋白的表达。流式细胞和TUNEL分析显示,L02/HBx细胞组的凋亡率显著高于对照组L02/pcDNA3,DNA ladder可观测到L02/HBx的凋亡现象,而对照组未观测到。两次基因芯片结果筛查出L02/HBx细胞组与对照组差异表达基因HSP70,蛋白印迹实验进一步证实HSP70在L02/HBx细胞中的蛋白表达显著高于未表达X基因的肝细胞组。结论HBVX基因在肝细胞HL-7702中的表达促进了肝细胞的凋亡,上调了肝细胞中HSP70基因的表达,从而在乙型肝炎病毒致肝细胞癌变的过程中起重要作用。     

巯基乙酸-碲化镉量子点对人肝细胞毒性和DNA损伤的诱导作用

目的：研究巯基乙酸（TGA）包覆的碲化镉(CdTe)量子点（QDs）对人正常肝HL-7702细胞的毒性和DNA损伤的作用,为QDs毒理学研究和安全性评价提供实验依据。方法：实验设立对照组和不同浓度CdTe QDs作用组（浓度分别为6.25、12.50、25.00和50.00 mg/L）。CdTe QDs作用于HL-7702细胞后,分别采用MTT法检测细胞增殖变化,单细胞凝胶电泳法（SCGE）检测细胞DNA损伤情况,PI单染流式细胞术（FCM）检测细胞周期变化,AO/EB双荧光染色法和Annexin Ⅴ- FITC/PI双染FCM检测细胞凋亡情况。结果：MTT法,CdTe QDs可抑制HL-7702细胞增殖,并存在剂量-效应和时间-效应关系;SCGE和PI单染FCM法,CdTe QDs作用于HL-7702细胞24 h后,随着剂量的增加,DNA损伤率逐渐增高,G0/G1期细胞百分率显著下降,S期和G2/M期细胞百分率明显上升（P<0.05）;AO/EB检测,CdTe QDs作用后细胞出现凋亡形态学改变;Annexin Ⅴ-FITC/PI双荧光标记FCM法,CdTe QDs染毒可促进细胞凋亡,各剂量组细胞凋亡率与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：CdTe QDs可影响细胞存活,引起DNA损伤、细胞周期阻滞,并诱导细胞凋亡。     

重组肝细胞生长因子质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

目的 构建人肝细胞生长因子(hHGF)真核表达质粒,探讨重组质粒对体外培养胎兔成骨细胞增殖分化的影响,为转基因治疗骨科疾病提供实验基础.方法 RT-PCR扩增人肝脏中hHGF全长cDNA片段,克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中,用脂质体法将pcDNA3.1( )-hHGF质粒转染成骨细胞,通过G418筛选获得阳性克隆,用免疫荧光染色检测hHGF基因在成骨细胞内的表达;MTT法和FCM检测pcDNA3.1( )-hHGF转染后对细胞增殖和细胞周期的影响;采用RT-PCR和ELISA方法检测hHGF在成骨细胞中的表达.NPP法检测碱性磷酸酶合成情况.结果 成功构建hHGF真核表达质粒,免疫组化和RT-PCR检测显示转染成骨细胞后细胞内hHGF mRNA呈现高水平表达;MTT法和FCM检测显示重组质粒转染后能促进成骨细胞的增殖,S期细胞比例增多;ELISA法检测到hHGF在细胞中有分泌性表达.转染重组质粒的成骨细胞合成碱性磷酸酶能力显著提高.结论 成骨细胞经基因转染后可以表达hHGF,外源性hHGF基因能够刺激成骨细胞增殖、分化及成骨活性.     

胰腺癌细胞ASPC-1凋亡过程中caspase 1和2的表达

目的 :探讨细胞凋亡过程中 caspase- 1和 caspase- 2的表达及其意义。　方法 :胰腺癌细胞系 ASPC- 1无血清培养 2 4h后加入 IFN- γ,于 6、1 2和 2 4h收集细胞 ,检测细胞凋亡情况 (流式细胞法 )和 caspase- 1和 caspase- 2蛋白质表达 (western blot法 ) ,以不加 IFN -γ的细胞为对照组。　结果 :IFN-γ刺激可诱导 ASPC- 1细胞的凋亡 ,随着时间延长凋亡数量增多 ,2 4h达 9%。Caspase- 1和 caspase- 2表达随时间而增强 ,对照组轻度表达。　结论 :Caspase- 1和 cas-pase- 2在细胞凋亡过程中表达 ,是重要的凋亡调节基因     

目的基因CXCL-1慢病毒表达系统的构建及在人正常肝细胞中的功能研究

目的：探讨含目的基因趋化因子生长调节基因1（CXCL-1）慢病毒表达系统的构建及CXCL-1对7702正常肝细胞生长、增殖、迁移生物学功能的影响。方法：构建含目的基因CXCL-1的慢病毒表达系统,建立携带GFP荧光标记并过度表达CXCL-1的7702正常肝细胞系,Western blot方法检测CXCL-1在转染细胞中的表达,细胞单克隆形成实验,MTT实验,Transwell实验检测7702细胞表达CXCL-1后生长、增殖和迁移能力的变化情况。结果：1成功构建目的基因CXCL-1慢病毒表达系统,病毒滴度检测结果为2.00E＋8TU/mL;2转染48h后经流式细胞仪检测,转染率达94.5%;3CXCL-1/7702组克隆形成率显著高于其余两对照组（P〈0.05）;4MTT比色法结果显示：CXCL-1/7702组分别与空载GFP/7702组及空白对照7702组相比较,生长速度明显较快（P〈0.05）;5Transwell实验显示：CXCL-1/7702组、GFP/7702组、7702组肝细胞系均无迁移能力。结论：成功构建含目的基因CXCL-1的慢病毒表达系统,CXCL-1对正常肝细胞具有明显的促细胞生长与增殖功能,但无促进正常肝细胞迁移的功能。     

外源性antizyme1基因转染对SH-SY5Y细胞的生物学影响

目的 研究antizyme 1(AZl)基因对成人神经廇SH-SY5Y细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响.方法 将构建好的AZ1基因重组真核表达载体pAZ1m稳定转染SH-SY5Y细胞.通过MTT法检测细胞增殖变化,流式细胞术分析AZ1转染对细胞周期及凋亡的影响.RT-PCR与Western blotting检测AZ1基因转染对cyclin D1和caspase-3表达的影响,caspase-3试剂盒检测酶活性变化.结果 稳定转染SH-SY5Y细胞后,检测结果显示AZ1基因转染能够减慢SH-SY5Y细胞增殖速度,并使细胞停滞于G0/G1期.在cyclin D1基因表达抑制的同时,caspase-3基因表达上调.酶活性测定显示Caspase-3活性上升.结论 AZ1基因能够抑制SH-SY5Y细胞增殖,通过降低cyclin D1的表达阻滞细胞周期于G0/G1期,并上调caspase-3表达促进SH-SY5Y细胞凋亡.     

人肝细胞生长因子真核表达载体的构建及在COS7细胞中的表达

目的:构建人肝细胞生长因子（HGF）的真核表达载体,并在COS₇细胞中进表达。方法:利用PCR技术扩增HGF基因,与PCI-Neo载体连接,构建成重组真核表达载体PCI-neo-HGF,应用限制性内切酶法及测序方法进行鉴定。利用脂质体将PCI-HGF转入COS₇细胞系中,用ELISA法检测培养液上清中的HGF的表达水平。结果:重组真核表达载体PCI-neo-HGF经限制性内切酶分析,片段与理论值相符,测序结果与GenBank 对比, HGFcDNA序列同源性99%, 插入正确;将重组真核表达载体PCI-neo-HGF转染COS₇细胞,于转染12 h开始有表达,36～72 h表达量较高(约2 000 ng•L^-1),以后逐渐下降。结论: 成功构建了带有HGF 基因真核表达载体,并能在转染细胞中表达。     

survivin反义寡核苷酸激活caspase-3诱导SGC7901胃癌细胞凋亡的实验研究

目的研究转染生存素（survivin）反义寡核苷酸诱导SGC7901胃癌细胞凋亡及其可能的作用机制。方法实验分为空白对照组（Control组）、脂质体组（Lip组）、正义寡核苷酸组（Sodn组）及反义寡核苷酸组（Asodn组）。人工合成正、反义寡核苷酸,经脂质体将survivin正、反义寡核苷酸转染人胃癌细胞48h后,MTT检测细胞增殖抑制率,Western blot检测caspase-3蛋白表达改变,Hoechst染色观察细胞凋亡形态改变及流式细胞仪检测凋亡率。结果Hoechst染色荧光显微镜下Control组、Lip组及Sodn组细胞核呈正常的蓝色,而Asodn组细胞核染色增强、核质浓缩、核碎裂,呈凋亡改变;Asodn组细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、caspase-3蛋白表达均增高,与Control组、Lip组及Sodn组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论survivin反义寡核苷酸可诱导胃癌细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活caspase-3表达,启动凋亡信号传导。     

IL-10对稳定转染HBx基因的HL-7702细胞增殖的影响

目的 探讨白细胞介素-10(IL-10)在稳定转染乙型肝炎病毒X(HBx)基因的HL-7702肝细胞增殖的作用及机制.方法 CCK-8法测定HBx基因对HL-7702细胞增殖的作用及IL-10对HL-7702/HBx细胞增殖的作用;流式细胞术测定IL-10对HL-7702/HBx细胞凋亡的影响;RT-PCR法测定HBx基因对HL-7702细胞表达CDKN1B蛋白质mRNA的作用及IL-10对HL-7702/HBx表达CDKN1B mRNA的作用.结果 CCK-8法显示,HL-7702/HBx细胞比HL-7702细胞和HL-7702/MOCK细胞增殖速度明显加快(P<0.05);80 ng/mL的IL-10作用24 h可抑制HL-7702/HBx细胞增殖(P<0.05);流式细胞术显示,80 ng/mL的IL-10作用24 h对HL-7702细胞、HL-7702/HBx细胞及HL7702/MOCK细胞凋亡均无影响;RT-PCR法显示,HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA表达量较HL-7702细胞和HL-7702/MOCK细胞降低(P<0.05),80 ng/mL的IL-10作用24 h后,HL-7702/HBx细胞较HL-7702/HBx空白组CDKN1B mRNA表达量上调(P<0.05).结论 HBx基因可促进HL-7702细胞增殖,IL-10可抑制HL-7702/HBx细胞增殖而对其凋亡无影响.HBx基因可能通过下调HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA的表达量而促进细胞增殖,IL-10可能通过上调HL-7702/HBx细胞CDKN1B mRNA的表达量而抑制细胞增殖.     

吲哚美辛诱导的HL-60白血病细胞凋亡与JNK信号转导途径活化

目的 :观察吲哚美辛对HL 6 0白血病细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用 ,了解C JunN 末端激酶 (JNK)信号转导途径在介导吲哚美辛诱导的HL 6 0细胞凋亡中的活化状态 ,揭示吲哚美辛诱导HL 6 0细胞凋亡的分子机制。方法 :以台盼蓝染色检测药物干预后的HL 6 0细胞活力 ;分析HL 6 0细胞的增殖能力 ;DNA梯状胶电泳及吖啶橙 /溴化乙锭染色形态学分析鉴定细胞凋亡 ;Western印迹检测凋亡信号蛋白caspase 9, 3和PARP的裂解激活以及JNK信号途径蛋白质MEK4 ,JNK ,P JNK ,P C Jun的表达及活化状态。结果 :2 0 0～ 4 0 0 μmol的吲哚美辛能够显著抑制HL 6 0细胞增殖和诱导HL 6 0白血病细胞凋亡 ,并呈浓度和时间依赖性 ;HL 6 0细胞凋亡伴有caspase 9,3和PARP的表达上调及裂解激活 ;MEK4蛋白表达呈浓度依赖性上调 ;磷酸化JNK和磷酸化C Jun呈浓度依赖性上调。结论 :吲哚美辛可抑制HL 6 0细胞增殖和诱导细胞凋亡 ;JNK信号途径活化介导了吲哚美辛诱导的凋亡。JNK途径的活化导致了下游caspase途径的活化。     

吲哚美辛诱导的HL-60白血病细胞凋亡与JNK信号转导途径活化

目的：观察吲哚美辛对HL-60白血病细胞增殖的抑制作用及细胞凋亡的诱导作用，了解c-Jun N-末端激酶(JNK)信号转导途径在介导吲哚美辛诱导的HL-60细胞凋亡中的活化状态，揭示吲哚美辛诱导HL-60细胞凋亡的分子机制。方法：以台盼蓝染色检测药物干预后的HL-60细胞活力；分析HL-60细胞的增殖能力；DNA梯状胶电泳及吖啶橙／溴化乙锭染色形态学分析鉴定细胞凋亡；Western印迹检测凋亡信号蛋白caspase-9，-3和PARP的裂解激活以及JNK信号途径蛋白质MEK4，JNK，P-JNK，P-C-Jun的表达及活化状态。结果：200～400txmol的吲哚美辛能够显著抑制HL-60细胞增殖和诱导HL-60白血病细胞凋亡，并呈浓度和时间依赖性；HL-60细胞凋亡伴有easpase-9，3和PARP的表达上调及裂解激活；MEK4蛋白表达呈浓度依赖性上调；磷酸化JNK和磷酸化C-Jun呈浓度依赖性上调。结论：吲哚美辛可抑制HL-60细胞增殖和诱导细胞凋亡；JNK信号途径活化介导了吲哚美辛诱导的凋亡。JNK途径的活化导致了下游caspase途径的活化。     

辛伐他汀对人网膜前脂肪细胞细胞周期及caspase-3表达的影响

目的：观察辛伐他汀对人网膜前脂肪细胞细胞周期和caspase-3表达的影响。方法：分离、培养、鉴定人网膜前脂肪细胞,用不同浓度的辛伐他汀干预人网膜前脂肪细胞,MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期,免疫细胞化学法测定caspase-3的表达。结果：实验分离出的人网膜前脂肪细胞经诱导16d后分化为多脂滴的成熟脂肪细胞,10-4mol/L辛伐他汀对人网膜前脂肪细胞的增殖有显著地抑制作用,细胞周期测定显示细胞被阻滞在G0/G1期,且干预后人网膜前脂肪细胞caspase-3表达阳性率显著增加。结论：辛伐他汀可以通过阻滞细胞周期抑制人网膜前脂肪细胞增殖,可能通过增加caspase-3的表达诱导细胞凋亡。