Construction of Adeno-associated Virus System for Human Bone Morphogenetic Protein 7 Gene

To construct the recombinant adeno-associated virus （rAAV） vector with human bone morphogenetic protein 7 （BMP7） and observe the BMP7 mRNA expression in vitro, BMP7 CDS sequence was cloned into expression plasmid pAAV-MCS of AAV Helper Free System. The recombinant plasmid was identified with enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid, pAAV-RC, pHelper were co-transfected into AAV-293 cells according to the calcium phosphate-based protocol. The viral stock was collected by 4 rounds of freeze/thaw. After purified and concentrated, the recombinant virus titer was determined by dot-blot assay. HEK293 cells were transfected with the recombinant virus at different MOI, and the expression of BMP7 mRNA was detected by RT-PCR. The results showed rAAV-BMP7 was constructed and packaged successfully. The physical particle titer was 2.5×10^11 vector genomes/mL. There was different expression level of BMP7 mRNA after transfecton. These data suggested that recombinant AAV mediated a stable expression of hBMP7 mRNA in 293 cells. The AAV production method may pave the way of an effective strategy for the jaw bone defection around dental implants.     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

携带靶向干扰VEGF基因shRNA重组腺相关病毒载体的构建和制备

目的：构建并制备携带靶向干扰VEGF165基因shRNA的重组腺相关病毒载体．方法：将PCR法扩增所得EGFP-U6-shRNA（VEGF165）片段插入载体质粒pSNAV2．0-lacz-α的EcoRI和SalI酶切位点,构建重组质粒pSNAV2．0-EGFP—U6-shRNA（VEGF165）．以HSV1-RapCap／△UL2为辅毒,包装rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒．对所获病毒载体进行PCR,SDS-PAGE鉴定分析、滴度测定和EGFP的活性检测．结果：PCR,SDS-PAGE鉴定分析结果表明靶向干扰VEGF165基因的shRNA片段成功包装入重组AAV2载体,病毒纯度在98％以上．点杂交法测定重组病毒载体基因组滴度约为3×10^14v．g．（vector genomes）／L．EGFP活性检测显示重组AAV2感染细胞阳性率在30％以上．结论：成功制备了rAAV2-EGFP-U6-shRNA（VEGF165）病毒载体,为通过RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因的表达来阐明VEGF在缺血性脑损伤后各种生物学事件中的作用奠定了实验基础．     

人血管内皮细胞生长因子腺相关病毒包装质粒pSNAV-hVEGF165的构建及在HEK293细胞的表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）腺相关病毒（adenoassociated virus,AAV）表达载体包装质粒pSNAV-VEGF165,并体外检测pSNAV-VEGF165表达和生物学活性。方法采用分子克隆技术,从pcDNA3（＋）-VEGF165质粒获得VEGF165cDNA,并克隆至AAV包装质粒pSNAV上,构建pSNAV-VEGF165的AAV重组质粒,经酶切及测序鉴定正确,用脂质体介导pSNAV-VEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞（vascular endothelial cell,VEC）,荧光免疫组化方法检测VEGF165蛋白,并用MTT法测定VEGF165对VEC增殖的影响。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-VEGF165构建成功,荧光免疫组化显示VEGF165蛋白的表达,对照组未见VEGF165蛋白的表达,MTT法显示VEGF165蛋白对VEC增殖有促进作用。结论构建的AAV包装质粒pSNAV-VEGF165在体外具有生物学活性,可作为AAV-VEGF165表达载体的包装质粒。     

人对氧磷酶1基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的：构建带有人对氧磷酶1（hPONI）基因的重组腺相关病毒（rAAV）载体,并检测其转染大鼠骨髓内皮祖细胞（EPCs）后hPON1的表达。方法：提取流产胎儿肝脏的总RNA,RT-PCR获得cDNA,设计引物通过PCR获得PON!基因片段,将其与pGEM—TEasy载体连接,将PON1基因片段切下,插入到质粒pAAV—IRES—GFP的多克隆位点,获得质粒pAAV—PON1-IRES—GFP,经酶切和测序鉴定。包装的病毒rAAV—PON1用斑点杂交检测滴度,并用其转染EPCs检测hPON1在mRNA水平的表达。结果：pAAV—PON1-IRES-GFP酶切和测序结果完全正确。斑点杂交检测病毒的滴度为1．7×10^10g／mL,RT—PCR结果显示病毒转染EPCs后存在hPON1的表达。结论：成功构建了pAAV—PON1-IRES—GFP质粒,包装出较高滴度的rAAV—PON1,并且转染EPCs后可以检测到hPON1表达。     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体的构建及其在肺动脉高压动物模型中的应用

目的 构建靶向敲减KLF4基因的重组腺相关病毒载体,并应用于肺血管疾病,为后期研究肺血管KLF4基因敲减在肺动脉高压大鼠中的作用及相关分子机制奠定基础。方法 根据大鼠KLF4基因序列,设计针对大鼠特异性的siRNA序列,以pHBAAV-U6-MCS-CMV-EGFP作为空白载体,通过酶切技术构建带有GFP荧光标记的KLF4干扰腺病毒载体pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP,行测序分析,并进行病毒扩增、纯化及滴度测定。本研究对长时间（3个月）接触香烟烟雾的大鼠进行气道注入AAV1-KLF4-shRNA的干预治疗,观察大鼠右心室收缩压、平均右心室压等血流动力学指标改变。结果 经测序检测显示,大鼠AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体构建成功。健康对照组、生理盐水模型组、对照病毒模型组、治疗干预组的右心室收缩压和平均右心室压比较,差异均有统计学意义（P <0.05）。结论 对长时间接触香烟烟雾的肺动脉高压模型大鼠应用AAV1-KLF4-shRNA腺相关病毒载体,能有效改善右心室收缩压和平均右心室压,该载体在相关疾病动物模型中应用有效,为后期顺利开展AAV1-KLF4-s...     

hTRX-PR39重组腺相关病毒载体的构建

目的 探讨hTRX-PR39融合基因在脑缺血疾病中的治疗作用。方法 将已经构建好的hTRX-PR39融合基因插入到具有相应酶切位点的pSSCMV病毒载体质粒中,得到重组腺相关病毒载体质粒,酶切电泳鉴定。将已构建的重组腺相关病毒载体质粒、腺病毒辅助质粒PFG140和包装质粒pAAV/Ad,三质粒磷酸钙共沉淀法转染293细胞系,通过同源重组获得hTRX-PR39重组腺相关病毒载体, 收集病毒, 斑点杂交（Dot blot）法测定病毒滴度。结果 成功构建重组腺相关病毒质粒pSSCMV/ hTRX-PR39。包装、回收病毒后,Dot blot法测定重组病毒滴度为3.46×(1012~1013)PFU/mL。结论 成功构建pSSCMV/ hTRX-PR39重组腺相关病毒载体,并包装较高浓度的重组病毒。     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

构建及在血管内皮细胞中的表达

目的:构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)及绿色荧光蛋白报告基因的融合蛋白真核表达质粒,并检测其在血管内皮细胞中的表达.方法:采用PCR扩增VEGF165基因全长,并将其定向克隆入pEGFP-N1的多克隆位点,构建pEGFP/VEGF165重组质粒,经酶切、PCR及序列分析鉴定,脂质体介导转染体外培养的血管内皮细胞,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹等方法检测EGFP/VEGF融合蛋白的表达.结果:PCR、酶切及测序证实目的基因VEGF165正确连接至pEGFP-N1的多克隆位点,pEGFP/VEGF165重组质粒转染血管内皮细胞后,荧光显微镜、RT-PCR及Western免疫印迹检测均显示EGFP/VEGF蛋白在血管内皮细胞中表达.结论:成功构建了携带人VEGF165及EGFP报告基因的融合蛋白真核表达质粒,pEGFP/VEGF165可在血管内皮细胞中表达,此为进一步研究VEGF基因治疗缺血性血管疾病奠定了实验基础.     

人CTGF和TIMP1基因重组腺相关病毒双表达质粒的构建及其活性检测

 目的 构建人结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）和基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1, TIMP1)基因腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）表达质粒,并观察其在HEK293细胞中的表达,检测目的蛋白的生物学活性。方法 采用PCR技术,分别设计引物扩增所需序列并进行PCR鉴定。再采用分子克隆的方法,以内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites, IRES)序列连接CTGF和TIMP1并克隆到AAV表达质粒pSNAV2.0构建重组质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1。把重组质粒转染HEK293细胞,用双重免疫荧光和Western blot的方法对重组质粒的表达进行研究,MTT法检测细胞培养上清液中CTGF蛋白的生物学活性,ELISA法检测细胞培养上清液中TIMP1蛋白的含量。结果 PCR、酶切、DNA测序等方法均证实成功构建了含有完全正确的CTGF和TIMP1基因序列的AAV表达质粒。双重免疫荧光和Western blot检测到目的蛋白的表达,转染后的细胞上清具有促使成纤维细胞增殖的生物学活性,ELISA法结果证实重组载体能够高表达TIMP1蛋白。结论 成功构建了双表达质粒pSNAV2-CTGF-IRES-TIMP1,转染 HEK293细胞后能够表达具有生物学活性的目的蛋白,为基因治疗椎间盘退变的研究工作奠定了基础。     

Construction and Identification of Recombinant Adenovirus Vector Containing the hVEGF165 Gene

Thedevelopmentofgene therapieshas renderedits clinical application feasible.Vascular endothelialgrowth factor( VEGF) hasbeen approved to be usedfor clinical trials.VEGF plays an important role inangiogenesis and prevention of restenosis[1-8] ,butthelow efficiency of plasmid vector restricts its clinicalapplication.In this study,the h VEGF165c DNA wassubcloned into p ACCMV .p Lp A and subsequentlythis recombinant was co- transfected into 2 93cellswith p JM1 7to obtain the replication- …     

携hVEGF165基因的重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的　构建携带人血管内皮生长因子 16 5 (hVEGF165)基因的重组腺病毒载体。方法　将hVEGF165cDNA亚克隆到腺病毒中间载体pACCMV·pLpA ,再与pJM17共转染人胚肾 2 93细胞 ,获得载hVEGF165基因的复制缺陷型重组腺病毒 ,感染体外培养的兔主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC) ,通过RT PCR和Westernblot检测VEGF表达情况 ,并观察表达产物VEGF对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)增殖的影响。结果　重组腺病毒感染VSMC 4 8h后有VEGFmRNA转录及蛋白质的表达 ,并呈剂量依赖性地促进HUVEC增殖。结论　构建的重组腺病毒载体在VSMC中能够有效表达目的基因 ,且能有效促进HUVEC增殖 ,为hVEGF165基因的实际应用奠定了基础。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

氧相关HRE启动子控制下表达hVEGF165基因重组2型腺相关病毒的获得及鉴定

目的包装及鉴定低氧反应元件（HRE）启动子控制下缺氧诱导目的基因hVEGF165基因表达的2型重组腺相关病毒。方法磷酸钙三质粒共转染方法将pAAV—HRE9-VEGF165、pAAV—Rep／cap、pHelper质粒转染HEK293T细胞，制备2型重组腺病毒相关病毒（rAAV2）。分离培养S—D大鼠心肌细胞，转染rAAV，细胞固定后做免疫细胞荧光染色，检测细胞内血管内皮细胞生长因子（VEGF165）蛋白的表达。结果pAAV—HRE9-VEGF165质粒经测序鉴定，结果与NCBIGenBank公布的人VEGF165 eDNA核苷酸序列（AB021221）完全一致，含HRE启动子及目的基因hVEGF165的2型重组非复制型腺相关病毒包装成功，可感染原代培养的大鼠心肌细胞，缺氧可诱导VEGF165蛋白表达。结论成功包装并鉴定了rAAV—HRE9-hVEGF165载体，可有效转染心肌细胞，VEGF165基因的适时表达，为缺血性心肌疾病的“分子搭桥”治疗提供了更可能的安全性。     

2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究

目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。     

Expression of human nerve growth factor β gene in central nervous system mediated by recombinant adeno-associated viruses type-2 vector

Background Neurone atrophy and loss are major causes of chronic neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease. Despite many pharmacotherapies for neurodegeneration, there are no accepted treatments. We investigated the feasibility of human nerve growth factor β (hNGFβ) gene expression mediated by recombinant adeno-associated viruses type-2 (rAAV-2) vector in the central nervous system (CNS) after blood brain barrier (BBB) disruption.Methods rAAV-2 containing hNGFβ gene was constructed. The ability of hNGFβ gene mediated by rAAV-2 vector (rAAV-2/hNGFβ) to transfect cells in vitro was confirmed by both ELISA and bioassay of hNGFβ in the culture supernatant of BHK-21 cells infected by rAAV-2/hNGFβ. rAAV-2/hNGFβ and rAAV-2/green fluorescence protein (GFP) were administrated separately to rat brains through internal carotid intubation after BBB disruption with hypertonic mannitol. Brain hNGFβ concentration was measured by ELISA and GFP in brain sections was examined by laser scan confocal microscope.Results After 48 hours, hNGFβ content in supernatant was up to (188.0±28.6) pg/ml when BHK-21 cells were infected by rAAV-2/hNGFβ at multiplicity of infection (MOI)1.0×10(6) vector genome. Neurone fibre outgrowths were obvious in dorsal root ganglion neurone assays by adding serum free culture medium harvested from BHK-21 cells exposed to rAAV-2/hNGFβ. Whole brain hNGFβ content in rAAV-2/hNGFβ transferred group was up to (636.2±140.6) pg/ml. hNGFβ content of BBB disruption in rAAV-2/hNGFβ infused group increased significantly compared to the control group (P&lt;0.05). GFP expression was clearly observed in brain sections of rAAV-2/GFP transferred group.Conclusion rAAV-2/hNGFβ successfully expresses in the CNS after BBB disruption induced by hypertonic mannitol.     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

含乙型肝炎表面抗原基因重组腺相关病毒的构建及其基因的表达和功能初步研究

目的构建含乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因的重组腺相关病毒(rAAV)并观察目的基因的表达和功能。方法采用PCR法从PTHBV-1质粒中扩增HBsAg基因(ayw 亚型);将PCR扩增产物插入腺相关病毒(AAV)表达质粒pSNAV中,构建重组质粒pSNAV-HBsAg;用脂质体转染的方法将重组质粒转入BHK-21细胞中,G418筛选得到转入重组质粒并能表达目的基因的细胞系BHK-HBsAg;用具有rAAV包装功能的HSV-1- HSV1-rc/△UL2感染BHK-HBsAg,纯化后得到rAAV-HBsAg;ELISA检测重组病毒表面抗原基因在BHK-21细胞和293细胞中的表达;用rAAV-HBsAg免疫BalB/C小鼠,RIA法检测血清中表面抗体的滴度。结果ELISA法检测到混合细胞系BHK-HBsAg中HBsAg的表达量为(28.6±6.7)ng/5×106细胞;rAAV-HBsAg感染BHK-21细胞和293细胞后均能检测到HBsAg的表达,表达量随感染复数的增加而升高;rAAV-HBsAg免疫的BalB/C小鼠能产生表面抗体(抗-HBs抗体)。结论rAAV-HBsAg在体外能表达,免疫动物能诱导体液免疫反应的产生。rAAV-HBsAg有希望成为乙型肝炎候选疫苗,也可以进一步用于探索慢性乙型肝炎的免疫治疗。