Tet-Off对GDNF重组腺相关病毒载体表达的调控作用

胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)对多巴胺能神经元、运动神经元等都具有神经营养作用,是帕金森病等中枢神经系统退行性病变常见的治疗基因。以腺相关病毒(AAV)为载体将 GDNF 导入尾状核头部等功能核团能缓解帕金森病症状、促进多巴胺能神经元再生。本研究在 AAV 介导 GDNF 体内高效表达的基础上,在 GDNF 上游插入 Tet-Off 反式激活子及其反应元件启动子复合物, 从而降低转基因后可能的致瘤作用及其它潜在危险。     

三叉神经中脑核内假单极神经元的电生理和形态特性

为了探讨三叉神经中脑核(Vme)神经元的电生理和形态学特征,本研究应用红外可视脑片膜片钳技术、biocytin细胞内标记技术以及免疫组织化学染色方法观察大鼠Vme内假单极神经元的电生理和形态学特征。结果显示:(1)长时程去极化方波刺激能够引起Vme神经元重复放电,且根据放电模式的不同,可将其分为快适应型神经元和慢适应型神经元两种类型,其中快适应型神经元占绝大多数;(2)经biocytin细胞内标记并染色后,光学显微镜下观察两种类型的Vme神经元在形态上均为假单极神经元,无显著差别。以上结果提示:形态学类型相同的Vme神经元的电生理学特点具有多样性,这可能与Vme神经元担负复杂的口面部本体觉信息的传递功能有关。     

小鼠大脑皮质神经元电穿孔转染条件的优化

目的:以原代培养的小鼠大脑皮质神经元为研究工具,优化电穿孔转染条件。方法:通过设置不同的电压和脉冲时间组合等电转染条件,将表达绿色荧光蛋白(GFP)的shNC质粒导入小鼠大脑皮质神经元,24 h后观察并比较神经元的转染效率,确定最佳电转染条件。结果:200 v电压,25 ms脉冲时间或250 v电压,15 ms脉冲时间的转染条件下,小鼠大脑皮质神经元可获得较好的转染效率,分别为(31.15±1.89)%和(29.10±1.93)%。结论:电穿孔转染是一种高效的基因转染方法,通过条件的优化,可以提高小鼠大脑皮质神经元的电转染效率。     

Znf804a基因在发育期鼠脑神经元的迁移、增殖及分化中的功能

目的:以小鼠为模型研究精神分裂症易感基因Znf804a在神经发育中的功能。方法:利用胚胎电转技术,将Znf804a的shRNA(shZnf804a)质粒及其对照质粒(pSUPER)电转进入E14.5的癌症研究所(ICR)小鼠脑室区,每种质粒电转3只,分别为敲低(knock down)Znf804a组和对照组,比较两组神经元在皮层板(CP)区的比例来评价神经元的迁移速度;比较两组神经元前体细胞形成神经球的直径来评估神经元增殖速度;比较体外培养神经元前体细胞中Nestin染色阳性神经元的比例检测神经元分化速度。结果:敲低Znf804a小鼠的神经元迁移到CP区的比例比对照组低(11.8%vs.75.4%,P0.001);神经元前体细胞形成神经球的直径比对照组大(295μm vs.172μm,P0.01);神经元前体细胞中,Nestin染色阳性的神经元比例比对照组高(31.5%vs.9.6%,P0.01)。结论:敲低Znf804a小鼠神经元迁移速度和分化速度比对照组神经元慢,增殖速度比对照组神经元快,提示Znf804a在小鼠脑发育过程中发挥重要功能。     

MAPKs在睡眠剥夺大鼠海马神经元内表达变化的研究

目的:探讨睡眠剥夺大鼠丝裂素活化蛋白激酶(MAPKs)表达的变化及可能的意义。方法:采用TUNEL和HE法观察了睡眠剥夺大鼠海马神经元的形态学变化,采用Westernblot法、β-液闪计数法观察海马神经元ERK和JNK表达的变化。结果:快眼动睡眠剥夺组海马神经元阳性凋亡细胞数增多,ERK活性1764.00±941.56,显著低于对照组(P＜0.05),快眼动睡眠剥夺组JNK蛋白表达量为87.5%,显著高于对照组(P<0.05)。结论:睡眠剥夺可引起大鼠海马神经元MAPKs活性的变化,而这些变化可能涉及神经元的凋亡机制。     

微电泳导入辣根过氧化物酶示踪缝际大核的脑内联系

本实验应用健康大白鼠20只,借助立体定位仪及微电泳导入20％HRP到大白鼠缝际大核内。在导入HRP后立即拔出电极者或动物存活超过60小时者,其脑内找不到外源性HRP颗粒,而在导入HRP后,再停留电极10分以上,动物存活40小时者则可以见到外源性HRP颗粒分布于不同脑水平的神经元内:其中以延髓网状结构的多突神经元最多,最明显;在桥脑室底灰质、网状结构、蓝斑的腹外侧部等处,偶而可以见到小的梭形神经元内有阳性反应颗粒,中脑导水管周围灰质,缝际正中上核,黑质致密部,视上核的周缘部也能见到一些细胞内含有弱阳性反应颗粒。此外,在丘脑及皮质下结构内皆未找到有阳性颗粒反应的细胞。在网状结构及室底灰质的某些血管周缘可见到有两种HRP阳性反应细胞:其一似为小的原浆性星形胶质细胞,核小,胞质宽,具有短而粗的不规则胞突;另一为多突神经元,在其核周充满了棕色阳性反应颗粒,其胞突内HRP颗粒呈串珠状排列。     

电针激活中缝大核神经元机制的探讨

延脑中缝大核(NRM)是中枢下行抑制系统重要核团之一,它在针刺镇痛中占有重要地位。我们以往工作证明电针“足三里”穴区对NRM神经元的激活效应可被局部导入纳洛酮所阻断,提示内源性吗啡样物质     

坍塌反应调节蛋白5促进海马神经元突起生长

目的 探讨坍塌反应调节蛋白5(CRMP5)对神经元突起生长的作用。方法 构建CRMP5真核表达载体,采用基因转染、实时定量PCR和免疫印迹技术评估CRMP5基因表达;以空载体为对照组,设3个复孔,用时差成像技术和突起提取技术观察和检测原代培养海马神经元突起的生长。结果 成功构建携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签蛋白的CRMP5的真核表达载体。脂质体转染技术可成功把CRMP5基因导入细胞,转染的细胞CRMP5表达高于空载体对照组;CRMP5蛋白表达于神经元的胞体和突起,尤其是胞体、突起起始处和突起末端高表达。过表达CRMP5可明显促进突起生长,主要表现为突起的生长,并形成丰富的侧枝;定量结果显示,CRMP5过表达的细胞突起的长度逐渐延长,而且较空载体转染细胞增多,差异显著(P<0.01)。导入CRMP5的细胞突起提取液的吸光度较对照细胞明显升高(P.<0.01)。 结论 CRMP5能促进神经元突起及其分支的生长。     

辣根过氧化物酶与溃变结合法新探

HRP方法和溃变方法是研究神经通路的有效方法.80年代以来,一些学者将二方法结合应用,在中枢的不同部位损毁和导入HRP,然后在同一区内观察神经元之间的突触联系.而在同一区域神经组织内分别导入HRP与电解损毁后,在另一中枢区域内观察神经元之间的突触联系的研究在国内、外尚属首次.本文作者经几年摸索,采用HRP逆行追踪与同区内延时电解损毁相结合的电镜方法,追踪皮质丘脑神经元之间的突融联系,取得了较为理想的效果.1 材料和方法1.1 健康猫 16只,体重1.5～3.0Kg,雌雄不拘,以1%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔注射麻醉,将猫固定在脑立体定位仪上,常规消毒开颅,暴露一侧脑皮质体感I区,直视下将CB-HRP(Sigma VI RZ3.0)2.0μl分10点注射于一侧体感I区皮质内.每点进针深度1.0～1.5mm,注射20分钟,留针20分钟,5小时后,用电极多     

Neurogenin2基因调控许旺细胞转分化为神经元

背景：Neurogenin2(Ngn2)基因调控星形胶质细胞分化为神经元已被实验证实,这提示许旺细胞也可能通过基因调控分化为神经元。 目的：研究Neurogenin2基因调控大鼠许旺细胞向神经元分化的可行性。 方法：体外培养、纯化及鉴定大鼠许旺细胞,然后用含绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体系统将Neurogenin2基因转染导入许旺细胞中,最后用含碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子和脑源性细胞生长因子的无血清DMEM诱导培养许旺细胞2周。显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学检测髓磷脂碱性蛋白及神经元特异性烯醇化酶。 结果与结论：许旺细胞转染导入Neurogenin2基因并诱导分化后,免疫荧光检测发现12.56%的细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,而对照组均未发现表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶。Neurogenin2基因植入可使大鼠许旺细胞表达神经元标志性蛋白神经元特异性烯醇化酶,提示该基因可调控许旺细胞转分化为神经元。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

微电泳导入酚妥拉明对电针抑制脊髓背角伤害性反应的影响

有报导说明肾上腺素能(NE)下行抑制途径在脊髓水平通过α受体参与针刺镇痛作用。本文在脊髓背角伤害感受神经元胞体附近微电泳导入α受体阻断剂—酚妥拉明,观察其对电针抑制伤害性反应的影响,进一步探讨NE下行途径的作用机制。     

睡眠剥夺促进大鼠海马神经元凋亡及相关基因表达

探讨睡眠剥夺引起的神经元凋亡与相关基因表达的变化。采用TUNEL染色观察了快眼动睡眠剥夺大鼠海马神经元形态学变化,应用原位杂交、Western blot法检测了快眼动睡眠剥夺大鼠海马bcl-2,bax mRNA,MAPKs表达的变化。结果表明：快眼动睡眠剥夺大鼠海马CAl,CA3区神经元阳性凋亡细胞数明显增多,bcl-2,bax mRNA表达明显增强,ERK活性降低,JNK蛋白表达量较对照组明显增高。提示睡眠剥夺可引起大鼠海马神经元凋亡。与凋亡相关的bcl-2,bax mRNA基因表达及MAPKs活性的变化可能涉及神经元的凋亡机制。     

γ-氨基丁酸与一氧化氮在大鼠大脑皮质内的共存

目的观察大鼠大脑皮质内是否存在γ-氨基丁酸(GABA)与一氧化氮(NO)共存的神经元。方法以大鼠为研究对象,采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPH-d)组织化学和免疫组化双重染色相结合的方法。结果显示GABA阳性神经元的胞体和突起染成棕黄色多散在分布于皮质以小型为主,中型较少,NADPH-d阳性神经元的胞体和突起染成蓝色多散在分布于皮质以中、小型神经元为主。双标神经元(GABA/NADPH-d均阳性)的胞体和突起染成棕褐色,多散在分布于嗅周皮质(PRh),以中、小型神经元为主。双标神经元与单标神经元的比例分别7.5%(GABA),12.7%(NADPH-d)。结论大鼠皮质内有GABA与NO共存的神经元,在嗅周皮质数量最多。     

GABA与NOS在大鼠杏仁皮质核神经元内的共存

本文采用还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADPHd)组织化学和γ氨基丁酸(GABA)免疫组化双重染色相结合的方法,观察杏仁皮质核(Co)神经元内GABA与NADPHd的共存。结果显示GABA样阳性神经元多散在分布于杏仁皮质后内侧核(PMCo)和杏仁皮质后外侧核(PLCo),以小型为主,中型较少;NADPHd阳性神经元多散在分布于PMCo、PLCo、杏仁皮质前核(ACo),以中、小型神经元为主;双标神经元(GABA/NADPHd均阳性)多散在分布于PLCo,以中、小型神经元为主。大鼠Co内有GABA与NADPHd共存的神经元,提示一氧化氮(NO)对Co内的GABA能神经元可能有调控作用。     

RNA干扰CRMP 5抑制大鼠海马神经元突起生长

目的探讨CRMP5对大鼠海马神经元突起生长的影响。方法将带FAM标记的CRMP5的特异性干扰片段及阴性对照转染培养成熟的海马神经元,用免疫荧光的方法验证干扰片段对神经元内源性CRMP5的干扰效果,并利用共聚焦显微镜观察神经元突起以及侧枝的形成。结果携带FAM的si RNA可以成功的进入细胞,分布于神经元的胞体以及树突;免疫荧光证实CRMP5 si RNA可以有效的沉默CRMP5蛋白的表达;沉默CRMP5基因表达后的海马神经元突起短小,而且缺少分支,而对照细胞突起长,分支多;定量分析显示,导入CRMP5 si RNA的细胞突起的长度较对照细胞缩短,差异显著(P0.05);突起的数目比较,一级突起数目无显著差异,而二级及其以上突起的数目明显减少,差异显著(P0.05)。结论沉默CRMP5可抑制海马神经元突起的生长和侧枝形成。     

38 纹状体提取液增强体外培养的中脑黑质神经元的发育

<正>神经元的靶组织能释放可溶性化学因子(靶源性神经营养因子)增强神经元的存活和发育.纹状体是中脑黑质神经元主要的靶组织.我们制备新生2天龄SD大鼠纹状体提取液及其不同分子量的组分,用快速自动比色微量分析法检测它们对体外培养的14天龄SD大鼠胚胎中脑黑质神经元的影响.结果表明,纹状体提     

电针“足三里穴”、导入P物质对大鼠背角神经元伤害性反应的抑制效应

较多工作支持电针兴奋了细传入纤维激活脑内抗痛机能而获较好的镇痛效应,一般认为P物质在脊髓是伤害性信息传入的神经递质,故本文在脊髓水平观察了电针足三里穴及导入P物质对伤害性反应的影响。 实验在清醒而麻痹的大鼠进行,以多管微电极中心管记录了腰髓背角神经元的电活动,经脉冲计数直方图处理并描图。给腓肠神经以短串电刺激(由间隔3毫秒的3个波     

帕金森病基因治疗的临床前和临床研究

帕金森病灵长类动物模型的两种临床前基因治疗策略主要是,向脑黑质纹状体系统导入多巴胺合成酶基因或神经营养因子基因,以增加纹状体多巴胺水平或增强黑质残存神经元的存活能力。临床实验研究是将腺相关病毒介导的谷氨酸脱羧酶基因导入丘脑底核,使兴奋性神经递质谷氨酸变为抑制性神经递质GABA,从而抑制丘脑底核的靶核团苍白球内侧核和黑质网状部活性过高状态,使丘脑皮层通路的过度抑制被解除而达到治疗帕金森病的目的。     

胚胎小鼠肠道神经元的分离和原代培养

目的:建立一种简便的胚胎小鼠肠道神经元分离和培养方法。方法:分离12～13 d胎鼠肠道组织,制备单细胞悬液,用神经元专用培养基进行培养,观察神经元的生长情况。培养第3、5、7、9、14 d使用免疫细胞化学染色法,以β微管蛋白(Tu J1)反映神经元突起形态并用Sholl分析进行量化,以神经元核心抗原(Neu N)为标志物反映神经元的纯度。结果:培养24 h神经元贴壁,随培养天数延长神经元突起长度增加,数目增多,形态逐渐复杂,与邻近细胞突起相互连接,形成网络。与培养第3 d相比,第7、9、14 d神经元纯度明显增高(P 0.05)。结论:本方法分离培养的神经元纯度高,在神经元专用培养基中存活状态良好,未见胶质细胞明显增生。     

不同损伤模型内源性BDNF在背根节和损伤脊髓中的表达及其作用

目的:探讨不同损伤模犁中脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophin,BDNF)在背根节(dorsal rootganglion,DRG)和损伤脊髓的表达及作用.方法:建立单纯坐骨神经损伤模型、单纯脊髓背索损伤模型以及合并损伤(坐骨神经损伤1周后冉损伤脊髓背索)模型,用免疫荧光组织化学方法和酶联免疫吸附实验(ELISA)方法观察不同模型中BDNF在DRG和损伤脊髓的表达,从脊髓损伤处嘴侧5mm处注入快蓝(Fast Blue,FB)以逆行标记DRG中感觉神经元,并结合FB逆行示踪观察FB阳性神经元BDNF的表达情况.结果:坐骨神经损伤1周后损伤侧的腰4、5背根节中BDNF蛋白表达上调.与单纯脊髓损伤组相比,合并损伤组在脊髓损伤的尾侧端可见较多的BDNF阳性纤维,这些纤维呈膨体样结构,主要分布于坐骨神经损伤侧脊髓尾侧端的白质里,合并损伤组FB标记的感觉神经元数目也较单纯脊髓损伤组多,且大部分FB标记的感觉神经元是BDNF阳性的神经元.结论:坐骨神经损伤后内源性的BDNF在DRG和损伤脊髓中表达上调,可能参与坐骨神经损伤引起的脊髓损伤后再生过程.