肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体的构建及蛋白表达

背景与目的肺癌细胞对化疗药物的耐受是肺癌患者生存率低的重要原因之一。我们在前期研究中发现了一条肺腺癌耐药相关的基因BC006151,本研究拟构建肺腺癌耐药相关基因的原核表达载体PGEX-4T-1-BC006151,诱导其表达及鉴定目的蛋白,从而揭示该基因与肺腺癌耐药的关系。方法以RNA为模板RT-PCR扩增,产物与质粒PGEX-4T-1用BamHI和EcoRI双酶切,用T4DNA连接酶将二者连接,连接物转化DH5α菌,重组克隆菌经测序鉴定确认。将带有目的片段的重组克隆载体转化BL21表达菌,SDS-PAGE电泳检测表达产物,Western blot检测GST融合蛋白表达。结果经酶切鉴定及DNA测序,重组质粒中已插入了目的基因片段,与GenBank中公布的BC006151基因序列一致。重组克隆载体经BL21表达菌表达,获得40KD的条带(其中目的蛋白13KD,GST标签26KD)。结论成功构建了肺腺癌耐药相关基因BC006151原核表达载体,并成功诱导了目的蛋白表达,GST亲和纯化,为进一步制备该基因的多克隆、单克隆抗体奠定了基础。     

肺癌耐药相关基因在肺癌组织和肺癌细胞株中的表达

背景与目的：我们已经通过抑制消减杂交技术发现了一条新的长494bp的肺癌耐药相关基因片段,并克隆了它的全长cDNA序列。本研究旨在研究该肺癌耐药相关基因（lung cancer drug resistance-related gene,LCDRG）在肺癌组织、癌旁组织及5种肺癌细胞株中的表达。方法：应用半定量RT－PCR检测38例肺癌组织、12例癌旁组织和5种肺癌细胞株中该基因的表达。结果：肺癌组织中LCDRG mRNA的表达明显高于癌旁组织（P＜0．001）,但在肺腺癌和鳞癌之间差异无统计学意义。该基因在肺腺癌细胞株SPC－A－1和A549、大细胞肺癌细胞株H460、小细胞肺癌细胞株H446和SH77中的表达依次递减。结论：LCDRG是一条肺癌相关基因,该基因可能与肺癌的发生、发展密切相关。     

肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因的克隆与鉴定

目的：克隆和筛选肺腺癌多药耐药细胞特异表达基因,方法：将肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）作为实验方,肺腺癌细胞（SPC－A－1）作为对照方,应用抑制消减杂交技术,构建实验方特异表达cDNA消减文库;用斑点杂交法初步筛选cDNA消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析（Genbank),对新的cDNA序列进行Northern blot杂交验证。结果：建立了一个肺腺癌多药耐药细胞（SPC－A－1／CDDP）特异表达cDNA消减文库,斑点杂交法初步筛选显示23个个克隆中有SPC－A－1／CDDP特异表达cDNA片断,测序和同源性分析表明2个cDNA片断为新序列,其余cDNA片段与已知基因有93％－100％的同源性,Northern blot杂交结果表明2个新的cDNA片断来自SPC－A－1／CDDP细胞。结论：2个新的cDNA序列可能为未知肺腺癌多药耐药相关基因序列;抑制消减杂交法是克隆特异表达基因的有效方法。     

高转移性人肺腺癌细胞株SPC-A-1BM的建立及其特性分析

目的:建立高转移性人肺腺癌细胞株SPC-A-1BM及其免疫缺陷小鼠转移动物模型。方法:将人肺腺癌细胞株SPC-A-1经免疫缺陷小鼠血道或肺原位接种后形成转移,在放射性核素示踪下找到骨转移病灶,然后切除病变骨组织进行体外培养获得转移性肺癌细胞,用这些癌细胞重复以上循环10次,获得高转移肺癌细胞。采用荧光定量PCR方法检测亲代细胞和高转移细胞的基因表达。结果:获得以骨转移为主,肺、肾上腺、淋巴结等多脏器转移的人肺腺癌转移细胞株(SPC-A-1BM)及其免疫缺陷小鼠动物模型。定量PCR检测显示SPC-A-1BM的上皮生长因子受体(EGFR/HER)家族、血管内皮生长因子(VEGF)家族和3个抗凋亡蛋白的基因较原代细胞均有不同程度的变化。结论:SPC-A-1BM是以骨转移为主的高转移性人肺腺癌细胞株,该细胞株及其转移动物模型为肺癌转移的生物学研究提供了一个良好的技术平台。     

nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株抑制消减cDNA文库的构建

背景与目的 已有的研究表明,nm23-H1基因是一个重要的肺癌转移抑制基因,为了筛选与该基因表达相关的差异表达基因.本研究拟构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库,为进一步筛选、克隆与nm23-H1转移相关的基因奠定基础.方法利用抑制消减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)技术构建nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)间差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库,经蓝白菌落筛选克隆,并PCR反应鉴定.结果 成功构建了该两株细胞株差异表达基因的正向和反向消减cDNA文库.经蓝白菌落筛选,正向消减文库总共获得约300个白斑克隆,反向消减文库总共获得约400个白斑克隆,从正反向消减文库中各挑选96个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示在挑选的正向文库中有84个克隆有插入片段,反向文库中有83个克隆有插入片段.其片段大小范围为(300-750)bp.结论 抑制消减杂交是克隆差异表达基因的有效方法,我们应用SSH法和T/A克隆技术成功建立了nm23-H1基因转染前后人大细胞肺癌细胞株(L9981和L9981-nm23-H1)差异表达基因的抑制消减cDNA文库.nm23-H1基因在肺癌细胞中的表达可能影响某些转移相关基因的差异表达.     

转染人肿瘤坏死因子-α、白介素-2基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响

目的 研究转染人体肿瘤坏死因子-α(huTNF-α)、白介素-2(hIL-2)基因对肺癌细胞耐药基因MDR1、LRP表达的影响，探讨基因治疗逆转肺癌多药耐药的可行性。方法 通过阳离子脂质体将克隆的huTNF-α和hIL-2基因导入肺癌细胞系A549、GLC-82、H446、H460，经筛选阳性单克隆，用半定量RT-PCR方法检测转染目的基因前后肺癌细胞系MDR1、LRP基因在mRNA水平的表达情况。结果 MDR1在A549、GLC-82、H446、H460，LRP在A549、GLC-82、H460中均呈阳性表达；转染huTNF-α目的基因后各肺癌细胞系MDR1、LRP基因的表达无影响，而转染hIL-2目的基因能够明显抑制A549、H446、H460细胞系MDR1的表达。结论 MDR1、LRP基因在肺癌细胞系中的阳性表达与肺癌的固有耐药性有关；huTNF-α、hIL-2目的基因能够在被转染细胞中获得表达，而且转染hIL-2目的基因能够明显抑制MDR1在A549、H446、H460的表达。该结果不仅为探讨肺癌多药耐药性的病理机制提供了一个新的线索，而且为基因治疗逆转肺癌的多药耐药性提供了一个新的实验依据。     

高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异表达基因的筛选

目的 筛选高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株差异性表达基因。方法 应用抑制性消减杂交(SSH)技术,构建高淋巴系统转移能力小鼠肝癌细胞株Hca-F及其同源低转移细胞系Hca-P的cDNA消减杂交文库,筛选阳性克隆进行测序,并在GenBank数据库中进行同源性比较。结果 成功克隆10个差异基因片段,其中2个为新基因。结论 SSH技术是克隆差异表达基因及发现新基因的有效方法。     

白英诱导人肺癌细胞凋亡及对Bcl-2的影响

目的研究白英水提取物对人肺腺癌SPC-A-1细胞株的凋亡诱导作用及对其Bcl-2表达的影响;探讨白英提取物诱导SPC-A-1细胞凋亡的可能机制.方法选用人肺腺癌SPC-A-1细胞株为研究对象,在体外与白英提取物4种不同浓度共同培养24、48、72、96 h,采用MTT法检测白英提取物对SPC-A-1细胞增殖活性的影响;琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪检测白英水提取物处理的SPC-A-1细胞株细胞凋亡;比较白英提取物处理前后SPC-A-1细胞凋亡相关基因Bcl-2表达的变化.结果白英提取物抑制SPC-A-1细胞增殖活性;琼脂糖凝胶电泳可见凋亡梯带;SPC-A-1细胞有很低的自然凋亡率(1.37±0.52)%,50.0 mg/ml白英提取物作用SPC-A-1细胞48h后,凋亡率为(33.25±4.39)%(P＜0.05);50.0 mg/ml白英提取物处理48h后的细胞凋亡相关基因Bcl-2表达率(24.41±2.96)%比未经处理的细胞(53.53±4.80)%表达率低(P＜0.001).结论白英水提取物对人肺腺癌SPC-A-1细胞株有抑制增殖、诱导其凋亡作用,细胞凋亡的机制可能与细胞凋亡相关基因Bcl-2表达下调有关.     

凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义

目的:探讨凋亡抑制基因survivin在多种肺癌细胞株中的表达及其意义.方法:分别采用Real-time PCR与Western blot的方法,检测人肺腺癌细胞株A549、肺鳞癌细胞株SK-MES-1、大细胞肺癌细胞株NCI-H460、小细胞肺癌细胞株NCI-H446中survivin mRNA与蛋白的表达水平.结果:Real-time PCR检测发现四种肺癌细胞株中survivin mRNA均呈强阳性表达,且Western blot检测结果亦与 RT-PCR基本一致.结论:Survivin基因与肺癌发生、发展紧密相关,值得进一步深入研究.     

Egf/r3单克隆抗体治疗肺腺癌的实验研究

目的非小细胞肺癌(NSCLC)存在表皮生长因子受体(EGFR)过度表达。Egf/r3为EGFRMcAb,属IgC2a亚型,具有一定的治疗肺癌作用,但其机理尚不完全清楚。为更进一步全面了解Egf/r3对肺癌的治疗作用,本文以高表达EGFR的SPC-A-1和A549肺腺癌细胞系做为靶细胞,观察Egf/r3对肺腺癌细胞周期的影响、Egf/r3与CDDP和8-Mop是否存在协同抗肺癌作用。方法细胞周期检测采用流式细胞仪PI染色法分析,协同作用采用MTT法。结果SPC-A-1和A549G1期细胞分别增加5·0%和7·8%,S期分别减少5·6%和8·6%,G2-M期变化不明显。Egf/r3分别与CDDP和8-Mop联用,对SPC-A-1和A549杀伤率分别达到35%、39%和36%、39·5%。结论Egf/r3阻抑G1期癌细胞进入S期,使细胞同步化,增加了靶细胞对化疗药物的敏感性,减少癌细胞化疗后损伤修复,与CDDP、8-Mop存在协同抗肺腺癌作用。     

BSO增强MRP过表达肺癌细胞对顺铂敏感性的作用机制研究

目的：评价使用丁胱亚磺酰亚胺(BSO)克服肿瘤细胞由于高表达MRP而引起对顺铂耐药的可行性，并初步探讨其增敏的作用机制。方法：用基因转染的方法成功建立了一株mrp基因高表达的肺癌细胞株(SPC-A-1／MRP)的基础上，检测BSO作用前后转染细胞对顺铂敏感性的差异，从酶活性测定和转录水平观察了上述过程中谷胱甘肽解毒系统的变化。结果：实验表明同对照(转染不含目的基因的空载质粒)的SPC-A-1／MRP(一)细胞相比，SPC-A-1／MRP细胞对顺铂出现了明显的耐受，BSO可以有效增强MRP高表达的细胞对顺铂的敏感性。BSO通过显著抑制由顺铂引起的肿瘤细胞内GSH解毒系统的活化和MRP蛋白含量升高，有效的克服了肿瘤细胞接触顺铂后过表达MRP而引起的化疗耐受。结论：高表达MRP可以引起肿瘤细胞对顺铂的耐受，BSO针对MRP介导的顺铂耐药有很好的增敏效果。     

肺癌组织细胞耐药基因 MDR1、LRP表达及临床意义

目的:研究肺癌多药耐药基因MDR1、LRP在肺癌组织细胞及肺癌细胞系中的表达与肺癌病理类型、组织分化程度的相关性.方法:用RT-PCR方法观察肺癌组织以及肺癌细胞系中MDR1、LRP基因的表达情况.结果:在46例肺癌组织中,MDR1、LRP基因的表达率为39.1%和67.4%,其共同表达率(MDR1 LRP)为26.1%;MDR1、LRP基因的表达率在肺癌的不同病理类型及组织分化程度的表达差异无统计学意义(P＞0.05).MDR1在肺癌细胞系A549、GLC-82、NCI-H446、NCI-H460均呈阳性表达,LRP则在A549、GLC-82、NCI-H460呈阳性表达.结论:MDR1、LRP基因在肺癌组织的阳性表达与肺癌的固有性耐药有关,表现出肺癌患者之间的个体差异,而与肺癌的病理类型及组织分化程度无明显相关(P＞0.05);该结果为探讨肺癌多药耐药性的病理机制提供了一个新的线索,而且有可能为基因治疗逆转肺癌的多药耐药性开辟了一条新的途径.     

肺癌高转移和低转移细胞株中差异基因的分析

目的:以人肺癌低转移细胞株SPC-A-1为对照,分析人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci的分子转移机制及其相关的信号通路,寻找肺癌转移的关键基因.方法:应用芯片技术检测人肺癌低转移细胞株SPC-A-1和高转移细胞株SPC-A-1sci的差异基因.采用显著性通路分析和构建信号转导网络等生物信息学分析方法寻找肿瘤转移相关的潜在关键基因和信号通路.结果:与SPC-A-1细胞比较,SPC-A-1sci细胞共有上调表达的差异基因2 892个,下调表达的差异基因3 248个;上调差异基因参与的显著性信号转导通路共有48条,下调差异基因参与的显著性信号转导通路共65条.网络中的关键基因主要是丝裂原活化蛋白激酶1、表皮生长因子受体、AKT1、AKT3、PIK3CD( phosphoinositide-3-kinase,catalytic,delta polypeptide)、PIK 3R1 [phosphoinositide-3-kinase 3,regulatory subunit 1 (alpha)]、PIK 3R3、KRAS和胰岛素样生长因子1受体等.结论:人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci的基因芯片检测和生物信息学分析为肺癌转移的基础研究和临床防治提供了依据.     

Gene expression profiles in human non-small and small-cell lung cancers

Suppression subtractive hybridisation (SSH) was performed comparing normal bronchial epithelial cells with a lung squamous cell carcinoma (SCC) and a metastatic small-cell lung carcinoma (SCLC). The sequence analysis of four cDNA libraries revealed 869 individual sequences. Of these, 342 were tested using northern blots of lung cancer cell lines representing the three major subtypes (SCC, adenocarcinoma, SCLC) which confirmed the differential expression of 236 cDNAs. The extended analysis of 31 randomly chosen fragments confirmed the validity of the approach to identify genes associated with lung cancer development. Additionally, five novel full-length cDNA were isolated encoding the microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3, the epithelial V-like antigen 1 (EVA1), the GTP-binding protein SAR1, a new member of the S100-type calcium binding protein family and a new homeobox-containing gene.     

西妥昔单抗对非小细胞肺癌细胞的体外抑制作用

背景与目的 目前抗EGFR单抗--西妥昔单抗在肺癌的临床运用越来越广泛.本研究旨在探讨西 妥昔单抗对人肺癌细胞株(A549、H460、H1299、SPC-A-1)的体外作用.方法 我们选用浓度递增的西妥昔单抗 (1 nmol/mL-625 nmol/mL)作用于A549、SPC-A-1、H460、H1229四株细胞株,采用CCK8测定各组细胞增殖抑制情 况,选择A549、SPC-A-1细胞株用PI标记应后用流式细胞技术观察细胞凋亡情况,并采用免疫蛋白印迹法检测药物 处理后A549细胞EGFR信号转导通路关键酶的表达.结果 西妥昔单抗对A549、H460、H1299、SPC-A-1细胞的作用 均呈时间和浓度依赖性,作用后细胞的凋亡现象明显,同时细胞增殖均不同程度受到抑制;通过Western blot检测发 现p-AKT、p-EGFR、p-MAPK蛋白表达量较对照组明显下降.结论 西妥昔单抗在体外对肺癌细胞的增殖具有一定的 抑制作用,其作用可能与进一步下调了活化的EGFR信号转导通路关键酶的表达有关.     

人端粒酶催化亚单位(hTERT)启动子的克隆及其在人肺癌细胞中转录活性的研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位(hTERT)的启动子，并检测它在多种人肺癌细胞株和人胚肺成纤维细胞株中的转录活性，为肺癌靶向性基因治疗的研究奠定基础。方法以人胚肾293细胞基因组DNA为模板，应用PCR方法克隆hTERT 5’端上游旁侧序列长约1．1kh的启动子片段，经DNA测序无误后克隆人荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游，构建pGL3-hTER Tp重组质粒，用脂质体法瞬时转染人肺癌细胞株A549、SPC-A-1、LTEPa-2、NCI—H446、YTMLC、GLC-82、A2，以及人胚肺成纤维细胞株MRC5，转染48h后检测hTERT启动子在各细胞株中的转录活性。结果琼脂糖凝胶电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1.1kb。DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致，其5’端和3’端分别位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp和43bp，片段长度为1084bp。采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒，均显示构建成功。瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示，hTERT启动子在所检测的肺癌细胞株中均有高低不同的转录活性，而在MRC-5细胞株中无转录活性。结论该实验克隆的1084bp大小的hTERT启动子在多种肺癌细胞株中均有转录活性，在人胚肺成纤维细胞中无转录活性。hTERT启动子有可能作为调控元件用于肿瘤靶向性基因治疗。