胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶系统治疗胰腺癌体内实验研究

目的探讨胞嘧啶脱氨酶(CD)基因对胰腺癌的杀伤作用机制。方法 应用细菌内同源重组法构建含CD基因的腺病毒载体,将Patu8988、SW1990胰腺癌细胞皮下接种BALB/C裸鼠建立胰腺癌的移植瘤模型,重组CD腺病毒液以1010 pfu/ml原位注射入肿瘤,每周2次,24 h后腹腔给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC),连续4周。结果 CD基因原位转导的裸鼠移植瘤生长明显受抑。Patu8988移植瘤治疗组肿瘤重量为(587.7±107.8)mg,SW1990移植瘤组治疗组肿瘤重量为(597.6±159.4)mg,对照组重量为(2 042.4±608.0)mg(P<0.01)。结论重组CD基因的腺病毒载体对胰腺癌不仅转染效果强,加用前药5-FC后,可直接或通过旁观者效应抑制移植瘤的生长。     

胞嘧啶脱氨酶基因体外特异性前药转换抗大肠癌作用研究

为使胞嘧啶脱氨酶(CD)基因在大肠癌细胞中特异表达。方法:构建了以CEA基因顺式转录调控序列驱动CD基因的组织特异型重组逆转录病毒载体G1CEACDNa,以脂质体法将重组载体及转录受LTR驱动的CD基因逆转录病毒载体pCD2分别转导入高分泌CEA的大肠癌细胞LoVo中,经G418完全选择后进行前药5-FC敏感试验。结果:转导普通型及组织特异型CD基因的LoVo细胞较亲代细胞对5-FC的前药转换抑瘤效应明显(均为P<0.01);而转导组织特异性CD基因的LoVo细胞较转导普通型CD基因的LoVo细胞对5-FC的敏感性显著增高(P<0.01),其IC_(50)分别为0.1mmol/L和0.5mmol/L。结论:表明CEA TRS可驱动自杀基因在高分泌CEA大肠癌细胞中特异性表达,在一定程度上达到了靶向杀伤肿瘤细胞的目的。     

温热疗法增强前药氟胞嘧啶对转基因结肠癌细胞株的杀伤作用

目的 探讨温热疗法能否增强前药5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine，5-FC）对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶（cytosine deaminase，CD）基因的结肠癌细胞SW480的靶向性杀伤作用及其机制。方法 将转染G1CEACDNa之结肠癌SW480细胞接种到96孔细胞培养板中，同时加入含各种浓度梯度的前药5-FC。实验组以水浴加温法在43℃下热处理30min，对照组不加热。第8d去除培养液，以MTT法测定活细胞比率，分析前药5-FC联合温热疗法对转CD基因结肠癌SW480细胞的杀伤作用，并以流式细胞仪分析热化疗对肿瘤细胞周期的影响，透射电镜观察热化疗前后肿瘤细胞形态学改变。结果 实验组细胞的杀伤率明显高于对照组（P〈0．05，t=2．403，n=9）；流式细胞仪检测显示实验组S期细胞比例明显增高（P〈0．001，t=7．158，n=6）；透射电镜观察下显示实验组细胞膜微绒毛消失，边缘变平直，细胞核皱缩，染色质聚集在核模下。结论 温热疗法能明显提高转CD基因结肠癌SW480细胞对前药5-FC的敏感性；两者联用能使转CD基因结肠癌SW480细胞产生S期阻滞，从而促进细胞凋亡。     

热化疗对结肠癌LOVO细胞胞嘧啶脱氨酶基因表达的影响

目的 探讨温热疗法对转染胞嘧啶脱氨酶基因的基因表达的影响.方法 脂质体法将质粒G1CEACDNa转染结肠癌LOVO细胞,G418筛选抗体克隆并扩增,给予前药5-氟胞嘧啶(5-FC)进行热化疗;以β-actin为内参照用实时荧光定量PCR检测热化疗前后CD基因表达量的变化.结果 实时荧光定量PCR(Real-Time RT-PCR)检测得到热化疗前CD基因表达的CT值29.5300±1.1974,B.actinct值20.8200±2.7385;热化疗后CD基因表达的CT值30.285±1.201,β-actinet值21.225±2.237;行ΔΔCt法进行相对定量比较差异无统计学意义(P＞0.05,t=1.4521,v=38).结论 温热疗法对转染G1CEACDNa的LOVO细胞CD基因的表达无明显影响.     

联合胞嘧啶脱胺酶与尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因治疗小鼠胃癌

目的探讨联合应用尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)基因对胞嘧啶脱胺酶(CD)/氟胞嘧啶(5-FC)前药转换酶系统抗瘤作用的增强效应。方法将携带UPRT基因和CD基因的逆转录病毒载体通过PA317细胞包装成完整的病毒颗粒并浓缩和纯化。建立615小鼠胃癌皮下移植瘤模型,瘤内反复多次注射携带UPRT和CD基因的逆转录病毒,同时腹腔内给予5-FC,观察抑瘤效果。结果逆转录病毒介导CD基因瘤内原位转导,同时联合应用5-FC进行治疗,结果发现,在肿瘤接种后第12天,对照组肿瘤体积为(2.367±0.371)cm3,而CD/5-FC治疗组肿瘤体积大小为(0.704±0.358)cm3,肿瘤生长明显受抑(P<0.0005)。联合转导UPRT基因后,于肿瘤接种后第16天,肿瘤体积为(0.731±0.255)cm3,而单独应用CD基因治疗组肿瘤体积为(1.455±0.370)cm3,从而证实联合转导UPRT基因可进一步增强CD/5-FC自杀基因系统的抑瘤作用(P<0.001)。结论联合转导UPRT基因,可显著增强CD/5-FC自杀基因系统的抗瘤效应。     

转染自杀基因G1CEACDNa致SW480细胞死亡的机制

目的 研究转染了逆转录病毒载体G1 CEACDNa致SW480肠癌细胞的死亡机制。方法 脂质体法转染G1CEACDNa至SW480细胞。行RT-PCR间接验证CD基因的表达情况。细胞计数测量生长曲线;用含1mmd／L5-氟胞嘧啶(5-FC)的1640培养基培养细胞,MTT法测生长抑制率和旁观者效应;透射电镜观察细胞的超微结构;流式细胞仪annexin V和P1双重染色行细胞凋亡检查。结果 RT-PCR产物电泳显示在1．5kb处可见相应的显影条带。MTT比色实验示1mmol／L5-FC作用下CD SW480细胞在48h开始生长抑制,72,96,120h抑制率分别约为30．0％,50．0％,80．0％。电镜下可见凋亡的早、中、晚期细胞及凋亡小体,同时可见部分细胞呈坏死改变。流式细胞仪显示48h开始有少量细胞出现凋亡,72,96h细胞群凋亡和坏死的比率分别为20．2％,30．7％和19．6％．21．1％。结论 转染G1 CEACDNa的SW480细胞给予5-FC处理后,其细胞死亡机制为坏死和凋亡并存,细胞凋亡过程的诱导可能是该治疗过程中的旁观者效应。     

热化疗对转CD基因结肠癌细胞SW480的杀伤作用

目的　探讨 5 -氟胞嘧啶 ( 5 FC )热化疗对转染组织特异性胞嘧啶脱氨基酶 (CD )基因的大肠癌细胞SW 480的作用。方法　采用脂质体法将CEA基因顺式转录调控序列 (TRS )驱动CD基因的组织特异性逆转录病毒载体G 1CEACDNa转导入大肠癌细胞SW 480 ,以G 418筛选阳性克隆扩增后 ,采用水浴加温法 ,43℃作用 3 0min共 3次 ,同时给予 5 FC进行敏感试验 ;RT PCR法检测目的基因在靶细胞的表达。结果　SW 480 CEACD细胞在 43℃作用 3 0min共 3次条件下 ,CD基因能稳定表达 ;热疗本身对SW 480细胞有一定的杀伤作用 ( P <0 .0 5 ) ,转CD基因后 ,SW 480细胞对 5 FC的敏感性明显提高 (P <0 .0 1) ,热疗与前药 5 FC合用 ,对SW 480 CEACD的杀伤作用显著大于对未转基因细胞的杀伤作用 ( P <0 .0 1) ,亦大于单独应用 5 FC时对SW 480 CEACD细胞的杀伤作用(P <0 .0 5 ) ,热化疗增加了SW 480 CEACD细胞对 5 FC的敏感性 ,并可观察到明显的旁观者效应。结论　热疗与 5 FC联合应用 ,提高了CEA组织特异性CD /5 FC系统对结肠癌细胞SW 480的靶向性杀伤作用。     

白介素-2基因增强胞嘧啶脱氨酶基因的抗结肠癌效应

目的探讨联合应用白介素(IL)-2基因与胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)对结肠癌的治疗效应。方法分别以重组腺病毒载体AdCMVCD、AdCEACD转导EC-CD基因;AdCMVIL-2转导人IL-2基因。分别在体外、内(Balb/cnu/nu裸鼠)研究EC-CD基因联合人IL-2基因对LOVO细胞肿瘤的治疗作用。结果LOVO细胞受AdCMVIL-2感染后,细胞生长有比较明显的抑制。AdCEACD/氟胞嘧啶(5-FC)联合AdCMVIL-2可增强对LOVO细胞的细胞毒作用(P=0.001),肿瘤生长明显抑制(P=0.000),联合治疗的效果与单用AdCMVCD/5-FC接近(P=0.815)。结论联合IL-2基因可明显增强EC-CD基因抗肿瘤效应,且可弥补靶向性载体治疗效率较差的缺点。     

组织特异性胞嘧啶脱氨酶和5-氟胞嘧啶热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响

目的 探讨组织特异性胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统热化疗对裸鼠结肠癌肝脏转移的影响.方法 将45只裸鼠按随机数字表法分为3组:对照组、非热疗组、热疗组,每组15只.门静脉注射法建立结肠癌肝脏转移动物模型,3组分别给予不同的治疗方法.采用χ2检验和单因素方差分析3组肝脏肿瘤转移率、转移数目;观察各组病理学变化、肿瘤细胞凋亡指数;荧光定量RT-PCR和Westernblot检测肿瘤组织中CD基因的表达情况.结果 对照组、非热疗组、热疗组肝脏平均转移癌结节数目和转移率分别为(4.6±1.3)、(2.2±1.0)、(0.5±0.8)个和100.0%、60.0%、13.3%,3组比较差异有统计学意义(F=25.898,χ2=5.208,19.548,5.168,P<0.05);肿瘤细胞凋亡指数平均为4.6%、9.9%和17.4%.热疗组可见大量细胞空泡变性、坏死、溶解现象,有较多的凋亡小体形成.3组均可以检测到CD基因的表达.结论 组织特异性CD/5-FC系统热化疗对转CD基因结肠癌LoVo细胞裸鼠肝脏转移有明显的抑制作用.     

胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤荷瘤裸鼠的抗肿瘤作用

目的 评判胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因治疗系统对恶性脑胶质瘤的抗肿瘤效果.方法 采用Lipofectamine2000TM脂质体介导方法将CD基因转染17251恶性胶质瘤细胞系,并接种于裸鼠前臂皮下,成瘤后腹腔注射5-FC(每13500mg/kg体重)10 d,观察荷瘤鼠肿瘤的生长情况,8周后比较转染组与对照组肿瘤的体积与重量,并进行病理形态学分析.结果 U251细胞获得CD基因的成功转染,5-FC用于不同组别荷瘤裸鼠,8周后转染组肿瘤体积(0.09±0.03)cm3和重量(0.28±0.11)g明显小于对照组(1.81±0.77)cm3和(1.63±0.80)g;形态学揭示转染组肿瘤细胞出现明显的凋亡与坏死.结论 裸鼠在体实验研究表明:CD/5-FC自杀基因治疗系统是治疗恶性脑胶质瘤行之有效的手段之一.