125I偶联VEGF反义寡核苷酸对人膀胱癌VEGF的抑制作用研究

目的观察125I偶联VEGF反义寡核苷酸(125I-ASODN)对膀胱癌细胞VEGF表达的抑制情况.方法采用免疫组化法观察125I-ASODN对膀胱癌细胞VEGF表达的影响,并观察条件培养液对内皮细胞生长的抑制作用.结果免疫组化结果显示对照组VEGF阳性细胞数为平均89.1/100个细胞,125I-Na处理组为90.3/100个细胞,ASODN组为10.3/100个细胞,125I-ASODN组为4.3/100个细胞,125I-ASODN组和ASODN组与对照组及125I-Na组比较,差异有显著性意义(P<0.05);对照组、125I-Na处理组、ASODN组、125I-ASODN组D值分别为0.398±0.031,0.387±0.010,0.298±0.013和0.148±0.011,125I-ASODN组和ASODN组D值与对照组及125I-Na组比较,差异有非常显著性(P<0.01).结论 125I-ASODN 能够明显抑制膀胱癌细胞的VEGF表达,可作为临床抗血管生成治疗膀胱癌的一种有效方法.     

VEGF反义寡核苷酸对Lewis肺癌细胞的抑制作用

目的:〖HT5"SS〗 探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）反义寡核苷酸对C57BL/6小鼠肺癌细胞的抑制作用。〖HT5W〗方法:〖HT5"SS〗 制作C57BL/6小鼠皮下肺癌模型40只,分为VEGF反义寡核苷酸（ASODN）治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组、VEGF错义寡核苷酸（MODN）治疗组及对照组。接种Lewis肺癌细胞后24 h内,用ASODN、SODN及MODN皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,观察小鼠肿瘤的生长情况以及组织形态学改变,标本常规石蜡切片,HE染色,用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达。〖HT5W〗结果:〖HT5"SS〗 对照组、ASODN组、SODN组、MODN组平均瘤重分别为（7.33±0.71）g、（4.56±0.38）g、(7.59±0.32)g和（7.62±0.39）g,ASODN组、SODN组、MODN组抑瘤率分别为43.8%、5.5%、3.1%。光镜下观察, VEGFASODN 能明显抑制肿瘤细胞生长,降低增殖活性。 免疫组化结果表明,ASODN组VEGF的表达水平明显低于SODN组、MODN组及对照组（P<0.05）。CD34免疫组化结果表明,ASODN组MVD为8.25±2.12,与对照组(14.78±3.51)、SODN组(13.71±3.62)及MODN组(12.81±2.56)比较,ASODN组MVD明显减少（P<0.01）。〖HT5W〗结论: 〖HT5"SS〗原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长。     

脂质体介导VEGF反义寡核苷酸对肺癌微血管密度及VEGF表达的抑制作用

背景与目的血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)在肿瘤的血管形成和瘤细胞浸润等生物学行为中发挥了重要作用。本研究的目的是探讨脂质体介导的VEGF反义硫代寡核苷酸对C57BL/6小鼠Lewis肺癌微血管密度及VEGF表达的抑制作用。方法40只C57BL/6小鼠右腋皮下接种Lewis肺癌细胞后,随机分为4组:VEGF反义寡核苷酸组(ASODN)、VEGF正义寡核苷酸组(SODN)、VEGF错义寡核苷酸组(MODN)及对照组,前三组分别皮下注射经脂质体包裹的ASODN、SODN及MODN进行治疗,对照组只注射脂质体,每周2次,连续4周。观察各组小鼠肿瘤的生长情况,测量肿瘤体积。光学显微镜和电子显微镜下观察肿瘤组织形态学改变及超微结构变化。免疫组化及RT-PCR法检测微血管密度、VEGF蛋白及VEGFmRNA表达水平。结果对照组瘤重为(7.83±0.78)g,ASODN组瘤重为(4.49±0.43)g(P<0.01);SODN组瘤重为(7.73±0.69)g,MODN组为(7.78±0.75)g,与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。ASODN组、SODN组、MODN组抑瘤率分别为42.6%、5.1%、3.2%。ASODN组VEGF蛋白、VEGFmRNA表达水平和MVD均明显低于对照组、SODN组及MODN组(P<0.01)。结论肿瘤原位注射反义VEGF硫代寡核苷酸能降低肺癌微血管密度及VEGF的表达,进而抑制肿瘤的生长。     

Survivin与VEGF在膀胱癌组织中的表达及Survivin ASODN对膀胱癌细胞系的作用

目的检测膀胱癌组织中Survivin、VEGF表达的相关性;观察Survivin反义寡核苷酸（ASODN）对人膀胱癌的作用研究。方法采用免疫组化和蛋白印迹技术,检测41例膀胱癌组织及癌旁非癌组织中Sur-vivin和VEGF的表达;应用SurvivinASODN作用后收集各组细胞。观察细胞形态变化及超微结果变化,检测各组Survivin表达情况、AI和PI及ASODN对细胞的生长抑制率。结果41例患者中29例（67.4%）表达Survivin蛋白,其中25例（61.0%）VEGF表达阳性或弱阳性;在癌周非癌组织中未检测到Survivin蛋白的表达。Survivin与膀胱癌的转移有关,P=0.002;Survivin蛋白的表达与VEGF蛋白的表达有相关性,P=0.001。电镜下ASODN组可见典型凋亡样改变;各ASODN转染组细胞Survivin表达减弱,呈时间与剂量依赖性;ASODN转染组AI和PI与对照组相比差异有统计学意义,P=0.012,而AI和PI在各对照组间差异无统计学意义,P〉0.05。结论Survivin在膀胱癌组织中的表达能促进膀胱癌的发生与发展,并可能通过上调VEGF的表达而促进膀胱癌发展与转移。Survivin ASODN转染后能下调Survivin蛋白表达,诱导癌细胞凋亡,抑制癌细胞增殖。     

香加皮杠柳苷对MCF-7细胞周期及p21WAF1/CIP1表达的影响

 目的：研究香加皮杠柳苷（CPP）对人乳腺癌MCF-7细胞周期及p21^WAF1/CIP1表达的影响 ,探讨其抗肿瘤作用及作用机制。方法：采用MTT法检测不同浓度CPP（1.25、2.50、5.00、 10.00、20.00 ng/ml）作用不同时间（24、48、72 h）对MCF-7细胞的增殖抑制作用;应用流 式细胞术分析不同浓度CPP （2.50、5.00、10.00 ng/ml）分别作用于MCF-7细胞6、12、24、 48、72 h对肿瘤细胞周期的影响;并采用RT-PCR和免疫细胞化学技术检测细胞周期相关因子 p21^WAF1/CIP1的表达。结果：CPP能明显抑制MCF-7细胞的增殖,并呈浓度及时间依赖性,作用 于MCF-7细胞48 h的IC₅₀为（4.88±0.16）ng/ml。流式细胞术结果显示,CPP作用MCF-7细胞24 h时,G₀/G₁期细胞明显增多,而S期和G₂/M期细胞显著减少,与对照组相比差异有统计学意义 （P<0.05）,其中5.00 ng/ml组G₀/G₁期细胞由对照组的（49.33±3.25）%升高至（79.47± 2.40）%,S期和G₂/M期细胞由对照组的（28.47±1.59）%和（22.20±2.09）%分别下降至（10.13±3.26）%和（10.40±1.41）%。经CPP处理的MCF-7细胞中p21^WAF1/CIP1 mRNA的表达明显增强,p21^WAF1/CIP1/β-actin光吸度比值与对照组相比明显增高（P<0.05）。免疫细胞化学结果显示,CPP组MCF-7细胞中p21^WAF1/CIP1 蛋白的表达随作用浓度的增加而增强,其中10.00 ng/ml组肿瘤细胞p21^WAF1/CIP1的表达呈强阳性。结论：香加皮杠柳苷（CPP）具有显著的体外抗肿瘤作用,且有效剂量很小,其IC₅₀仅为（4.88±0.16）ng/ml。CPP可使MCF-7细胞发生G₀/G₁期阻滞,并可使细胞周期相关基因p21^WAF1/CIP1的mRNA及蛋白表达增强,提示阻滞细胞周期可能是CPP体外抗肿瘤的作用机制之一。     

Ki67反义肽核酸、反义寡核酸对肾癌细胞系增殖及凋亡影响的研究

 目的 探讨肿瘤增殖相关基因Ki67反义肽核酸(PNAs)、反义寡核酸(ASODNs)对人肾癌细胞增殖及凋亡的调控。寻找肾癌反义治疗的合适药物。方法 将PNAs转染人肾癌786-0细胞系，采用免疫组化、Western blot技术检测Ki67表达，细胞生长曲线，³H-thymidine掺入试验检测肾癌细胞增殖，TUNEL法检测癌细胞凋亡。并与相同浓度的ASODNs进行对比。结果 PNAs处理组(10μmol／L)786-0细胞Ki67表达阳性率(％)(16．9±0．7)降低，Ki67蛋白(％)(42．1±2．2)降低，与ASODNs处理组(28．6±0．4)(83.6±1．4)比较差异有显著性(P<0．01，P<0．01)。PNAs处理组³H-thymidine掺入率(％)(20．7±1．5)减少，与ASODNs处理组(58．6±1．4)比较差异有显著性(P<0．01)。PNAs处理组凋亡细胞阳性率(％)(28．7±2．3)增加，与ASODNs处理组(13．8±1．0)比较差异有显著性(P<0．01)。结论 PNAs可在反义及反基因二个环节发挥抗肿瘤作用，与ASODNs相比，PNAs有更强的阻抑人肾癌Ki67基因表达、增殖及促进凋亡作用，是一种有前途的基因治疗药物。     

FoxP3 mRNA 在胃癌患者CD4 + CD25 + 调节性T 细胞中的表达及其临床意义

 目的 探讨胃癌患者体内CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的含量及FoxP₃ mRNA在Treg中的表达情况及其临床意义。方法 应用流式细胞术（FCM）测定20例胃癌患者外周血中Treg细胞含量,同时采用RT-PCR技术检测其FoxP₃ mRNA的表达情况,并与20例健康志愿者的外周血进行对比研究和统计学分析。结果 胃癌患者外周血中Treg细胞占CD4⁺T细胞总数的（12．76±0．46）％,显著高于健康对照组的（6．81±0．66）％,（P〈0．01）;FoxP₃ mRNA在胃癌患者外周血Treg细胞中呈现高表达（0．84±0．02）％,明显高于其在健康对照组中表达（0．76±0．03）％,（P〈O．05）。结论 胃癌患者外周血中Treg的数量较正常人明显增高,同时伴随有FoxP,mRNA高表达,提示FoxP₃ ,基因可能对Treg有重要的调节功能,从而影响胃癌病人的抗肿瘤自身免疫功能。     

survivin 反义寡核苷酸逆转顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡耐受作用

 目的 探讨survivin反义寡核苷酸逆转人肺腺癌细胞对顺铂诱导的细胞凋亡耐受的效应。方法 1.常规体外培养A549/CDDP细胞,以脂质体包裹的survivin反义寡核苷酸（ASODN）体外转染细胞。2.采用二苯胺反应法（DPA）测定DNA片段化、激酶法检测Caspase-3酶活性及流式细胞术检测细胞凋亡率（AI）,评价细胞凋亡程度。3.采用MTT法测定细胞存活率和生长抑制率,计算半效抑制浓度（IC50）及耐药倍数（RI）。结果 1.单用ASODN转染组DNA片段化比率、细胞凋亡率和Caspase-3相对活性分别增高至（43.55±6.07）%、（34.03±2.25）%和1.1298±0.2502,和各对照组相比较,均有显著性变化（P〈0.01）;而ASODN和CDDP联用组上述凋亡指标增高更为明显,分别达（76.73±2.04）%、（65.85±5.47）%和1.6805±0.2758（P〈0.05）。2.转染组A549/CDDP细胞生长抑制显著,单用转染组和联合CDDP组生长抑制率分别增高达59.3%和83.7%（P〈0.05）。3.ASODN转染后CDDP对细胞IC50由（225.03±10.59）μmol/L减低至（158.84±4.256）μmol/L,其RI由11.9减为8.39。结论 survivin反义寡核苷酸体外转染可降低耐顺铂人肺腺癌细胞的凋亡阈值,从而较大程度上逆转其对顺铂诱导的细胞凋亡耐受。     

子宫内膜癌VEGF2D、MLD 的表达及其与 淋巴结转移的关系

 目的　探讨子宫内膜癌组织中血管内皮生长因子D (VEGF2D) 和微淋巴管密度(MLD) 的表达 与淋巴结转移的关系。方法　选取子宫内膜癌标本53 例,正常子宫内膜标本20 例,以淋巴管特异性标 记物D2240 标记淋巴管并计数MLD ,运用免疫组织化学技术检测VEGF2D 和MLD 在子宫内膜癌、正 常内膜组织中的表达。结果　(1) VEGF2D 和MLD 在子宫内膜癌组织中的阳性表达率及密度值(39/ 53 ,23. 54 ±7. 84) 均显著高于正常内膜组织(5/ 20 ,10. 48 ±1. 62) ( P < 0. 05) ;两者在淋巴结转移组的阳 性表达率及密度值(33/ 38 ,32. 05 ±3. 27) 也明显高于无淋巴结转移组(6/ 15 ,20. 23 ±4. 57) ( P < 0. 05) ; VEGF2D 的表达在不同年龄、不同组织分化程度、不同浸润深度之间差异均无统计学意义( P > 0. 05) ,在 临床分期的表达中差异有统计学意义( P < 0. 05) 。(2) 子宫内膜癌VEGF2D 的表达与MLD 存在相关 性,相关系数rs = 0. 398 ( P < 0. 05) ,VEGF2D 阳性组MLD (31. 17 ±2. 82) 较VEGF2D 阴性组MLD (16. 75 ±3. 63) 显著增高( P < 0. 05) 。结论　VEGF2D 在子宫内膜癌中呈高表达且与微淋巴管密度 (MLD) 呈正相关,其可能通过诱导淋巴管生成促进子宫内膜癌淋巴结转移,可作为指导子宫内膜癌诊 治及判断预后的一个重要指标。     

尿胰蛋白酶抑制剂Ulinastatin 对lewis 肺癌小鼠肿瘤生长和转移的抑制作用

 目的　探讨尿胰蛋白酶抑制剂(U TI) 在动物模型上抗肿瘤作用。方法　选用尿胰蛋白酶抑制剂乌司他丁(Ulinastatin) , Lewis 肺癌小鼠模型;雄性C57BL/ 6 小鼠40 只,接种lewis 肿瘤细胞,分成生理盐水组(对照组) 、环磷酰胺组(CTX) 、Ulinastatin 2. 5万单位组、Ulinastatin 5 万单位组、Ulinastatin 10万单位组,各8 只,接种后第6 天,开始腹腔给药,记录皮下瘤长短径变化,做生长曲线;接种14 天后处死所有小鼠,统计皮下平均瘤重和肺转移灶个数, 使用流式细胞计分析凋亡率(AR) 增值百分比(SPF) 。结果　皮下瘤重依次为(7. 92 ±2. 52 、0. 66 ±0. 50^＊＊ 、3. 47 ±1. 45^＊ 、3. 08 ±0. 81^＊＊、1. 70 ±1. 05^＊＊) g ,平均肺转移灶依次为( 8. 625 ±1. 407 、1. 125 ±1. 126^＊＊、1. 625 ±1. 302^＊＊ 、1. 00 ±0. 75^＊＊ 、0. 625 ±0. 74^＊＊) 。CTX 组(39. 3 ±4. 8) %^＊ 和Ulinastatin 10 万单位组(40. 2 ±3. 1) %^＊的AR 值明显增加,Ulinastatin 未见SPF 值明显减少。结论　Ulinastatin 对lewis 肺癌小鼠的转移瘤生长和自发性肺转移有抑制作用。     

硫代修饰脂质体包裹反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的影响

目的：探讨硫代修饰脂质体包裹的反义VEGF寡核苷酸对肺癌血流的抑制作用。方法：40只C57BL／6小鼠右腋皮下接种Lewis肺癌细胞后，随机分为4组：VEGF反义寡核苷酸组（ASODN）、VEGF正义寡核苷酸组（SODN）、VEGF错义寡核苷酸组（MODN）及对照组。接种24h内，4组小鼠分别皮下注射经脂质体包裹的ASODN、SODN及MODN进行治疗，对照组只注射脂质体，每周2次，连续4周。观察各组小鼠肿瘤的生长情况，超声检测肿瘤血管的收缩期峰值速度（Ps）及阻力指数（砌），原位杂交法及RT—PCR法对肿瘤内VEGFmRNA表达水平进行检测。结果：ASODN组小鼠肿瘤生长受到显著抑制，PS、RI与其它各组相比有明显差异（P〈0．01），VEGF mRNA表达水平亦有明显降低。结论：硫代反义VEGF寡核苷酸能明显抑制肺癌血流，从而抑制肿瘤生长。     

反义寡核苷酸对 Lewis肺癌细胞合成VEGF的抑制作用

背景与目的 血管内皮生长因子(VEGF)是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子,它能促进血管内皮细胞增殖及新生血管的生成.本研究的目的是探讨脂质体介导的VEGF反义硫代寡核苷酸(ASODN)对培养的Lewis肺癌细胞合成VEGF的影响.方法 将经脂质体包裹并经部分硫代修饰后的VEGF ASODN、正义寡核苷酸(SODN)加入培养的Lewis肺癌细胞中,采用RT-PCR技术和免疫组织化学SP法检测肺癌细胞中VEGF mRNA和VEGF蛋白表达,同时测定各上清液刺激下血管内皮细胞生长的受抑情况.结果 VEGF ASODN能明显抑制Lewis肺癌细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达,而且可以显著抑制内皮细胞的生长.结论 VEGF ASODN能抑制肺癌细胞表达VEGF,可以成为肺癌基因治疗的一种新的途径.     

放疗对胰腺癌细胞种植瘤血管生成的影响

Objective

The aim of this study was to observe the effect of radiation on micro-vessel density (MVD) and vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in an transplanted tumor of human pancreatic cancer in nude mice and to explore the role of radiotherapy on pancreatic cancer angiogenesis.

Methods

After vaccinated pancreatic cancer PANC-1 cells, 20 nude mice were randomly divided into radiation group and control group. Radiation group received the radiation (dose of 20 Gy) and were killed 5 days later. The MVD and VEGF expression were determined by immunohistochemistry and then compared with the control group.

Results

The number of MVD in the radiation group was significantly lower than that of the control group (8.30 ± 4.55 vs. 13.60 ± 4.28, P < 0.01). The optical density (OD) of VEGF in the radiation group was higher (2.11 ± 0.54 vs. 1.32 ± 0.61, P < 0.05) compared with the control group.

Conclusion

The radiotherapy can reduce the number of vessels and increase the VEGF expression of human pancreatic cancer transplanted tumor in nude mice.     

VEGF硫代反义寡核苷酸抑制U937细胞VEGF的表达

Objective： To study the effect of VEGF antisense oligodeoxynucleotide （VEGF ASODN） on VEGF expression in acute monocyte leukemic cell line U937 in vitro. Methods： U937 cells were incubated with VEGF ASODN （final concentration as follows： 10, 20 and 30 μmol/L respectively） or scrambled sequence, compared with negative control. The expression of VEGF mRNA was measured by semi-quantitative RT-PCR, VEGF protein was measured by Western blot. Results： VEGF ASODN obviously inhibited expression of VEGF mRNA in U937 cell, compared with scrambled sequence and negative control （P〈0.05）. And the inhibition effect was most remarkable after 24 h, which is related with the dose of VEGF ASODN （P〈0.05）. Scrambled sequence groups had no significant difference compared with negative control groups （P〉0.05）. VEGF ASODN obviously inhibited expression of VEGF protein, compared with scrambled sequence and negative control （P〈0.05）. Conclusion： The expressions of VEGF at mRNA and protein levels in leukemic cell line U937 are down-regulated after being treated with VEGF ASODN.     

血管内皮生长因子反义寡核苷酸对体外及裸鼠体内前列腺癌细胞PC3生物学特性影响的研究

 目的　探讨血管内皮生长因子（VEGF）反义寡核苷酸对前列腺癌细胞PC3在体外和裸鼠体内生长特性的影响,以及局部注射反义寡核苷酸治疗裸鼠皮下移植肿瘤的疗效。方法　采用Oligofectamine携带VEGF反义寡核苷酸转染前列腺癌细胞PC3,实验分为反义寡核苷酸组、正义寡核苷酸组和对照组。软琼脂糖凝胶实验和细胞侵袭实验检测转染反义寡核苷酸的肿瘤细胞成瘤性和侵袭性。裸鼠成瘤实验观察VEGF反义寡核苷酸对体内PC3细胞增殖的影响。建立裸鼠前列腺癌种植瘤模型,局部注射VEGF反义核酸治疗,测定体内抑瘤率。结果　对照组、正义寡核苷酸组和反义寡核苷酸组的PC3细胞每组阳性克隆数分别为53.67±5.86、52.33±6.43和26±4.58（F＝13.73,P＜0.01）,反义组体外形成克隆数显著减少;三组细胞侵袭至下室的细胞数分别为45.60±5.53、42.35±6.21和18.37±3.52（F＝14.18,P＜0.01）;转染VEGF反义核酸的细胞移植瘤生长较慢,接种28 d后三组的肿瘤体积分别为（1330.32±81.38）、（1267.64±120.26）和（641.83±58.34）mm3（F＝17.26,P＜0.01）;局部注射治疗4周后,三组肿瘤质量分别为（1.25±0.08）g、（1.17±0.06）g和（0.41±0.05）g,与对照组比较,正义组和反义组肿瘤抑制率分别为6.4 %和67.2 %,差异有统计学意义（χ2＝17.72,P＜0.005）。结论　VEGF反义寡核苷酸可以抑制前列腺癌细胞PC3 VEGF的表达,进而促进细胞凋亡,降低其成瘤性,抑制侵袭能力。转染VEGF反义寡核苷酸的前列腺癌细胞PC3移植瘤在裸鼠体内生长受抑制,局部注射反义核酸可显著抑制移植瘤的生长。     

反义Stathmin基因对胃癌细胞生长影响的观察

目的探讨反义Stathmin基因的核酸（antisense of stathmin ologodeoxynucleotides,ASODN）对人胃癌细胞系生长的影响及对裸鼠体内肿瘤生长的作用。方法免疫组化检测2010-01-2013-06山东省千佛山医院40例胃癌标本中癌组织及癌旁组织中Stathmin的表达;以人胃癌MCG803细胞系为靶细胞,分为ASODN转染细胞组、SODN转染组及未转染组3组,ASODN为阻断剂,观察ASODN对胃癌细胞的增殖的影响;40只腹腔种植胃癌细胞的裸鼠随机分为2组,观察转染ASODN在裸鼠体内对肿瘤生长的影响。结果Stathmin在胃癌组织中的阳性表达率为77.5%（32/40）,显著高于癌旁组织的32.5%（13/40）,差异有统计学意义,P〈0.001;未转染组及SODN转染组胃癌细胞倍增时间（20h）明显短于ASODN转染组（27h）;随时间进展,ASODN转染组细胞增殖能力均受抑制,差异有统计学意义,P〈0.001;转染ASODN胃癌细胞裸鼠的肿瘤组织体积平为（2.98±0.12）mm^3,小于未转染ASODN组肿瘤组织（7.61±0.21）mm^3,P=0.036。结论 ASODN对胃癌细胞的生长有抑制的作用,有望成为胃癌治疗的新靶点,以提高胃癌患者的生存时间。