应用不对称PCR技术提高寡核苷酸基因芯片杂交效率

目的：比较采用常规PCR和不对称PCR分别进行样品的掺入荧光标记，应用于60met寡核苷酸芯片杂交，分析其对芯片杂交效率的影响。方法：以A／T克隆分别将NS1、NS2a、NS2b、NS4a和NS4b基因片段与pMD18-T载体连接，应用常规PCR和不对称PCR两种方法进行掺入荧光标记，将荧光标记样品与寡核苷酸芯片杂交，在相同条件下完成杂交清洗和芯片的扫描检测。结果：与常规PCR标记方法相比，采用不对称PCR技术标记单链样品与寡核苷酸芯片杂交，能提高芯片的杂交效率。结论：应用不对称PCR技术对样品进行荧光标记后，与寡核苷酸芯片杂交能提高芯片的杂交效率，有利于检测型寡核苷酸基因芯片的应用。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的 对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究，为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法 根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针，人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA，采用限制性显示技术标记，标记样品与芯片杂交后，用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果 芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号，而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论 病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显，在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号，反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

痘苗病毒寡核苷酸检测芯片的设计及研制

目的对痘苗病毒进行寡核苷酸检测芯片的初步研究,为建立寡核苷酸芯片检测该类病毒提供初步研究依据。方法根据痘苗病毒特异基因设计寡核苷酸探针,人工合成探针后制备寡核苷酸芯片。在病毒感染的不同阶段提取病毒样品DNA及阴性样品DNA,采用限制性显示技术标记,标记样品与芯片杂交后,用Agilent芯片扫描仪检测杂交结果。结果芯片与病毒样品杂交有较强的杂交信号,而与阴性样品杂交除阳性探针外均无信号。结论病毒样品与阴性样品杂交信号区别明显,在病毒感染的各个时段也都有明显的杂交信号,反映了寡核苷酸芯片具有较高的特异性和灵敏度。     

利用寡核苷酸膜芯片检测SARS病毒

目的：建立寡核苷酸膜芯片技术检测SARS病毒。方法：以SARS冠状病毒RNA聚合酶基因(P基因)作为目的基因．参考WHO公布的特异性引物序列,将SARSRNA进行P基因克隆。以地高辛标记的引物,扩增质粒DNA,在P基因上设计11条寡核苷酸探针,点于尼龙膜,制备膜芯片,与地高辛标记的PCR产物杂交显色。结果：以此特异性引物成功地扩增出了440bp的基因片段;以T载体成功的克隆了此基因;克隆的P基因为靶序列,与膜芯片杂交显示,能与probe1,probe2,probe4,probe6,probe8,probe96条正义链特异性探针稳定杂交,其中Drobe1,probe4,probe9杂交效果最好,作为最后选择的探针。结论：膜芯片技术能快速敏感地鉴定出标本中的SARS病毒RNA。     

基因芯片中60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒探针的制备

目的用合成仪合成60 mer寡核苷酸SARS冠状病毒的探针来制作寡核苷酸基因芯片.方法根据寡核苷酸探针的制作要求,选取SARS冠状病毒的特异序列30条、长度为60 mer的片段进行合成,并对合成后的纯化方法与条件进行探索.将经12%变性PAGE胶纯化后的探针直接点样制备成12×12阵列的寡核苷酸的基因芯片,初步与处理后的临床样品进行杂交.结果经PAGE纯化的寡核苷酸探针的纯度高,能满足寡核苷酸芯片制备的要求.临床SARS患者标本进行处理后与寡核苷酸芯片杂交、扫描检测,效果较好.结论该室合成的60 mer的寡核苷酸SARS冠状病毒探针能用于基因芯片的制备与检测,这为该疾病的实验室诊断提供了一种快速、平行的检测方法.     

SARS冠状病毒检测60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

目的设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测.方法根据寡核苷酸基因芯片的设计原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段,覆盖SARS冠状病毒(以TOR2株为参考序列,GENEBANK索取号:AY274119)全基因组,点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片,将临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA,采用限制性显示技术进行标记,将标记好的样品与芯片杂交,洗脱,扫描.初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的敏感性及特异性,并对芯片做进一步的优化.结果来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交,出现了明显的荧光信号;阴性和空白对照探针上没有杂交信号,而对照样品仅与一个SARS探针有杂交.结论采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测,对于提高检出率有一定意义,此外,尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.     

乙肝病毒突变位点的寡核苷酸与肽核酸阵列杂交检测

目的：比较利用寡核苷酸阵列和肽核酸阵列检测乙肝病毒突变位点。方法：针对乙肝病毒常见的1762A-T与1764G-A联合突变、1858C-T、 1896G-A 3个突变位点,设计寡脱氧核苷酸和肽核酸检测探针,探针经固定后分别与不对称PCR荧光标记的靶DNA杂交,扫描分析荧光信号强度,DNA序列分析3位点的变异情况。结果：对于寡核苷酸芯片,1762与1764联合位点、1858以及1896位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为1.44、1/1.24、1.05。对于肽核酸芯片,相应位点的野生型探针与突变探针荧光强度的比值分别为2.8、1/3.02、1.71。DNA序列分析结果表明该样本中1858位点为突变位点,1896以及1762与1764联合位点不存在突变。结论：与寡脱氧核苷酸探针相比,肽核酸与靶DNA杂交结合能力和识别单碱基错配能力均高于相应的寡脱氧核苷酸,二者杂交结果与测序结果一致。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

乙型脑炎病毒与黄热病病毒联合诊断基因芯片的初步实验研究

目的制备乙型脑炎病毒（JEV）与黄热病病毒（YFV）联合诊断基因芯片。方法基于早期实验室研究挑选出28条寡核苷酸探针制备检测芯片。克隆于质粒上的乙型脑炎病毒和黄热病病毒基因片段用于检测探针特异性，经限制性显示技术扩增并标记，与芯片杂交后完成扫描和数据分析。结果JEV、YFV探针与相应的荧光标记样本杂交后，均能检测出阳性荧光信号，而空白对照则检出阴性信号。结论基因芯片技术为病毒检测提供了一种早期、可靠的方法，具有应用于多病毒临床鉴别诊断的前景。     

寡核苷酸阵列芯片快速鉴定大肠杆菌O157:H7初步研究

目的设计、制作一种微型化寡核苷酸阵列芯片，评价快速鉴定肠出血性大肠杆菌O157：H7的效果。方法多重PCR扩增大肠杆菌O157：H7七个特异性基因位点（rfbE、flicH7、intimin、Shiga-like toxins Ⅰ and Ⅱ、hemolysin A和uidA）．通过PCR反应掺入SpectrumOrang^TM-dUTP获取荧光标记的靶序列，与制备的芯片寡核苷酸探针杂交。结果寡核苷酸阵列芯片检测结果与试验预期相符，获取的杂交图分辨效果明显优于多重PCR琼脂糖凝胶电泳。结论基于玻片的寡核苷酸阵列芯片制作简便，鉴定病原菌检测细菌毒力因子快速、灵敏、特异，有良好的应用前景。     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的 探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法 对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA，用巢式PCR外侧下游引物进行反转录，以反转录产物为模板，进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMDl8-T载体后进行测序鉴定。结果 被检样品扩增出特异片段，经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论 反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列，证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

传染性非典型肺炎患者泪液和血液中特异性抗体检测的对比研究

目的：通过传染性非典型肺炎(SARS)患者泪液病毒特异性抗体的检测，寻找SARS病毒是否通过泪液或眼结膜传播的理论依据，了解泪液和血液中SARS病毒特异性抗体检测结果的一致性程度。方法：用酶联免疫吸附法(ELISA)检测18例不同病程的SARS患者泪波及血清SARS病毒特异性抗体。结果：18例SARS患者泪液中的特异性IgM类和IgG类抗体均为阴性，而同组患者有13例其血液中的特异性IgM类和IgG类抗体呈阳性。结论：SARS病毒可能不通过泪液或结膜传播。     

正常人群血清中SARS病毒特异抗体的检出

[目的]检测正常人群血清中抗体，了解SARS病毒非致病性感染状况。[方法]利用SARS病毒全病毒裂解液抗原酶联免疫法检测81例志愿者血清中的SARS病毒抗体IgG和IgM。[结果]81例血清中，抗SARS病毒IgG抗体阳性3例，阴性78例；IgM抗体均为阴性。[结论]大连地区正常人群可能有过sARS病毒或类似病毒的非致病性隐性感染。     

SARS-CoV寡核苷酸基因芯片在SARS病例咽拭或咽漱液检测中的应用

目的采用SARS-CoV寡核苷酸基因芯片对200份临床确诊SARS病例的咽拭或咽漱液、401例非SARS感染的呼吸道患者的咽拭或咽漱液样品进行检测,评价该方法用于SARS-CoV核酸检测的灵敏度、特异性及其应用于早期诊断的可能性。方法200例临床确诊SARS患者样品,401阴性对照样品采用双盲法进行测定,抽提可能存在的病毒RNA,采用限制性荧光标记法标记,在同等条件下,进行基因芯片杂交、清洗和芯片扫描检测。通过对杂交结果的数据分析,比照临床诊断和血清学的检测结果,对该方法的灵敏度和特异性及应用于SARS早期诊断的可能性进行评价。结果对601份标本检测的结果,灵敏度为71.50%,特异度为92.01%。对发病10 d内采集临床确诊SARS病例的标本,检测的灵敏度为81.08%。结论利用SARS-CoV寡核苷酸基因芯片检测SARS患者发病早期的咽漱液或咽拭子中的SARS-CoV核酸,灵敏度较高,可作为早期基因诊断。     

SARS病毒S1蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白N端部分,研究其与机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制.方法:将编码SARS病毒S1蛋白N端334个氨基酸残基的基因进行克隆,并在原核表达系统中表达,获得了纯化的重组蛋白.利用SARS患者恢复期已知的SARS抗体阳性血清,鉴定纯化的重组S1蛋白片段.结果:克隆表达的重组蛋白基因序列与公布的SARS病毒S1蛋白N端的基因序列相同,所表达的重组蛋白相对分子质量约为64 000.3份SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在相对分子质量64 000处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组蛋白与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和制备SARS病毒的重组疫苗奠定基础.     

反转录巢式PCR方法检测SARS冠状病毒

目的探索SARS冠状病毒早期诊断的有效手段。方法对临床病例样品采用反转录巢式PCR方法鉴定SARS冠状病毒。提取样品RNA,用巢式PCR外侧下游引物进行反转录,以反转录产物为模板,进行巢式第一次、第二次PCR。PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行测序鉴定。结果被检样品扩增出特异片段,经测序验证确实来自SARS相关冠状病毒。Blast比较结果与SARS冠状病毒多伦多株相应片段只有一个碱基的差异。结论反转录巢式PCR方法验证在非典型肺炎患者标本中存在SARS相关冠状病毒的序列,证实该法不失为一种检测SARS冠状病毒的快速、简便、易行的方法。     

多重巢式和定量PCR联合应用提高SARS病毒检测率

目的寻求一种可靠、可行的对急性严重呼吸道综合征病毒的早期诊断方法。方法应用多重巢式PCR联合荧光实时定量方法，对广州地区91份确诊和疑似病例标本、25份健康志愿者标本同时进行检测。结果25份健康志愿者标本经两种方法检测均为阴性。91份确诊和疑似病例标本经多重巢式PCR方法检测，阳性标本数53例，总阳性检测率58．24％；荧光实时定量PCR检测阳性标本数68例，阳性检出率74．73％；两种方法联合，阳性标本数76例，阳性检出率83．52％。结论多重巢式PCR联合荧光实时定量方法可进一步提高SARS病毒的阳性检出率，也为今后应对可能发生的其它突发性传染病病毒的检测提供分子诊断基础。