人脂肪干细胞与表皮生长因子促进皮肤创面愈合的研究

目的:观察人脂肪干细胞(hASCs)与人表皮生长因子(hEGF)对皮肤缺损创面修复的影响。方法:选择郑州大学第二附属医院2020年1月6例患者抽脂减肥的脂肪组织作为hASCs的来源,以酶消化法从人脂肪组织中提取hASCs,将其培养至第3代。利用倒置显微镜对细胞形态进行观察;使用流式细胞仪鉴定细胞表型及分化能力检测。随机...     

血管基质片段细胞携血管内皮生长因子对移植颗粒脂肪血管化的影响

目的 探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)复合血管基质片段细胞( stromal vascular fraction cells,SVFs)细胞疗法对移植颗粒脂肪组织血管化的影响,寻找一种安全、有效、简单的细胞辅助脂肪移植术式.方法 取患者植皮术后废弃的皮下脂肪,提取SVFs.用DiI染色观察SVFs染色标记情况,锥虫蓝染色观察SVFs活性.将0.3 ml待移植的脂肪颗粒分别与0.2 ml下列细胞混合:①复合有VEGF的SVFs(A组);②SVFs(B组);③DMEM完全培养基(C组).按照随机化原则将3组脂肪组织混合物分别注射移植于裸鼠背部皮下,每只裸鼠背上注射3个点(共12只).观察移植物外形、成活情况、湿重、直径,HE染色及CD31染色镜下观察并计数毛细血管密度.使用SPSS 16.0进行方差分析检验.结果 新鲜提取的SVFs可被DiI标记染色,加用VEGF仍能保持较好的细胞活性,移植术后2个月3组移植脂肪的湿重为:A组(191.90 ±9.81)mg、B组( 177.01±10.50)mg、C组(92.05±8.30)mg,A组＞B组＞C组(P＜0.01).移植物直径为:A组(0.49±0.24)cm、B组(0.40±0.26) cm、C组(0.32±0.28) cm,A组＞B组＞C组(P＜0.01).CD31染色镜下,每高倍镜视野微血管密度:A组(14.58±2.06)个、B组(11.55±2.18)个、C组(7.87±1.55)个,与B组和C组比较,A组较少见纤维结缔组织增生及坏死凋亡细胞.结论 结合VEGF因子的SVFs辅助脂肪移植是一种临床可操作性强、简便可行的较理想的细胞疗法,比单纯SVFs更能有效地促进移植脂肪血管化.     

SDF-1-CXCR4/CXCR7信号对脂肪干细胞促血管新生能力的影响

目的 研究SDF-1对ADSCs体外促血管新生能力的影响,并探讨CXCR4、CXCR7在其中的作用。方法 体外培养ADSCs,检测其CXCR4、CXCR7的表达;SDF-1刺激ADSCs,并分别加入CXCR4、CXCR7封闭抗体,检测ADSCs-CM中VEGF、HGF、β-FGF含量,及其对h UVECs微血管形成的影响。结果 成功培养ADSCs;ADSCs体外培养传代过程中CXCR4、CXCR7表达持续下降;SDF-1刺激上调CXCR4、CXCR7表达,并提高ADSCs对血管活性因子的分泌,及促进h UVEC微血管的形成;封闭CXCR4、CXCR7均可显著抑制SDF-1的促进作用。结论 体外环境下,SDF-1可上调ADSCs中CXCR4、CXCR7表达,并通过SDF-1-CXCR4/CXCR7两条通路提高ADSCs的促血管新生能力。     

脂肪来源干细胞相关生长因子及其作用的研究进展

脂肪来源干细胞能分泌不同生长因子,并发挥多种生物学作用,如促血管生成作用、造血支持作用、抗凋亡作用和趋化作用等。本文对脂肪来源干细胞相关生长因子及其作用的研究进展进行综述。     

脂肪干细胞应用于脂肪移植的新进展

脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSC)具有多向分化和自我复制能力,逐渐成为损伤修复及再生医学研究的热点。ADSC能够分化为脂肪细胞以及血管内皮细胞,可分泌细胞因子,促进血管新生,改善炎症损伤的微环境,并抑制细胞凋亡。在脂肪移植中应用脂肪干细胞,可以明显降低移植后脂肪组织的液化吸收,减少不良反应发生率,提高远期疗效。     

表皮干细胞抽提物重编程脂肪干细胞表达表皮细胞表型的实验研究

目的研究富集的表皮干细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cells,KSC）抽提物对重编程人脂肪干细胞（Adipose derived stem cells,ASCs）表达表皮细胞表型的影响。方法常规方法收集表皮细胞（Keratinocyte,KC）后,应用Ⅳ型胶原差速贴壁法分别收集KSC与富集后剩余的表皮细胞（Keratinocyte enriched with epidermal stem cellsleft,KCL）,鉴定K19和P63的阳性表达率,Gimsa染色法测定KC、KSC、KCL的克隆形成率,分别制备KC、KSC、KCL的细胞抽提物,作用于链球菌溶血素-O（SLO）通透处理过的原代ASCs,分别应用流式细胞仪与Western-blot测定重编程后ASCs中广谱角蛋白（Pan cytokeratin,P-CK）与ASCs的BRG1表达变化。结果 KSC与KC、KCL来源的细胞抽提物重编程ASCs的CK及BRG1表达率,均有明显统计学差异（P〈0.01）。结论脂肪干细胞在表皮细胞抽提物的诱导作用下能表达表皮细胞表型,且对表皮细胞优化处理后的KSC有更加显著的重编程作用。     

碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对骨骼肌源性干细胞的促增殖效应

目的观察碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）单独及联合应用对骨骼肌源性干细胞（muscle derived stem cells，MDSCs）生长的影响。方法取出生24h内的昆明小鼠15只，采用连续预贴壁法从小鼠后肢肌分离培养MDSCs，用含2％胎牛血清的DMEM培养基促进其向骨骼肌细胞分化。取原代MDSCs及MDSCs分化细胞，采用免疫细胞化学染色检测干细胞标志Sca-1和骨骼肌细胞标志α-Sarcomeric肌动蛋白的表达。HE染色观察细胞肌管形成。MTT比色法检测不同浓度（6．25、12．50、25．00、50．00、100．00ng／ml）的bFGF和EGF单独应用96h对MDSCs增殖的影响以及二者（100．00ng／ml）联合作用24、48、72和96h对MDSCs增殖的影响。结果从新生小鼠后肢肌成功分离培养MDSCs，免疫细胞化学染色90％以上的MDSCs呈Sca-1阳性，分化形成的肌管呈α—Sarcomeric肌动蛋白阳性。HE染色可见肌管形成。bFGF、EGF对MDSCs的促增殖效应随浓度的增加而增加。与阴性对照组比较，bFGF于12．50ng／ml出现促增殖效应（P〈0．05）；25．00ng／ml组与12．50ng／ml组比较，作用提高（P〈0．01）；50．00、100．00ng／ml组较25．00ng／ml组无明显提升（P〉0．05）；EGF的作用与bFGF类似，但于50．00ng／ml时趋于饱和。与阴性对照组比较，EGF于72h、bFGF于96h表现促增殖效应（P〈0．01），而二者联合应用于24h即表现促增殖效应（P〈0．01），并于48、72和96h增殖效应均较单独应用显著提高（P〈0．05）。结论bFGF和EGF都能促进MDSCs的增殖，联合作用更快、更强。     

基质血管成分与体外扩增的脂肪来源干细胞促进移植脂肪成活的对比研究

目的:比较血管基质成分(st romal vascul ar fract i on,SVF)与体外扩增的脂肪来源干细胞(adi pose-deri ved st emcel l s,ASCs)对移植脂肪成活的促进作用。方法:用手术方法切取家兔腹股沟脂肪,进行ASCs体外分离培养;取第3代ASCs分别进行成脂、成骨诱导实验,CD29和CD31流式鉴定;制备SVF,进行CD29和CD31流式鉴定;脂肪移植裸鼠实验分为3组:SVF、ASCs、和空白对照组(DMEM/F12),每组4只裸鼠,沿背部脊柱两侧对称部位4个移植位点,每组共16个注射移植位点,每点0.3ml脂肪颗粒(adi pose granul e,AG)+0.2ml细胞成分;术后4m时取材称重、固定行HE染色观察移植脂肪组织结构,行CD31免疫组化染色观察新生血管及其密度。结果:家兔ASCs体外分离培养成功,为贴壁生长,第3代细胞形态均呈长梭形。成脂诱导实验油红O染色显示形成脂滴,成骨诱导实验茜素红染色显示形成钙化结节。流式鉴定显示SVF:CD29:17.0%,CD31:1.3%;ASCs:CD29:96.2%,CD31:3.8%。SVF、ASCs和空白对照组各组移植脂肪成活量分别为0.2096±0.0024g,0.1798±0.0033g,0.1350±0.0020g,两两比较差异均有统计学意义,P<0.05。HE染色显示SVF组移植脂肪成活较好,组织结构完整,脂滴大小均一,可见脂肪组织中间有丰富的血管存在;ASCs组移植脂肪成活尚可,组织结构尚完整,脂滴大小一般均一,可见脂肪组织中有结缔组织纤维间隔和新生血管形成;空白对照组结缔组织纤维间隔明显增多,脂滴大小不一,有少量较大空泡形成。各组移植脂肪新生血管密度分别32.6±2.1条/mm2,29.3±1.6条/mm2,23.3±1.9条/mm2,两两比较均有统计学意义,P<0.05。结论:新鲜的干细胞成分SVF比体外扩增的ASCs能更好的促进移植脂肪成活。     

血管生成素协同血管内皮细胞生长因子对自体脂肪移植血运重建的影响

目的：探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）及血管生成素（ANG）协同VEGF对大鼠自体脂肪移植血运重建的影响。方法：在颗粒脂肪移植的实验动物模型中应用纤维蛋白原缓释VEGF，作用于血管生成素浸泡过的自体脂肪细胞，免疫组化法观察实验组和各对照组移植体血管生长情况，并测量各组脂肪移植体剩余体积量。结果：实验组脂肪组织移植体血供重建良好，实验组脂肪块剩余体积明显大于对照组。结论：VEGF能加快脂肪移植的血运重建，ANG能协同VEGF作用，从而显著提高自体脂肪移植成活率。     

人血管内皮细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞对脂肪颗粒移植存活率的影响

目的 检测大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)经人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后,对脂肪颗粒移植存活率的影响.方法　利用FuGENE HD介导VEGF165基因体外转染SD大鼠BMSCs,与取自SD大鼠的脂肪组织混合后移植于大鼠背部,类似方法设立未转染组及DMEM液空白对照组.检测脂肪组织存活率及再生血管密度.结果　转染组存在外源性基因和蛋白的表达,脂肪组织存活率及再生血管密度高于未转染组,且两者均高于对照组.结论　转染VEGF165基因的BMSCs具有更强的促血管再生作用,可提高游离移植脂肪的存活率.     

不同年龄人体脂肪干细胞体外培养生长特点比较

目的 观察不同年龄段人体脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）体外培养的生长特点.方法 健康志愿者24例,年龄为26～45岁,按年龄分为4组：第1组6例,26～30岁;第2组6例,31～35岁;第3组6例,36～40岁;第4组6例,41～45岁.于不同年龄人体腹部皮下取用等量脂肪组织,胶原酶消化法分离、提取ADSCs,计数原代单核细胞数,记录细胞传代时间,观察传代细胞体外生长特点及检测细胞周期和细胞增殖活性.结果 4组不同年龄段原代单核细胞计数差异无统计学意义（P＞0.05）,而细胞生长至80％融合时所需时间,第2组短于第3组、第3组短于第4组（P＜0.05）;第3组细胞处于增殖期的比例明显高于第4组（P＜0.05）;前3组与第4组相比,四甲基偶氮噻唑蓝细胞活性较好,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 不同年龄段人体ADSCs体外培养细胞特性存在差异,随着年龄的增加细胞的增殖能力降低,其中＞40岁者的ADSCs增殖能力与年龄较小者相比,明显降低.     

富血小板纤维蛋白对人脂肪干细胞增殖和成脂分化的影响

目的 探讨自体富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)对体外培养人脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)增殖及成脂分化的影响.方法 将自愿捐献由脂肪抽吸术获取的脂肪组织进行分离培养ADSCs并鉴定.将第3代ADSCs分为空白对照组和1个PRF膜片组(1PRFM组)和2个PRF膜片组(2PRFM组).倒置显微镜观察细胞生长情况,培养后1、2、3、4、5、6、7d采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT)法检测细胞增殖活性.在第3、5、7、9、11和14天时采用油红O染色法检测细胞成脂分化情况.结果 随着PRFM剂量的增加,细胞增殖数量和成脂率增加,3组差异具有显著统计学意义.结论 PRF能明显促进ADSCs增殖和成脂分化,可以作为自体材料应用于脂肪组织工程的研究.     

两种不同方法诱导脂肪干细胞向表皮细胞分化效果的比较

目的 比较两种不同方法培养诱导脂肪干细胞(ASCs)向表皮细胞分化效果的差异,以寻找更好的诱导分化方法.方法 利用Transwell装置共培养HaCaT细胞与ASCs为共同培养组;在ASCs培养液中加入表皮生长因子(EGF)进行诱导培养为EGF诱导组;两种方法培养3、6d后的ASCs通过进行表皮细胞标志物角蛋白-19(CK-19)、β1整合素和广谱细胞角蛋白Pan-cytokeratin(Pan-CK)染色检测并计数.结果 共培养法诱导3d后的ASCs细胞CK-19、β1整合素、Pan-CK阳性率分别为(25.8±4.1)％、(29.2±3.9)％、(18.3±2.7)％,明显高于EGF诱导组的细胞阳性率,差异有统计学意义(P＜0.05).共培养法诱导6d后的ASCs细胞标记物CK-19、β1整合素、Pan-CK阳性率分别为(34.1±5.7)％、(42.8±4.3)％、(29.4±3.3)％,显著高于EGF诱导组的细胞阳性率(P＜0.01).结果提示采用共同培养法获得的表皮细胞数目多于EGF诱导组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 与HaCaT细胞共同培养诱导比单纯应用EGF诱导能够更好地促进ASCs向表皮细胞的转化.     

脂肪干细胞原代培养及其向表皮细胞诱导分化的研究

目的 探讨人脂肪干细胞(adipose-derivedstem cells,ADSCs)体外原代培养方法及诱导分化为表皮细胞的可能性.方法 利用酶消化法原代培养ADSCs,免疫细胞化学检测其相关表面抗原CD29、CD34、CD44、CD49d、CD80、CD106的表达;用表皮细胞诱导培养基对ADSCs进行体外诱导,观察细胞的生长情况及形态变化;对诱导前后两种细胞行细胞增殖活性及细胞角蛋白表达检测.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,且能稳定传代;免疫组织化学染色证实有特定的干细胞表面标记物表达;对ADSCs成功进行了体外诱导培养,其细胞形态及蛋白表达均有向表皮细胞分化的倾向,并且仍具较高增殖活性.结论 利用酶消化法可在体外成功培养ADSCs,并能持续传代;ADSCs表达特定的干细胞表面抗原;ADSCs可成功进行体外诱导,有向上皮细胞分化的倾向.     

许旺细胞诱导下脂肪来源干细胞向神经细胞方向分化的研究

目的 探讨脂肪来源干细胞(ADSCs)和SD大鼠许旺细胞(Schwann cells)利用Transwell非接触式共培养时生长增殖特性和向神经元样细胞分化的规律.方法 取1月龄SD大鼠腹股沟处脂肪组织,按酶原消化法获取脂肪来源干细胞,同时取大鼠坐骨神经按改良植块法获取许旺细胞.取P3代脂肪来源干细胞分三组:A组使用ADSCs和许旺细胞构建Transwell非接触式共培养体系,B组利用β-巯基乙醇(BME)、丁酸酯羟基茴香醚(BHA)作为脂肪来源干细胞诱导因子使其向神经方向诱导,C组脂肪干细胞为对照组.比较各组细胞形态,观察脂肪来源干细胞代谢、轴突生长、免疫荧光染色情况,并做统计学分析.结果 A组脂肪来源干细胞部分分化为具有细长突起的细胞,B组诱导培养后,大多数存活的细胞也同样转变为类似于神经元的形态,A组突起长度(11.64±1.64)μm,B组突起长度 (13.03±1.35)μm,差异有统计学意义(P>0.05),细胞生长代谢旺盛.A组B组诱导分化后的细胞NF表达阳性率分别为(54.16±9.35)%和(62.25±8.95)%,两者差异无统计学意义,而GFAP染色阴性.在细胞数量上,A组为(4.08±0.68)×107/L,C组(4.20±0.79)×107/L,差异无统计学意义(P>0.05),但明显高于B组(3.23±0.37)×107/L(P<0.05).结论 许旺细胞能促进脂肪来源干细胞向神经方向分化,效果与使用β-BME加BHA试剂诱导的结果相近,并能有效防止脂肪来源干细胞损伤.     

低氧对脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的影响

目的探讨低氧对脂肪间充质干细胞（ADMSCs）向雪旺细胞（SCs）分化能力的影响。方法分离培养SD大鼠ADMSCs并用流式细胞仪、茜素红染色、油红O染色鉴定。将成功分离的ADMSCs随机分为3组：常氧诱导组,在常氧条件下（5％CO2,21％O2,37℃）诱导;低氧处理＋常氧诱导组,低氧处理（5％CO2,0．5％O2,37℃）后在常氧条件下诱导;低氧诱导组,低氧条件下（5％CO2,0．5％O2,37℃）诱导。观察各组细胞形态,MTT法检测细胞增殖情况,免疫荧光染色和Westernblot检测SCs标志物GFAP和S-100的表达。结果细胞分离后,经流式细胞仪分析可见细胞表面CD44阳性、CD45阳性、CD90阳性,茜素红及油红O染色均为阳性。MTT法检测结果：低氧处理＋常氧诱导组A值为0．861±0．039,高于常氧诱导组0．837±0．017,差异具有统计学意义（P〈0．05）;低氧诱导组A值为0．931±0．041,均高于常氧诱导组和低氧处理＋常氧诱导组（P均〈0．05）。免疫荧光染色发现常氧诱导组和低氧处理＋常氧诱导组大量细胞GFAP和S-100表达阳性,低氧诱导组仅少量细胞S-100和GFAP表达阳性。Westernblot检测发现常氧诱导组S-100蛋白表达最高,低氧处理＋常氧诱导组GFAP蛋白表达最高,低氧诱导组S-100蛋白、GFAP蛋白表达均最低。结论低氧抑制ADMSCs向SCs的分化,低氧处理后的ADMSCs在常氧条件下仍可向SCs分化。     

脂肪干细胞诱导分化成淋巴管内皮样细胞的初步研究

目的 探讨利用血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C) (156s)等生长因子诱导脂肪干细胞成为淋巴管内皮样细胞的方法. 方法 取健康成人脂肪组织,胰酶消化法获得脂肪组织来源的间质干细胞(adipose-derived stem cell),通过流式细胞仪检测其表面标记,并进行成脂肪、成骨诱导等体外分化能力鉴定.取生长状态良好的P3代细胞进行诱导实验:设置含VEGF-C156 s、bFGF等生长因子的诱导液组为实验组,并设空白对照组(常规L-DMEM培养基).观察诱导前后两组细胞的形态变化,并于10 d后进行LYVE-1免疫荧光的鉴定. 结果 成功分离纯化脂肪干细胞,流式细胞结果显示,CD13、CD29、CD44、CD105高表达,CD31、CD34、CD45、HLA-DR极低表达,具有间充质干细胞特性;体外成脂和成骨能力鉴定也取得成功;在体外成功利用含VEGF-C156 s、bFGF等生长因子的诱导液将脂肪干细胞诱导为淋巴管内皮样细胞,实验组LYVE-1免疫荧光显色呈强阳性,而对照组则未见到阳性染色;荧光强度定量结果差异有统计学意义(P＜0.01). 结论 利用含有VEGF-C156 s的诱导液可以将脂肪干细胞诱导分化为淋巴管内皮样细胞.     

脂肪源性干细胞研究及其应用进展

目的对脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的生化特征、应用进展及前景等进行综述。方法广泛查阅近年关于ADSCs的实验研究及临床研究文献,并进行整理、综合与分析。结果 ADSCs取材方便,易于培养,分化潜能巨大,可在体外稳定增殖传代。ADSCs在动物实验和临床应用中均取得重大进步,已广泛应用于临床进行心血管疾病、代谢性疾病、脑病的治疗及组织工程修复。结论 ADSCs逐渐取代了BMSCs,已成为干细胞研究的重点和热点。     

脂肪干细胞向表皮细胞表型转分化的研究

目的探讨脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells,ADSCs)跨胚层向表皮细胞表型转分化的可能性。方法取大鼠脂肪组织,用酶消化法分离、培养ADSCs,用免疫细胞化学法、流式细胞仪法鉴定ADSCs。实验分为皮肤匀浆条件培养基诱导7d组;皮肤匀浆条件培养基加入EGF(20ng/ml)诱导7d组;皮肤匀浆条件培养基诱导4d,撤条件培养基,改10?S/DMEM培养3d组;10?S/DMEM为对照组。诱导后经流式细胞仪检测CK19、CK10的表达。结果①免疫细胞化学分析表明ADSCs表达CD49d,而不表达CD106、CD34、CK19、CK10;流式细胞仪检测CD49d、CD44的阳性率分别为94.32%、90.38%。②各诱导实验组细胞CK19阳性率分别为45.32%、26.58%、23.37%,CK10阳性率分别为43.56%、25.54%、18.20%,较对照组CK19阳性率18.53%、CK10阳性率2.46%,明显增高(P<0.01),差异有统计学意义。结论皮肤匀浆液可以诱导ADSCs向表皮细胞表型转分化。     

Endothelial differentiation of diabetic adipose-derived stem cells

Background

Diabetic (DM) patients frequently lack autologous vascular tissue required for revascularization procedures and dialysis access creation. We have developed a tissue-engineered graft that uses adipose-derived stem cells (ASC) as endothelial cell substitutes. Here, we compare DM versus nondiabetic (NDM) ASC in terms of isolation efficiency, proliferation, commitment toward endothelial lineage, and seeding onto the luminal surface of a graft.

Methods

ASC were isolated from liposuction specimens of vascular surgery patients. Proliferation was assessed by constructing growth curves over 14 d. ASC were differentiated in endothelial growth medium (EGM2). Endothelial commitment was assessed by measuring endothelial cell-specific gene expression (CD31, von Willebrand factor) and by cord formation on Matrigel. Finally, ASC were seeded onto a vascular scaffold, flow conditioned, and imaged with confocal microscopy.

Results

Diabetes did not alter ASC isolation efficiency (224,028 ± 20,231 cells/g adipose for DM (n = 53) versus 259,345 ± 15,441 cells/g adipose for NDM (n = 145; P = 0.21). Growth curves for DM (n = 6) and NDM (n = 6) also appeared similar. After culture in EGM2, upregulation of CD31 and von Willebrand factor message was observed in NDM; these markers were found within the primary cultures of DM but no upregulation was observed after culture in EGM2. Both groups exhibited similar cord formation on Matrigel and retention to vascular scaffolds.

Conclusions

Isolation and proliferation studies suggest that adipose is a promising source of stem cells for tissue engineering in the DM population. The angiogenic potential of DM ASC appears intact; however, differences in acquisition of endothelial cell markers suggest that differentiation may be inhibited or delayed by diabetes.