鼠疫、布氏菌、炭疽活疫苗浓度测定通用参考品的研制

目的将现用鼠疫、布氏菌、炭疽活疫苗3套浓度测定参考品整合成一套通用参考品。方法确定通用参考品吸光度值,从3套鼠疫、布氏菌及炭疽疫苗浓度测定用参考品共9个浓度中选取代表性3个浓度参考品;利用现用3种活疫苗浓度测定用参考品的线性方程,计算通用参考品所代表各种疫苗的浓度;制备参考品并进行质量控制;观察参考品的长期稳定性;组织3个实验室进行协作验证。结果确定通用参考品吸光度值为0.350、0.494、0.665;确定通用参考品所代表各种疫苗浓度;完成通用参考品的制备,各项检定符合规定;对4℃冷藏保存参考品进行稳定性研究,变异系数小于2.0%;经3个实验室协作验证,各实验室使用2种参考品的测定结果误差均小于2.0%。结论在现有参考品的基础上整合成一套鼠疫、布氏菌、炭疽活疫苗分光光度法浓度测定通用参考品,并为以后建立分光光度法细菌浓度测定通用参考品奠定基础。     

布鲁氏菌抗原检测试剂用国家参考品的研制

目的研制布鲁氏菌抗原检测试剂评价用国家参考品。方法将3株布鲁氏菌标准株和10株阴性参考菌株在各自适宜的培养基和温度下进行培养,收集新鲜培养物并灭活,采用比浊法制备阳性和阴性参考品菌液;分光光度法制备最低检出量和重复性参考品菌液。对参考品进行均匀性检测和稳定性试验,组织4个实验室对布鲁氏菌抗原检测试剂用参考品进行协作标定。结果建立了由3株布鲁氏菌为阳性参考品、10株阴性菌为阴性参考品、最低检出量参考品及重复性参考品组成的布鲁氏菌抗原检测试剂评价用国家参考品。该参考品具有较好的均匀性及稳定性。协作标定结果为阳性参考品符合率均为100%,阴性参考品符合率均为90%,最低检出量参考品的检出限为1×10~7～1×10~6个/ml之间,重复性参考品均符合规定。结论研制的布鲁氏菌抗原检测试剂评价用国家参考品可用于布鲁氏菌抗原检测试剂的质量控制。     

急性脑梗死患者血一氧化氮、乳酸和C反应蛋白的浓度变化及其临床意义

目的探讨脑梗死患者急性期血中一氧化氮（NO）、乳酸（LA）与C反应蛋白（CRP）的浓度变化及其临床意义。方法采用可见光分光光度法和速率散射比浊法等测定55例急性脑梗死患者血中NO和LA浓度及CRP的含量，并与40例正常对照者进行比较。结果急性脑梗死患者LA、NO浓度和CRP的含量分别为（85．71±23．34）μmol／L、（1．96±0．95）mmol／L、（10．8±2．11）mg／L，明显高于对照组的（49．26±11．58）μmol／L、（0．89±0．17）mmol／L和（5．65±1．46）mg／L（P〈0．05或P〈0．01），且三者之间呈明显正相关（r值分别为0．89、0．71和0．78，两两比较P〈0．01或P〈0．001）。结论NO、LA和CRP均参与急性脑梗死急性期的病理变化过程。     

PCT、Fb和CRP检测在感染性疾病诊断中的应用

目的：探讨降钙素原（PCT）、纤维蛋白原（n）、C反应蛋白（CRP）检测在早期细菌性感染的诊断价值。方法：采用半定量的胶体金免疫结合法检测血清PCT,磁珠凝固法检测血浆Fb,免疫荧光比色法测定全血CRP水平。分别对细菌感染组91例,非细菌感染组108例,非感染组40例（对照组）进行PCT、Fb和CRP的测定。并同时检测白细胞计数和分类。结果：以血清PCT〉10．5ng／ml、Fb〉4．Og／L、CRP〉8．0mg／L为阳性阈值,细菌感染组PCT的阳性率为98．9％、浓度分别为（O．5～〈2．0）、（2．0～〈10）ng／ml、≥10ng／ml三个级别间;Fb的阳性率为93．4％,浓度为（6．19±1．44）g／L;CRP的阳性率为100％,浓度为（150．5±56．6）mg／L。非细菌感染组PCT的阳性率为18．5％,浓度为（0．5-〈2．0）ng／ml;Fb的阳性率为48．1％,浓度为（4．01±1．18）g／L;CRP的阳性率为47．2％,浓度为（48．9±5．61）mg／L。细菌感染组PCT阳性率明显高于非细菌感染组（P〈0．01）;n、CRP水平明显高于非细菌感染组（P〈0．01,P〈0．01）。非细菌感染组Fb、CRP水平明显高于非感染组（2．58±0．32）g／L（P〈0．01）,Cae（14．5±0．3）mg／L（P〈0．01）。结论：PCT、Fb、CRP联检可作为早期细菌性感染的敏感诊断指标,指导临床合理用药和治疗。     

甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型研究

目的 研究我国甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因分型。方法 根据已经证实的22个DFR（差异区段）设计引物，每株鼠疫菌的每个DFR都采用PCR技术进行验证。结果 17株甘宁黄土高原疫源地鼠疫菌株共包括3个基因型，即7、11和13型。7、11和13型所占比例分别为5．9％（1／17）、5．9％（1／17）和88．2％（15／17）。结论 我国甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌的基因型主要为13型，而且13型是该疫源地鼠疫菌所特有的基因型。     

鼠疫耶尔森菌重组质粒pVAX1/Fl-V的构建及其免疫效果的研究

目的获得含有鼠疫F1和V抗原编码基因的重组真核表达质粒pVAX1／F1-V，并测定其诱导特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增鼠疫菌Fl和V编码基因，分别与pGEM-T连接测序，构建pVAX1／F1-V融合重组质粒，转染Cos-7细胞，用Western blot方法鉴定目的蛋白的表达，重组质粒pVAXI／F1．V加GM．CSF佐剂免疫BALB／c小鼠，观察免疫效果，400个半数致死量（uk）强毒鼠疫菌皮下攻毒观察保护率。结果pVAX1／F1-V在Cos-7细胞中表达，免疫鼠体内产生特异性抗体，通过抗体亚型分析、细胞因子等指标的测定表明所构建DNA疫苗以诱发TH1型免疫为主，攻毒保护率达60％。结论成功构建F1-V融合蛋白真核表达载体，具有诱导特异性细胞免疫和体液免疫应答的能力，对强毒鼠疫菌皮下攻毒有一定的保护效力，为鼠疫菌新型疫苗研制奠定了基础。     

飞行质谱法测定血清脑硫苷脂

目的建立基质辅助的激光解吸附离子化-飞行时间质谱法（MALDI-TOF—MS）测定血清脑硫苷脂的方法,并探讨人血清参考范围。方法经去蛋白、各种条件的高温皂化、萃取、干燥后的血清,用不同浓度的过滤溶剂在MonoTip C18洗脱管中过滤杂质．以桂皮酸为基质,在飞行质谱仪上点样测定。在优化后的条件下测定方法的线性范围、回收率与人血清参考范围。结果用90％甲醇配制的浓度0．1mol／LNaOH在150℃皂化25min、用体积比6：4的蒸馏水与甲醇在MonoTip C18管过滤杂质效果最好。方法线性范围为浓度0—20nmol／ml,回收率为73．7％-75．5％,40例健康人血清参考范围：浓度（8．2±1．5）nmol／ml,男女间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论通过飞行质谱仪测定血清脑硫苷脂的含量,具有较高的准确性和线性范围。     

肿瘤相关糖类抗原CA125、CA72-4和铁蛋白联合检测对卵巢癌的诊断价值

目的评价外周血清肿瘤相关糖类抗原CA125、CA72—4和铁蛋白（Ferritin）联合测定对卵巢癌的诊断价值。方法采用电化学发光免疫分析法测定122例卵巢癌、60例良性卵巢肿瘤和50例健康体检者外周血清的CA125、CA72—4和铁蛋白（Ferritin）的水平,采用t检验和χ^2检验进行数据统计分析。结果卵巢癌组CA125、CA72—4和Ferritin的水平及阳性率分别为（436．4±137．5）U／ml与72．9％、（43．2±31．5）U／ml与47．5％、（1213．5±782．6）ng／ml与53．3％,明显高于良性卵巢肿瘤组的（62．3±25．6）U／ml与18．3％、（10．4±4．8）U／ml与15．0％、（623．4±214．6）ng／ml与32．0％及健康对照组的42．5U／ml与2．0％、（8．8±3．1）U／ml与4．0％、（544．6±135．4）ng／ml与16．0％,P〈0．01。随着临床分期的逐步升高,CA125、CA72—4、Ferritin阳性率和水平也不同程度升高。结论外周血清CA125、CA72—4和Ferritin联合检测可提高卵巢癌的检出率,对卵巢良性肿瘤和卵巢癌的诊断及鉴别诊断具有重要临床意义,弥补了单独检测CA125的不足。     

巨噬细胞瘤苗免疫调节作用的研究

目的 观察巨噬细胞肿瘤疫苗对细胞毒性T细胞（CTL）反应及Th1／Th2型细胞因子分泌的调节作用。方法 分别采用MTT法和比色法检测肿瘤细胞杀伤率和清液上乳酸脱氢酶（LDH）含量,采用Western印记法与ELISA法检测脾细胞内及分泌入培养上清的IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ等细胞因子。结果 巨噬细胞肿瘤疫苗接种组的淋巴细胞肿瘤细胞杀伤率与培养上清液LDH水平分别为（36．70±21．02）％和（0．29±0．15）U／ml,明显高于热灭活肿瘤细胞接种组、石蜡诱导的巨噬细胞接种组（P值均〈0．05）。肿瘤细胞冻融物刺激72h后,各组免疫小鼠的脾细胞内均可检测到IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ等细胞因子;同时巨噬细胞肿瘤疫苗接种组脾细胞培养上清中,IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ含量分别为（7．97±3．15）pg／ml、（0．44±0．11）pg／ml、（1．83±0．85）pg／ml和（9．16±4．64）pg／ml,IL-2、IFN-γ的水平均高于热灭活肿瘤细胞接种组和石蜡诱导的巨噬细胞接种组（P值均〈0．05）。结论 巨噬细胞肿瘤疫苗可诱导机体产生特异性抗肿瘤反应,能够促进Th1型细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌。     

广州成人血清总蛋白、白蛋白及A／G比值参考值调查

目的 建立广州地区健康成人血清总蛋白、白蛋白及A／G比值的参考范围。方法 对广州地区2897名健康成人的血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）进行检测，计算A／G比值，对结果进行统计分析。结果 ①TP参考范围为（69．17～84．41）g／L．不存在性别差异（p〉0．05）。男性ALB、A／G明显高于女性（p〈0．001）；男性参考范围为：XLB（44．26～55．16）g／L、A／G（1．33～2．39）；女性参考范围为：ALB（42．49～53．23）g／L、A／G（1．20～2．18）。②男女各年龄阶段TP、ALB、A／G的参考范围也存在不同程度差异。结论 ①广州成年人TP、ALB、A／G的参考范围在性别、年龄组间是不同的。②旧的参考范围已不适用于当今人群，各地、各实验室应测定一批健康成人的标本，统计出本实验室的参考范围。若存在性别差异，应分别制定两性的参考范围。若存在年龄组间差异，还应进一步制定两性内各个年龄组的参考范围。     

重组鼠疫组分疫苗毒理学研究

目的研究重组鼠疫组分疫苗的毒理学作用以评价其安全性,为进一步临床研究提供实验依据。 方法对重组鼠疫组分疫苗进行急性毒性试验,将疫苗1次给予小鼠后,观察所产生的毒性反应和死亡情况,及小鼠对该药物的最大耐受量。分别进行小鼠和豚鼠的异常毒性试验,观察动物有无异常反应,7d后每只动物体重变化。进行家兔的局部刺激试验,注射给药后对动物和注射部位进行肉眼观察,取注射局部皮肤组织进行病理检查。进行豚鼠的全身过敏试验,将致敏的动物静脉快速注射攻击,观察豚鼠有无过敏症状。 结果2种浓度疫苗经腹腔和皮下2种途径注射小鼠,均未引起小鼠的异常症状和死亡,小鼠对重组鼠疫组分疫苗的最大耐受量大于10000μg／kg。小鼠和豚鼠的异常毒性试验表明,注射后7d每组动物均全部健存、无异常反应,且7d后每只动物体重均有增加,均符合2005年版《中华人民共和国药典》三部要求。局部刺激试验中疫苗对家兔注射局部皮肤未引起明显的组织病理学改变。全身过敏试验未出现任何异常反应。 结论重组鼠疫组分疫苗的急性毒性试验、异常毒性试验、局部刺激试验和全身过敏试验毒理学实验结果显示,重组鼠疫组分疫苗用皮下注射的途径进行免疫是安全的。     

雌激素对孕妇外周血内皮祖细胞动员作用的体外研究

目的探讨雌激素对孕妇外周血内皮祖细胞（EPC）的动员作用。方法取孕期为10、20、30周的健康、单胎孕妇外周静脉血，采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞并进行体外培养。采用免疫荧光细胞化学染色方法进行EPC鉴定，取培养4d的细胞，加入DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）和FITC标记的荆豆凝集素（UEA—I），用激光共聚焦扫描显微镜观察和记录图像。取培养7d的细胞，在相差显微镜下计数不同孕期孕妇外周血EPC集落（≥50个细胞）形成数（CFU）。分别通过跨膜迁移和增殖实验观察雌激素对EPC的动员和促增殖作用，随机选取培养7d的细胞，分别加入浓度为1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8mol／L的雌二醇（雌二醇作用组），在相差显微镜下分别计数培养24h后EPC的跨膜迁移数和培养48h后EPC的增殖数，以加入PBS作为对照组，实验均重复3次。结果免疫荧光细胞化学染色显示，平均85％以上的细胞摄取DiI-acLDL并结合FITC—UEA—I，可以鉴定为EPC。孕期为10、20、30周孕妇外周血EPC的CFU分别为1．67±0．33、4．83±0．60、7．50±0．67，组间差异均有统计学意义（P〈0．05）。浓度为1×10^-10、1×10^-9、1×10^-8mol／L雌二醇作用组EPC跨膜迁移数（×10 ^3个／膜）分别为1．50±0，09、1．61±0．06、1．90±0．07，均明显高于对照组（1．03±0．06，P〈0．01）：EPC增殖数（×10^5个）分别为1．07±0．05、1．33±0．05、1．19±0．03，均明显高于对照组（1．00±0．03，P〈0．01）。结论孕妇外周血EPC的功能状态可能与雌激素水平有关，雌激素对EPC的动员具有重要作用。     

重组溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM对Hep2细胞移植瘤的杀伤效应

目的研究自行构建的重组溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM对裸鼠Hep2细胞移植瘤的杀伤效应。 方法裸鼠皮下接种Hep2细胞悬液建立荷人喉癌动物模型。将裸鼠分为单次治疗组和连续治疗（每天1次、连续5d）组，每组据治疗药物不同再分为PBS组、携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的复制缺陷型5型重组腺病毒（Ad-GFP）组、Ad-CD80-TPE-GM组，以PBS、Ad-GFP组为对照组。单次治疗组于治疗后4d取外周血并剥离肿瘤，分别用有限稀释法、BCA蛋白质定量试剂盒和流式细胞术检测肿瘤组织中的病毒感染滴度、总蛋白浓度和CD80表达阳性率，ELISA法检测血清和肿瘤组织中粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CS）表达水平，并计算肿瘤组织中病毒感染滴度量和总蛋白中GM-CSF的表达量。连续治疗组于首次给药后观察裸鼠肿瘤体积的变化，待对照组肿瘤直径〉1cm，或肿瘤表面出现明显溃疡时剥离肿瘤，计算Ad-CD80-TPE-GM组分别与2个对照组相比的相对肿瘤增殖率和抑瘤率。 结果单次治疗组中，Ad-CD80-TPE-GM组肿瘤组织中病毒感染滴度量（IU/tumor）为1.13×10^6（1.40×10^5～7.25×10^7），明显高于Ad-GFP组[1.17×10^2（7.80×10^1～2.40×10^2），P=0.01]，而PBS组未检测到病毒；GM-CSF表达量（pg/mg）为397.32±179.67，明显高于PBS组（4.02±0.93，P〈0.01）和Ad-GFP组（6.92±2.79，P〈0.01）；CD80表达阳性率为31.6%＆#61617;9.0%，而PBS和Ad-GFP组均基本不表达（均P〈0.001）。连续治疗组中，Ad-CD80-TPE-GM组与PBS和Ad-GFP组相比，相对肿瘤增殖率分别为31.8%（P〈0.05）、25.9%（P〈0.01）；抑瘤率分别为73.4%、77.9%（均P〈0.001）。 结论Ad-CD80-TPE-GM能在端粒酶阳性的人喉癌Hep2细胞移植瘤组织内大量复制并有效表达目的基因，具有明显的抗肿瘤效应。     

以腺病毒为模式分析影响病原微生物2种常用灭活方法可靠性的因素

目的以表达绿色荧光蛋白的重组腺病毒（rAdvGFP）为模式病毒,模拟实验室内利用次氯酸钠灭活含病毒废液和利用紫外线对生物安全柜台面进行消毒的实验室操作,并评价其可靠性及影响因素。 方法终浓度为0（阳性对照）、0．5％、0．2％、0．1％、0．05％的次氯酸钠溶液（0．5％、0．2％、0．1％、0．05％次氯酸钠组）分别与rAdvGFP溶液（1×10^6 TCID50）混合后,将混合液原液与混合液的1：10～1：10^5倍比稀释液分别接种人胚肾293细胞,在荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达。将rAdvGFP溶液（1×10^3 TCID50）置于紫外灯下分别照射0（阳性对照）、15、30、60、120min（15、30、60、120min照射组）,各组再按垂直照射高度的不同分为5、10、20、30、67cm亚组,照射后收集各组病毒液接种293细胞,在荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达。实验均重复3次。 结果各组次氯酸钠病毒混合液原液均造成细胞不同程度的损伤,其中0．5％次氯酸钠组混合液原液对细胞的毒性作用较强;稀释10倍后,除0．05％次氯酸钠组外,其余各浓度次氯酸钠组稀释液均导致细胞不同程度的死亡;稀释100倍后,仅0．5％次氯酸钠组稀释液仍对细胞具有毒性作用。荧光显微镜下观察显示,仅0．1％次氯酸钠组的1：10、1：10^2倍稀释液和0．05％次氯酸钠组的1：10、1：10^2、1：10^3倍稀释液接种细胞可见绿色荧光。紫外线照射后在荧光显微镜下观察显示,15min照射组的各亚组细胞均可见明显绿色荧光;30min照射组的20、30、67cm亚组与60、120min照射组的67cm亚组细胞仍可见绿色荧光。 结论有效氯浓度须在0．2％以上、安全柜内1．12mW／cm^2强度紫外线照射30min以上方能有效灭活重组腺病毒,建立实验室操作的可靠性评价技术体系并据此制定标准操作规程很有必要性。     

三七总皂苷和三七剪口高效液相色谱指纹图谱和含量测定方法的建立

 目的 建立三七总皂苷和三七剪口的高效液相色谱（HPLC）指纹图谱和含量测定方法，为三七总皂苷的质量控制提供有效手段。 方法 采用三七总皂苷对照品作为随行对照, 用岛津 C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）色谱柱，乙腈-水梯度洗脱，检测波长 203 nm，流速均为 1.0 ml·min^-1，确定构成三七总皂苷指纹的 10 个共有峰。 结果 采用梯度洗脱的方法能使三七总皂苷的 5 种主要成分三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、Re、Rb1 和 Rd 实现基线分离，并可对这 5 种主要成分进行定量。以人参皂苷 Rgl 为参比峰，所测定的 10 批三七总皂苷样品的相似度均 ≥ 0.995. 结论 所建立的 HPLC 指纹图谱和测定方法以三七总皂苷对照品作为随行对照，可避免由于仪器、试剂和人员的不同所产生的误差，并且简化了实验操作，可作为三七总皂苷的质量控制手段。     

实时定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的构成分析

 目的 研究实时荧光定量PCR用于乙型肝炎病毒（HBV）核酸载量检测时的测量不确定度构成。 方法 采用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者血清标本中HBV核酸载量，收集检测过程中的各类数据，计算以下6种来源的测量不确定度，对该方法的测量不确定度构成进行评估。⑴标本浓缩的不确定度（uenrich）；⑵核酸提取的不确定度（uex）；⑶扩增反应体系的不确定度（upcr）；⑷热循环仪的不确定度（uins）；⑸数据处理的不确定度（uana）；⑹加样枪的不确定度（upip）。其中热循环仪的不确定度检测样本数为7份，其他各种不确定度检测的样本数为10份。 结果 核酸浓度为5.610E+07拷贝/ml的标本，其浓缩过程来源的相对不确定度达0.437；核酸提取来源的浓度真值无偏估计在6.585E+03、9.067E+04、7.223E+06拷贝/ml样本的相对不确定度分别为0.249、0.173、0.140；热循环仪和数据分析来源的相对不确定度分别为0.020和不大于0.050。 结论 标本制备过程中的浓缩和DNA提取步骤所带来的不确定度是实时荧光定量PCR检测HBV核酸载量测量不确定度的主要分量，因此标本制备处理的方法与标准操作程序能否有效地提取核酸并去除PCR反应的抑制物对于该项检测十分关键；起始模板浓度与测量不确定度相关，低浓度的样本显示出更大的相对不确定度。     

耐高温微生物β淀粉酶的制备及其酶学性质的研究

目的筛选高产微生物β淀粉酶的优良菌株,通过微生物发酵法制备微生物β淀粉酶。方法从南宁明阳生化淀粉厂附近的土壤分离出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）原始菌株,取10g土样制成稀释10-2～10-4的倍,平面涂布,单菌落平面纯培养后,纯化选得产β淀粉酶原始菌株,鉴定为枯草芽孢杆菌（命名为NKJ-00）,采用NTG诱变法对枯草芽孢杆菌诱变得突变株,过滤、离心得β淀粉酶粗酶液,采用硫酸铵沉淀法纯化;用蒸馏水代替酶液作为对照组。测定β淀粉酶的酶活力,且对其最适温度、热稳定性、pH的稳定性和金属离子对其的影响等酶学性质进行了测定;最后对β淀粉酶转化可溶性淀粉溶液制备麦芽糖的能力进行了测定。结果枯草芽孢杆菌原始菌株产酶能力为220～230U/ml,得到的4株突变株产酶活力远高于原始菌株,其中NJK-05产酶能力及稳定性最佳,传6代后发酵产酶能力稳定在1500U/ml以上。用NKJ-05菌株发酵制得耐高温微生物β淀粉酶,酶最适温度60～65℃,酶活力为2.2万U/ml,50～65℃是稳定的,pH5～8时相对稳定。pH〉8相对酶活下降较明显,pH〈5时,相对酶活迅速下降;金属离子对β淀粉酶活性有一定的抑制。提取纯化后的β淀粉酶作用于22%～25%的可溶性淀粉溶液得到60%～70%的麦芽糖浆。结论β淀粉酶可通过微生物发酵法生产,微生物β淀粉酶的稳定性、耐高温等指标均超过植物β淀粉酶,纯度基本上达到工业生产的要求。     

产毒型 O1 群霍乱弧菌实时荧光双重TaqMan PCR 的临床应用前研究

 目的 探讨产毒型 O1 群霍乱弧菌实时荧光双重 TaqMan PCR 法对临床模拟标本检测的意义,为该法的临床应用提供可靠的技术依据。 方法 将 O1 群霍乱弧菌灭活菌株悬液[1.0 × 1011 CFU（菌落形成单位）/ml]连续 10 倍稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成 5.0 × 101 ~ 5.0 × 109 CFU/g 梯度浓度的模拟带菌者粪便标本并提取 DNA,用以评价产毒型 O1 群霍乱弧菌实时荧光双重 TaqMan PCR 法对临床模拟标本检测的灵敏度、特异性和稳定性。 结果 实时荧光双重 TaqMan PCR 法对 O1 群霍乱弧菌的模拟带菌者粪便标本的检测灵敏度为 1.0 × 103 CFU （5.0 × 104 CFU/g）每反应体系,其检测线性范围为 1.0 × 103 ~ 1.0 × 108 CFU 每反应体系;在稳定性评价中,对含菌量 1.0 × 103 ~ 1.0 × 108 CFU 每反应体系模拟带菌者粪便标本 DNA 进行 3 次重复检测的结果显示,ctxA 基因扩增反应 Ct 值的变异系数为 0.54% ~ 1.36%,rfb-O1 基因扩增反应 Ct 值的变异系数为 1.65% ~ 3.75%;在特异性评价中,3 名健康成人新鲜粪便标本的阴性对照均未见特异性扩增曲线。 结论 产毒型 O1 群霍乱弧菌实时荧光双重 TaqMan PCR 法可用于 O1 群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

人海绵状血管瘤动物模型的建立和治疗药物的筛选

 目的 建立人海绵状血管瘤的动物模型，并用于药物筛选。方法 用荆豆凝集素包被的免疫磁珠分离和纯化人海绵状血管瘤内皮细胞（HCAEC）。将HCAEC（2.5×10⁶个）与人肝癌细胞Bel-7402（5×10⁵个）混合接种于裸鼠皮下，建立海绵状血管瘤的动物模型。通过绿色荧光蛋白示踪和组织学检查分析血管瘤中内皮细胞的来源和血管瘤的病理特征。另外，应用血管瘤内皮细胞和血管瘤动物模型筛选血管瘤的治疗药物。结果 HCAEC与Bel-7402细胞共移植于裸鼠皮下后7～9 d即可见接种局部形成血管瘤样结构。组织学检查显示血管瘤模型的组织学特征与人的海绵状血管瘤非常相似。细胞绿色荧光蛋白示踪显示绿色荧光蛋白存在于血管瘤的管壁，表明这些细胞来源于接种的HCAEC。药物筛选发现876-3，一种从中药中提取的单体，体外明显抑制HCAEC增殖，体内对血管瘤具有良好治疗作用。结论 HCAEC与肝癌细胞共移植在裸鼠皮下可以形成人源化血管瘤动物模型，这种血管瘤动物模型可以用于治疗药物的筛选。     

羊种布鲁氏菌05/43株侵染绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建

 目的 构建羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库。 方法 培养的绵羊肺泡巨噬细胞经羊种布鲁菌 05/43 株侵染后，以 Trizol 试剂提取其总 RNA， 用 cDNA 文库构建试剂盒构建巨噬细胞的 cDNA 文库。随机选取 cDNA 文库中的 18 个克隆进行表达序列标签（EST）序列测定，测序结果用 BlastX 和 BlastN 软件在 GenBank 蛋白质库和核酸库中进行序列同源性比对。 结果 构建的 cDNA 文库的库容量为 1.192 × 10⁶，重组率为 95.65%。18 个 EST 测序，12 个与 CD 抗原基因、细胞因子基因、蛋白酶基因等已知功能的基因序列相关，6 个为未知功能基因的 EST 序列。 结论 成功构建了羊种布鲁菌 05/43 株侵染绵羊肺泡巨噬细胞的 cDNA 文库，这将有助于阐明该菌株的致病机制。