EphrinA1在肝细胞癌患者内皮祖细胞中的表达及其临床意义

目的了解肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者外周血中手术前后内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的数量及其内包含的EphrinA1 mRNA的表达变化情况和临床意义。方法应用流式细胞术（FCM）检测手术前组、手术后组和健康对照组外周血中EPCs的含量,同时分离培养三组研究对象外周血中的EPCs,用RT—PCR检测EPCs上EphrinAl的表达情况,进行统计学分析。结果肝癌患者手术前组外周血中EPCs的数量明显高于手术后组和健康对照组（P〈0．05）,EphrinA1在肝癌患者手术前组外周血EPCs中存在表达,明显高于手术后组和健康埘照组（P〈0．05）,而在手术后组和健康组问差异无统计学意义。结论肝癌患者外周血中的EPCs明显增加,同时其内的EphfinA1表达增高,提示EphrinA1可能在EPCs的增殖动员中起到重要作用．     

骨髓来源血管内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探索体外分离培养骨髓来源血管内皮祖细胞的方法。方法:将骨髓细胞接种至明胶涂层的培养皿内,用含10%胎牛血清、添加50μg/ml ECGS的M199培养液,置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养箱培养,0.05%胰酶-EDTA消化传代。通过CD31免疫荧光染色、荆豆凝集素免疫细胞化学染色及毛细血管腔形成能力检测进行鉴定。结果:培养5～7天,内皮祖细胞的早期克隆形成,2周后细胞表现出典型的"鹅卵石"状。可与荆豆凝集素特异性相结合;内皮细胞特异性表面标志CD31荧光染色呈阳性表达;培养过程中可形成管腔状结构。结论:自骨髓可以获取足量的EPCs。     

骨髓来源血管内皮祖细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探索体外分离培养骨髓来源血管内皮祖细胞的方法。方法:将骨髓细胞接种至明胶涂层的培养皿内,用含10%胎牛血清、添加50μg/ml ECGS的M199培养液,置37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度恒温培养箱培养,0.05%胰酶-EDTA消化传代。通过CD31免疫荧光染色、荆豆凝集素免疫细胞化学染色及毛细血管腔形成能力检测进行鉴定。结果:培养5～7天,内皮祖细胞的早期克隆形成,2周后细胞表现出典型的"鹅卵石"状。可与荆豆凝集素特异性相结合;内皮细胞特异性表面标志CD31荧光染色呈阳性表达;培养过程中可形成管腔状结构。结论:自骨髓可以获取足量的EPCs。     

血管内皮生长因子165基因重组腺病毒载体的构建及转染内皮祖细胞的实验研究

目的：利用细菌内同源重组法构建含血管内皮生长因子（VEGF）165基因的重组腺病毒，并观察其在内皮祖细胞（EPCs）中的表达，为进一步研究其在慢性肾脏病中的作用奠定基础。方法：用限制性内切酶XbaⅠ＋HindⅢ从质粒载体中切出VEGFl65基因片段，与KpnⅠ＋HindⅢ双酶切的pAdTrack-CMV形成转移质粒pAdTrack-CMV-VEGFl65，PmeI酶切线性化后与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，由人胚肾293细胞包装成Ad-VEGFl65，PCR和westem blot法鉴定其表达。贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs，Ad-VEGFl65基因体外转染EPCs，检测转染后目的基因的表达情况。结果：利用CSCI，法由pAdTrack-VEGFl65和pAdEasy-1共转化BJ5183感受态茵，可获得阳性重组体细菌克隆。PCR检测表明重组腺病毒已含有目的基因，病毒滴度1．4×10^10pfu／ml。Ad-VEGFl65转染培养第6天的EPCs后24h开始，培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加。结论：成功制备的重组体腺病毒Ad-VEGFl65转染体外培养的EPCs后，在体外能有效高表达目的基因产物，为今后VEGF在肾脏病中的深入研究奠定了基础。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

VEGF165基因转染骨髓源性血管内皮祖细胞的体外实验研究

目的探讨血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）转染骨髓源性血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）后，EPC分泌VEGF及活性以及EPC特性的影响。方法体外获取大鼠骨髓，分离单个核细胞，经培养，鉴定为EPC。用脂质体介导pcDNA3．0-hVEGF165转染，转染后EMSA法测培养上清VEGF蛋白水平，培养上清液对ECV304细胞生长的影响，以评价VEGF蛋白活性，MTY法评价转染对细胞活性的影响，免疫细胞化学检测EPC表达VEGF、vWF（血友病因子）、VEGF—R2（血管内皮生长因子受体2）的变化。结果转染后的第7天表达的VEGF蛋白浓度达1280pg／ml，转染对EPC的增殖无影响，表达VEGF、vWF、VEGF—R2的比率随时间而逐渐升高，至第7天时分别为88．52％、82．65％和95．97％。结论VEGF转染的EPC能表达一定浓度有功能的VEGF蛋白，能帮助EPC保持内皮细胞特性，向成熟内皮细胞分化。     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞（EPCs）体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3-4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3~4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的:探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法:取生长活跃的EPCs,分别转染不同浓度的携带VEGF-165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）（转染组）及空质粒（Adv-GFP）（空质粒组）,并设空白对照组。荧光显微镜下观察转染效果,MTT法检测不同病毒滴度时细胞增殖情况;ABC-ELISA法检测上清液中VEGF蛋白表达情况。结果:转染组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光。病毒滴度为1∶100的转染会导致细胞生长停滞,并造成细胞损害; 1∶50的转染后对细胞增殖无明显影响。ELISA检测证实转染组上清液中VEGF蛋白浓度明显高于空质粒组及空白对照组（P<0.01）。结论:以腺病毒为载体的VEGF基因转染EPCs是可行的,1∶0是合适的转染比率,转染后上清液中VEGF蛋白表达明显增加。     

人脂肪组织来源内皮祖细胞的分离、培养及鉴定方法的实验研究

目的探讨人脂肪组织来源的内皮祖细胞的分离、培养及鉴定的方法。方法脂肪抽吸术获取人体脂肪组织,消化法得到的细胞接种在Fibronectin包被的培养皿内,用含2%胎牛血清的DMEM培养,传至第2代,分诱导组(EGM-2,2?S,VEGF,bFGF等)和非诱导组(DMEM,2?S)两组进行培养。免疫细胞荧光分别检测两组的CD34、vWF和PECAM-1表达;流式细胞仪分别检测两组的CD34、CD45、CD133和PECAM-1表达率;荧光显微镜观察细胞摄取DiI-ac-LDL的功能;诱导组细胞接种于甲基纤维素半固体培养基进行三维培养,观察血管样结构形成情况。结果诱导组细胞12d后呈现内皮细胞典型的铺路石样形态,未诱导组细胞未观察到这种变化;免疫细胞荧光显示诱导组vWF、PECAM-1表达阳性,未诱导组细胞CD34表达阳性;流式细胞仪检测显示诱导组PECAM-1阳性率为(67.41±13.35)%,明显高于非诱导组的(6.73±2.21)%(P<0.01),非诱导组CD34阳性率为(72.39±13.45)%,明显高于诱导组的(16.06±3.86)%(P<0.01);荧光显微镜观察显示诱导组细胞具有摄取DiI-ac-LDL的功能;诱导组细胞三维培养形成"树枝样"分叉结构。结论建立了一种从人脂肪组织分离、培养EPCs的方法,并对其表型进行鉴定,有望为血管组织工程提供新的种子细胞来源。     

人骨髓来源内皮祖细胞的分离培养及生物学特性的鉴定

目的建立人骨髓来源的内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、诱导分化与鉴定的方法,并探讨其生物学特性。方法收集腰椎间盘退变性疾病患者的髂骨骨髓24例,密度梯度离心法分离的单个核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶,贴壁培养,EGM-2培养基诱导扩增EPCs。Dil-ac-LDL、FITC．UEA—I荧光双标、流式细胞术鉴定EPCs,计算纯度。透射电镜和管腔形成实验鉴定EPCs向血管内皮细胞（ECs）分化的能力。结果培养72h换液时可见贴壁细胞形成明显细胞克隆集落,第5天集落数增加,1周后细胞融合达80％,至第14天细胞呈铺路石样排列。培养至第7天细胞Dil-ac-LDL、FITC-UEA-I双荧光染色阳性率为（95．1±4．0）％,CD133、CD34、KDR、VE。Cadherin标记阳性率分别为（18．5±4．4）％、（45．4±7．8）％、（66．7±7．2）％、（20．5±5-3）％。培养第10天细胞透射电镜显示成熟血管ECs特有的Weibel-Palade小体。管腔形成实验表明,体外ECMatrix上培养7至12d的EPCs具有较强的管腔形成能力。结论采用密度梯度离心与贴壁培养法分离、培养的人髂骨骨髓来源的单个核细胞在特定诱导条件下可分化为EPCs,纯度较高,稳定性和重复性好。EPCs培养7至12d,具有良好的管腔形成能力。     

骨髓单个核细胞和骨髓源内皮祖细胞移植促进血流重建的比较研究

目的 比较骨髓单个核细胞(MNCs)和骨髓源内皮祖细胞(EPCs)移植促进血流重建的效果,探讨非内皮祖细胞在血流重建中的作用.方法 获取Lewis大鼠骨髓MNCs,部分MNCs在体外诱导分化为EPCs.采用Lewis大鼠建立单侧后肢缺血模型.建模后3 d,将模型鼠随机分为3组:(1)对照组(n=6),将0.8 mL D-Hank's液注入对照组大鼠缺血侧后肢;(2)MNC组(n=6),将8×10~6个骨髓MNC植入MNC组大鼠缺血侧后肢;(3)EPC组(n=6),将体外培养的8 × 10~6个EPC植入EPC组大鼠缺血侧后肢.细胞移植后3周行大鼠后肢动脉造影,检测缺血侧后肢侧支血管数;切取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31和α-SMA免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度.结果 MNC组毛细血管密度与EPC组差异无统计学意义[(31.67 ± 7.87)个/HP vs.(32.83±5.38)个/HP,P＞0.05].而均高于对照组(19.67 ± 4.80个/HP)(P＜0.05);MNC组侧支血管数与EPC组差异无统计学意义[(4.17±0.75)个vs.(4.50 4±1.38)个,P＞0.05],但均高于对照组[(2.50 ± 1.5)个](P＜0.05);MNC组小动脉密度与EPC组差异无统计学意义[(4.83 ± 1.47)个vs.(5.50 ± 2.35)个,P＞0.05],亦均高于对照组[(2.17±0.98)个](P＜0.05).结论 在骨髓干细胞移植治疗肢体缺血性疾病中,非内皮祖细胞在血流重建中所起的作用与EPC相似.     

诱导大鼠骨髓内皮祖细胞成内皮细胞的体外增殖规律的观察

目的　观察大鼠骨髓内皮祖细胞 (EPCs)体外诱导成内皮细胞的生长增殖规律。方法　密度梯度离心得到Wistar大鼠骨髓单个核细胞 ;以 10 μg/L血管内皮细胞生长因子 (VEGF)和2 μg/L碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)体外诱导 ,通过细胞形态、免疫荧光法观察内皮细胞表型 ;原代细胞克隆形成率、细胞计数和流式细胞术检测VEGFR 2、VE 钙黏蛋白 (cadherin)阳性表达率观察体外增殖能力与表型。结果　诱导后细胞呈铺路石样形态。免疫荧光法发现诱导细胞表达小鼠抗大鼠Ⅷ因子 (vWF)、VEGFR 2、VE cadherin和CD3 1。原代克隆形成率为 6.66± 0 .75 ;细胞随代次增加增殖能力逐渐下降 ;VEGFR 2和VE cadherin在P2与P5中的阳性率差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　骨髓EPCs在体外可诱导为成内皮细胞 ,并可保持相对稳定的诱导阳性率。     

大鼠未成熟树突状细胞体外扩增及功能鉴定

摘要：目的 探讨建立大鼠体外大量扩增未成熟树突状细胞(DC) 的方法, 以及不同剂量粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)对大鼠DC分化成熟的影响。方法 分离纯化并扩增大鼠骨髓细胞，用不同剂量GM CSF培养,6 d 和10 d后收集悬浮细胞进行扫描电镜观察和免疫表型鉴定,并行混合淋巴细胞反应,观察其诱导未致敏T 淋巴细胞增殖的情况。结果 小剂量GM CSF 培养获得的DC(GMlowDC) 形态上具有DC 的典型特征,在细胞表型、细胞功能试验上具有未成熟的特性,具有DC 的典型特征,细胞表面高表达CD11c,低表达CD80，CD86及MHC II类分子,与大剂量GM CSF加IL 4的联合组培养获得的DC( GMhighDC) 相比,其体外刺激未致敏T 淋巴细胞的增殖能力较弱.结论 笔者所建立的培养未成熟DC 的方法是可行的；GM CSF的剂量与细胞的成熟程度相关。     

梗阻性黄疸鼠肝脏血红素氧化酶-1及一氧化碳含量的研究

目的 探讨梗阻性黄疸时肝脏血红素氧化酶-1(HO-1)及血浆中一氧化碳(CO)含量的变化。方法 48只 Wistar 大鼠随机分为 4组:假手术对照组(CG)、梗阻性黄疸 7 d组(7 d)、梗阻性黄疸 14 d组(14 d)和梗阻性黄疸 21 d组(21 d),采用免疫组织化学法对肝细胞中 HO-1表达进行分析,应用双波长分光光度计法测定大鼠肝静脉、门静脉及下腔静脉血浆中CO含量。结果 梗阻性黄疸时 HO-1不仅在 Kupffer细胞中表达,而且在肝实质细胞中呈弥漫性表达上调,14 d组和 21 d组肝实质细胞中HO-1表达均较7 d组增加(P<0.01)。梗阻性黄疸各组肝静脉血浆中CO含量较CG组增高(P<0.05,P<0.01);14 d组门静脉血浆中CO含量升高明显,与CG组比较差异有显著性(P<0.05);梗阻性黄疸各组肝静脉血浆中 CO含量与同时间组门静脉血浆中 CO含量相比均显著升高(P<0.01)。梗阻性黄疸各时间组肝静脉CO含量的增高与肝实质细胞中HO-1表达的变化呈显著正相关(P<0.01)。结论 梗阻性黄疸时肝细胞HO-1表达上调致CO产生增多,从而有助于增加肝血流量并减少肝脏功能损害。     

猪TGF-β1基因重组慢病毒载体的构建及其在BMSCs中的表达

目的构建猪TGF-β1重组慢病毒表达载体,并转染BMSCs,为构建组织工程骨软骨提供TGF-β1修饰的BMSCs,作为持续、高效的种子细胞。方法将已获取的目的基因TGF-β1cDNA包装至慢病毒载体中,通过PCR及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。取2月龄巴马香猪(体重约15 kg)骨髓制备BMSCs,取第2～3代用于实验。用TGF-β1重组慢病毒载体以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10、50、70、100、150分别转染BMSCs,通过激光共聚焦显微镜观察,并以Western blot检测不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。用TGF-β1重组慢病毒载体以最佳MOI值感染BMSCs作为实验组,以空载体转染的BMSCs(空载体组)及未转染的BMSCs(空白组)作为对照,通过RT-PCR、免疫细胞化学染色、ELISA等方法检测TGF-β1基因及蛋白在BMSCs中的表达情况,并检测Ⅱ型胶原表达情况。结果经PCR及基因测序鉴定TGF-β1重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染BMSCs,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光;Western blot示MOI为70时转染效果最佳;RT-PCR示实验组TGF-β1基因的表达量明显高于空载体组及空白组,差异有统计学意义(P<0.05);免疫细胞化学染色示实验组TGF-β1蛋白及Ⅱ型胶原呈阳性表达,而空载体组及空白组呈弱阳性或阴性表达;ELISA示实验组TGF-β1蛋白至转染后21 d仍有较高表达。结论 TGF-β1重组慢病毒表达载体可成功转染BMSCs,TGF-β1蛋白可长期、稳定表达,促使BMSCs向成软骨细胞方向分化。     

血红素加氧酶-1及其与重症胰腺炎之间关系的研究进展

近年来,血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)已经成为危重病及其他许多领域的研究热点.HO-1通过分解血红素而产生的一氧化碳,胆绿素和胆红素,及亚铁离子可以减轻炎性介质反应,拮抗细胞氧化性损伤和细胞应激从而发挥细胞保护性作用.而在对重症胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)的研究中,人们已经认识到拮抗炎症因子的过度释放是提高胰腺炎疗效的重要环节.本文就HO-1及其与SAP之间关系的研究进展做一综述.     

活体生物荧光成像技术检测HO-1在HO-1/Luc小鼠肝脏缺血模型中的表达

目的尝试使用活体生物荧光成像技术无创定量检测HO-1在活体动物肝脏温缺血模型中的时空表达。方法建立小鼠部分肝脏温缺血模型，使用活体生物荧光成像技术连续检测HO-1在HO-1／Luc转基因报告小鼠中的转录情况。使用RT-PCR方法检测HO-1 mRNA水平，免疫组织化学方法行HO-1的表达定位。结果缺血肝叶发出的荧光信号最早于再灌注后3h被检测到，随后信号不断增强在9h达到峰值，然后信号逐渐减弱至再灌注后48h恢复至基础水平。RT-PCR方法测得在HO-1蛋白上调之前出现了HO-1mRNA的表达增强。免疫组织化学染色方法证实肝脏细胞是缺血再灌注损伤后HO-1表达上调的主要部位。结论活体生物荧光成像技术可以实时定量检测肝脏缺血后HO-1的表达，是一项敏感的检测技术。     

BC022687基因真核表达质粒的构建及在CHO细胞内的蛋白表达和定位

目的:BC022687可能是调节纤毛形成的蛋白。本研究构建BC022687基因真核表达载体并探讨融合蛋白在细胞内表达及定位。方法:以小鼠睾丸cDNA文库为模板,PCR扩增全长BC022687编码序列,测序后亚克隆至携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的pEGFP-C1真核表达载体中。将构建的重组质粒转染到CHO细胞中,提取细胞蛋白进行Western印迹检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察BC022687/GFP融合蛋白在CHO细胞内定位。结果:翻译BC022687蛋白的cDNA序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小950 bp。Western印迹检测到相对分子质量约为64 000的融合蛋白表达。BC022687/GFP融合蛋白在细胞内定位以细胞质为主,并在中心体、纤毛形成的模板表达。结论:成功构建BC022687全长基因真核表达载体,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

体外诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)成内皮细胞的实验研究

目的体外诱导大鼠骨髓内皮祖细胞(EPCs)成内皮细胞,探索其作为血管组织工程内皮种子细胞的可行性.方法冲洗大鼠骨髓腔,通过密度梯度离心得到单个核细胞;按诱导(M199,20%FBS,VEGF 10ng/mL,bFGF2ng/mL)和未诱导(M199,20%FBS)分组培养骨髓单个核细胞,体外培养至第二代;免疫细胞荧光分别检测诱导组和未诱导组细胞VWF、VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1的表达;流式细胞仪分别检测骨髓单个核细胞、诱导组细胞和未诱导组细胞VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1表达率;诱导组细胞接种于胶原凝胶中三维培养,观察血管生成能力.结果诱导组原代细胞呈小梭形,5～7d时出现典型的线样结构,P2、P3细胞逐渐成内皮细胞典型铺路石样结构,未诱导细胞未见这两种典型结构;免疫细胞荧光发现,诱导组细胞有VWF、VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1表达,未诱导组未见明显表达;流式细胞仪检测显示三种标记(VEGFR-2、VE-cadherin和PECAM-1)在原代时的比例均不到总细胞数5%,经两代培养后,诱导组中阳性细胞率高于35%,未诱导组阳性细胞率明显低于诱导组(P＜0.01);三维培养状态下诱导组细胞集落在胶原内有"出芽式"生长.结论本实验建立了一套骨髓EPCs分离、诱导培养和表型检测的方法;以VEGF和bFGF为主要诱导因子的诱导体系,对骨髓EPCs成内皮细胞的诱导阳性率达35%～40%,经诱导的内皮细胞有希望作为血管组织工程新的种子细胞来源.