pcEgr-hp53辐射诱导表达载体的构建及其体外抗肿瘤的作用

目的构建辐射诱导表达载体pcEgr-hp53，并研究其体外稳定转染联合X射线照射对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用及其凋亡的影响。方法将野生型p53cDNA全长插人pcDNA3．1质粒的多克隆位点，用Egr-1的启动子替代pcDNA3-1质粒的CMV启动子，构建成pcEgr-hp53重组质粒；通过脂质体介导转染法将重组质粒pcEgr-hp53和pcDNA3．1分别转染入SKOV3细胞株，细胞株命名为SKOV3-hp53及SKOV3-vect，并经CA18筛选稳定克隆并扩增培养，两组接受不同剂量X射线照射，观察其对肿瘤细胞生长及其凋亡的影响。结果经限制性内切酶酶切鉴定，辐射诱导表达载体pcEgr-hp53构建正确，稳定转染pcEgr-hp53联合X-射线照射可明显抑制肿瘤细胞的增殖，并诱导肿瘤细胞捅亡。结论本研究成功构建了辐射诱导表达载体DeEgr-hP53，体外基因．放射联合治疗诱导肿瘤细胞凋亡明显增多，具有显著的肿瘤抑制作用。本研究将为提高临床恶性肿瘤放疗疗效奠定了理论和实验基础。     

HRE对A549细胞中Egr-1启动子辐射诱导表达的影响

目的构建乏氧/辐射双敏感启动子介导的增强型绿色荧光蛋白表达载体,探讨HRE对A549细胞中Egr-1启动子在乏氧和常氧条件下辐射诱导表达的影响。方法利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建HRE/Egr-1双敏感启动子介导增强型绿色荧光蛋白的表达载体pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,不同剂量照射和不同浓度乏氧后,流式细胞术检测EGFP的表达,以此反映Egr-1的表达特性。结果酶切、PCR和测序鉴定pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP质粒构建正确。流式细胞术结果显示常氧条件下,不同剂量X射线照射后,A549细胞中EGFP表达在随着时间延长而逐渐增加,2Gy和4 Gy照射后12 h时达到最大,而6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后在8 h时达到最大,而后逐渐降低,与0 h表达比较具有显著性差异(P0.05,P0.01)。0.1%-2.5%的氧浓度条件下,EGFP表达随着氧浓度和剂量的增加而逐渐增加,在1%氧浓度时表达量最大,与常氧条件下不同剂量照射后8 h表达比较具有显著性差异(P0.05,P0.01);在5%-10%氧浓度条件下,EGFP表达与常氧条件下基本一致。结论 HRE具有增强A549细胞中Egr-1启动子诱导表达的特性,对肿瘤基因-放射治疗具有参考意义。     

p14^ARF和p53蛋白表达与脑胶质瘤发生发展的相关性研究

目的：探讨脑胶质瘤中p14^ARF和p53蛋白表达与不同病理级别脑胶质瘤的相关性及两者之间的相互作用。方法：应用免疫组织化学技术检测31例不同病理分级脑胶质瘤中的上述遗传学改变,5例脑挫裂伤脑组织为正常对照。结果：p14^ARF和p53蛋白在低级别（Ⅰ,Ⅱ级）和高级别（Ⅲ,Ⅳ级）脑胶质瘤中的表达阳性率分别为75．00％和30．43％,12．50％和69．57％。两蛋白在低级别和高级别中的表达差异均有显著性（P〈0.05）。p14^ARF表达水平与脑胶质瘤病理分级之间呈显著负相关性（r=0．571,P〈0．01）,即随着肿瘤恶性度的升高而降低。而突变型p53蛋白正相反,与病理分级呈显著正相关性（r=0．472,P≤0．01）,即随着肿瘤恶性度增高而增高。p14^ARF和p53蛋白之间在肿瘤中存在明显的相互作用（P〈0．05）。结论：p14^ARF和p53蛋白表达异常可导致细胞周期调控失常和细胞异常增殖,并且二者之间存在协同作用,可加速脑胶质瘤恶性演进。     

联合转染P53、AS基因对K562细胞增殖的抑制作用

本研究观察联合转染p53、血管生成抑素(angiostattn,AS)基因对人K562细胞的抑制作用,并初步探讨其机制.用脂质体转染法将pVITRO2-hp53-hAS转染K562细胞17天后,以RT-PCR法检测转染后细胞目的基因的表达,通过MTT生长曲线、流式细胞术检测细胞周期来观察细胞生物学改变;用细胞免疫化学观察VEGF、Bcl-2、Bax蛋白表达差异.结果表明转染成功后目的基因在细胞中获得稳定表达,目的基因转染组细胞上升幅度均比空载体转染组细胞低(p＜0.05),且双基因组细胞上升幅度(最后1天的A290 nm值0.264±0.011)比p53组(最后1天的A290 nm值0.652±0.039)和AS组(最后1天的A290 nm值0.604±0.017)低(p＜0.05).转染后,VEGF和Bcl-2蛋白表达减弱,Bax蛋白表达加强.结论联合转染p53和AS基因对K562细胞增殖有较强的抑制作用,且比单独转染组作用强,两者协同作用的机制可能是共同影响bcl-2、bax表达的途径.     

人野生型P53与反义mdm2基因融合体真核表达载体的构建及其在Mc3细胞中的表达

目的构建P^53与反义mdm2 cDNA序列真核表达载体，并探讨其在人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞中的表达。方法应用分子克隆技术，将mdm2 cDNA序列反向插入到含有P^53基因序列pDOR—Neo中的P^53。基因序列下游，构成含有P^53基因与反义mdm2基因融合基因的逆转录病毒表达载体。经酶切分析鉴定后命名为pDOR—Neo—P^53-F mdm2并将重组载体通过脂质体转染Mc3细胞，通过G418筛选转染阳性细胞，并采用Westernblot方法检测P^53蛋白表达。结果酶切鉴定证实重组载体含有P^53与反义mdm2 cDNA片段，实验结果表明：转染后P^53蛋白（1．35±0．14）较对照组P^53蛋白（6．26±0．11）含量显著减低（P〈0．01），转染空载体P^53蛋白（6．24土0．12）与对照组比较无统计学差异（P〉0．05）。结论P^53与反义mdm2基因融合体真核表达载体构建成功，并表达野生型P^53蛋白和封闭mdm2基因，为今后进一步研究打下了基础。     

p27、p53蛋白在口腔鳞癌中的表达和意义

目的 探讨口腔鳞癌中p27与p53基因表达特征和临床病理意义。方法 对38例口腔鳞癌组织采用免疫组化方法检测p27及p53蛋白表达。结果 38例口腔鳞癌中印蛋白阳性表达22例，阳性率57．9％，p53阳性表达21例，阳性率55．3％。p27在鳞癌Ⅰ级中阳性表达17例（68．0％），Ⅱ级中阳性2例（40．0％），Ⅲ-Ⅳ级中阳性3例（37．5％）。p53在鳞癌Ⅰ级病例中阳性10例（40．0％），Ⅱ级中1例（20．0％），Ⅲ，Ⅳ级中7例（87．5％）。结论 p27蛋白阳性表达率随病理恶性程度增高而降低，但无统计学意义。p53蛋白阳性表达率随病理恶性程度升高而增高，提示D53基因与口腔鳞癌细胞分化有相关性。p27和p53表达在鳞癌中呈负相关。     

野生型p53基因可以增强胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性研究

目的评价野生型p53基因过表达的胶质瘤细胞对替莫唑胺和X射线敏感性的研究。方法利用脂质体转染试剂将pcDNA3.1(+)p53质粒转染入胶质瘤细胞中,检测转染效率后,给予替莫唑胺和X射线处理,并检测凋亡。结果野生型p53蛋白可以明显增加胶质瘤细胞对射线及替莫唑胺的凋亡率,且相对于X射线而言,p53蛋白更能促进替莫唑胺对胶质瘤细胞的凋亡作用(P<0.01)。结论替莫唑胺可能通过p53介导的凋亡通路调控了胶质瘤细胞的凋亡。     

良恶性胃黏膜中p21ras、表皮生长因子受体和p53蛋白的表达及意义

目的研究p21^ras、表皮生长因子受体（EGFR）和p53突变蛋白在良恶性胃黏膜组织中的表达及其对胃癌早期诊断的意义。方法应用免疫组织化学方法对31例胃癌、49例癌前病变、21例萎缩性胃炎和28例正常胃黏膜组织中的p21^ras、EGFR和p53突变蛋白的表达进行检测。结果31例胃癌组中,p21^ras、EGFR和p53突变蛋白的阳性表达率分别为64．5％、54．8％和32．3％;49例癌前病变组中,p21^ras、EGFR和p53突变蛋白的阳性表达率分别为59．2％、53．1％和22．4％;癌前病变组和胃癌组间3种基因蛋白的阳性表达率差异均无显著性（均为P〉0．05）,但均显著高于正常胃黏膜组（P〈0．05或P〈0．01）。结论胃癌和癌前病变胃黏膜组织中存在多种基因的表达异常,检测胃黏膜中p21^ras、EGFR和p53蛋白对胃癌早期诊断的意义不大。     

胃球样异型增生细胞周期素和p21^WAF1、p53蛋白表达的组织芯片观察

目的：使用组织芯片探讨cyclin A、cyclin D1．cyclin E和p21^WAF1、p53蛋白在胃球样异型增生中表达的意义。方法：采用微波修复免疫组织化学S-P法和组织芯片技术，检测cyclinA、cyclinD1、cyclinE和p21^WAF1、p53蛋白在41例正常胃黏膜、86例低级别异型增生胃黏膜、21例高级别异型增生胃黏膜和124例胃癌组织中的表达，并进行比较分析。结果：cyclinA、cyclinD1、cyclinE和p53蛋白的表达由正常胃黏膜、轻度球样异型增生、重度球样异型增生到癌阳性率逐渐增高，cyclinA、cyclinD1和p53在重度球样异型增生与胃癌中的表达无显著差异（X^2=3．08．X^2=2．18．X^2=0．80，P〉0．05），与正常胃黏膜有显著差异（X^2=12．26，X^2=11．29，X^2=19．89，P〈0．01）。重度球样异型增生中p21^WAF1蛋白的表达比正常胃黏膜为低，差异有显著性（X^2=5．32，P〈0．05），与胃癌比较差异无显著性（X^2=1．39，P〉0．05）。cyclinD1与p21^WAF1的表达呈负相关（rs=-0．5326，P〈0．01）。结论：重度胃球样异型增生cyclinA、cyclinDl、cyclinE呈高表达，p21^WAF1蛋白失表达，显示与胃癌的发生关系密切。     

环氧化酶-2RNA干扰对肺癌A549细胞凋亡及caspase家族的影响

目的观察环氧化酶-2（COX-2）RNA干扰对肺癌细胞凋亡的影响,以及对凋亡调控蛋白caspase-8、caspase-9、caspase-3的调控作用。方法构建COX-2特异性干扰质粒,并转染至肺癌A549细胞株中,AnnexinV-FITC／PI联合流式细胞仪检测细胞凋亡,Western Blot检测caspase-8、caspase-9、caspase-3的活性。结果成功构建COX-2特异性干扰质粒并转染至肺癌A549细胞株中,获得抑制COX-2表达的肺癌细胞模型;干扰COX-2的A549细胞凋亡率[（24．3±2．46）％]较未干扰组[（6．52±0．13）％]明显升高（P〈0．01）。干扰COX-2的肺癌细胞．4549caspase．8蛋白表达（0．86±0．09）较未干扰组（0．12±0．01）明显升高（P〈0．01）,caspase-3蛋白表达（0．94±0．09）较未干扰组（0．16±0．02）明显升高（P〈0．01）,caspase-9蛋白表达（1．12±0．11）较未干扰组（0．13±0．01）明显升高（P〈0．01）。结论干扰COX-2可以促进肺癌A549细胞的凋亡,并且活化caspase-8及caspase-9,从而活化caspase-3。     

DNA-PK基因沉默对卵巢癌细胞细胞凋亡的影响

目的 探讨DNA-PK基因对沉默卵巢癌细胞凋亡的影响及机制.方法 DNA-PK shRNA以脂质体介导转染卵巢癌细胞株Skov3,24h后接受2Gy X射线照射,继续培养48 h.收集细胞,标记Annexin Ⅴ/PI,流式细胞术分析细胞凋亡情况,同时,RT-PCR检测p53和p21 mRNA的表达量.结果 2Gy辐射引起2.40％±1.53％ Skov3细胞凋亡,高于对照组（t=2.618,P=0.026）,而转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,凋亡细胞为18.74％±4.15％,明显高于单纯2Gy照射组（t=9.052,P＜0.001）及DNA-PK shRNA转染组（2.77％±1.73％）（t=8.869,P＜0.001）.RT-PCR检测结果显示,2Gy照射组,Skov3细胞p53 mRNA表达量高于对照组,而DNA-PKshRNA转染的Skov3细胞接受2Gy照射,其p53 mRNA表达量降低,接近正常水平,单独转染DNA-PK shRNA组p53 mRNA表达量无明显变化.转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,其p21 mRNA表达量低于2Gy照射组接近正常组水平,单独转染DNA-PK shRNA组Skov3细胞p21 mRNA表达水平与正常对照组相当.结论 DNA-PK shRNA可增加辐射后巢癌细胞株的细胞凋亡,其可能机制是通过下调p53和p21 mRNA表达,而启动细胞凋亡.     

鼻咽癌放射敏感性自杀基因载体的构建

[目的]拟构建一个新型的具有放射敏感性和肿瘤特异性的鼻咽癌基因治疗载体,利用其双重协同杀伤作用以提高特异杀伤肿瘤效应.[方法]采用PCR方法扩增早期生长反应因子1（Egr-1）启动子、胞嘧啶脱胺酶（CD）自杀基因、人端粒酶亚基（hTERT）启动子、凋亡抑制因子存活素（Survivin）反义寡核苷酸链;通过酶切连接分别构建成pcDNA3.1-Egr-CD（简写为pEC）、pcDNA3.1-hTERT-Survivin（简写为pTS）、pcDNA3.1- Egr-CD- hTERT-Survivin（简写为pEC-TS） 真核表达载体.[结果]酶切证实pEC、pTS、pEC-TS真核表达载体构建成功.[结论]通过成功构建这一新型载体有可能为鼻咽癌基因治疗提供科学依据和技术支持,为鼻咽癌综合治疗开拓一条新的途径.     

碱性成纤维细胞生长因子荧光真核表达载体构建及对过氧化氢诱导血管内皮细胞凋亡的影响

背景：已证实外源性碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）可抑制血管内皮细胞凋亡。目的：构建表达bFGF的荧光真核表达载体,探讨其对过氧化氢（H2O2）诱导的血管内皮细胞凋亡和凋亡相关蛋白的影响。方法：通过基因亚克隆构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,利用脂质体介导将bFGF基因导入人脐静脉内皮细胞内,通过荧光观察和RT-PCR检测基因的表达。实验分为3组,对照组（转染pcDNA3.1）、过氧化氢组（转染pcDNA3.1＋H2O2）和bFGF转染＋过氧化氢组（转染pcDNA3.1-bFGF-GFP＋H2O2）,流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测caspase-3 P17活性亚单位和Bax蛋白表达。结果与结论：成功构建荧光真核表达载体pcDNA3.1-bFGF-GFP,该载体转染人脐静脉内皮细胞后,bFGF mRNA显著增加,并可观察到绿色荧光。与对照组相比,过氧化氢组细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量都明显增加（P〈0.01）,而bFGF转染＋过氧化氢组的细胞凋亡率和caspase-3 P17活性亚单位、Bax蛋白的表达量则比过氧化氢组显著降低（P〈0.01）。证实bFGF基因转染能抑制过氧化氢诱导的血管内皮细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bax蛋白表达和caspase-3活性有关。     

HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac 对人食管癌细胞 Eca109周期和凋亡的影响

目的：探讨以 HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac（CARd．pE-Smac）对人食管癌细胞 Eca109周期和凋亡的影响。方法利用氯化钴进行化学乏氧,病毒感染滴度为5 MOI [Multiplicity of infec-tion （virus/cell）]感染人食管癌 Eca109细胞24 h,并进行2 Gy 照射,12 h 后分别利用 Western blotting 检测 Smac 蛋白的表达,PI 染色和 AnnexinⅤ-FITC 双染,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡变化。实验分为 control、CARd．pE-Smac、hypoxia、2 Gy、H＋CARd．pE-Smac、CARd．pE-Smac＋2 Gy 和 H＋CARd．pE-Smac＋2 Gy 组。结果CARd． pE-Smac 感染常氧和乏氧的 Eca109细胞后均未见 Smac 蛋白表达增加,而2 Gy 照射后,常氧、感染 CARd．pE-Smac和乏氧再感染 CARd．pE-Smac 均能使 Smac 蛋白表达增加,尤其以三者联用后 Smac 表达增加最大;感染 CARd．pE-Smac 未对细胞周期有明显改变,而乏氧、2 Gy 和感染 CARd．pE-Smac 任二者（乏氧与2 Gy 除外）或者三者联用均能显著增加 S 期和 G2/M 期细胞百分比增加（P ＜0．05,P ＜0．01）,尤其以三者联用作用更强;而且,对于细胞凋亡的诱导作用与周期进程变化的规律相类似。结论HRE 和 hTERT 修饰条件复制型腺病毒携带 Egr-1介导的 Smac 在人食管癌细胞 Eca109中显著过表达,且能够导致细胞发生 S 期延迟和 G2/M 期阻滞,并诱导细胞发生凋亡。     

高能X射线对肺腺癌A549细胞ERCC1表达的影响

目的检测高能X射线对肺腺癌A549细胞与顺铂耐药相关的基因——切除修复交叉互补基因1（ERCC1）表达的影响。方法对A549细胞进行X射线照射,总剂量10 Gy/（5 d.5f）。利用RT-PCR检测照射前及照射开始后第1~4周细胞的ERCC1基因的表达;免疫组织化学SABC法检测照射前后细胞ERCC1蛋白的表达。结果照射后第1~3周A549细胞ERCC1 mRNA及蛋白的表达水平比照射前显著升高,差异有显著性（F=152.00、26.63,q=6.03~28.31,P〈0.01）。结论肺腺癌A549细胞照射后可能出现顺铂耐药。     

ki-67、p53在基底细胞样乳腺癌中的表达及意义

目的探讨p53、Ki-67蛋白在基底细胞样型乳腺癌的表达对患者预后判断的价值。方法根据免疫组化染色结果[ER(-)、HER2(-)且CK5/6(+)或CK14(+)或SMA(+)]选出基底细胞样乳腺癌病例48例,随机选择41例非基底细胞样型浸润性乳腺导管癌病例作为对照组,用免疫组化SP法检测p53、Ki-67在二者的表达。结果p53、Ki-67在基底细胞样乳腺癌的表达阳性率分别为70.83%、93.75%,对照组的表达阳性率分别为50.0%、68.75%,Ki-67的表达在两组间差异有统计学意义(P<0.01),而p53的表达在两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论细胞增值抗原Ki-67是更适宜判断基底细胞样型乳腺癌预后的免疫组化指标。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

放射性药物与Egr-Endostatin重组质粒的协同抑瘤作用

目的探讨Egr-内皮抑素基因联合放射性药物-胶体32P对于大鼠肝癌的抑制效果。方法经局部引入基因重组质粒及胶体32P后于,7 d1、4 d2、1 d分别测肝癌的生长率,第21d测定肝癌微血管密度(MVD)、肿瘤细胞凋亡指数(AI)等指标的变化。结果各干预组的肿瘤体积生长率、MVD、AI与对照组指标相比均具有统计学差异,P均0.05-0.01,在所有干预组中,32P+Egr-Endostatin组的抑瘤效果最好,P均0.05-0.01。肝癌生长率方面,第7 d-14d,32P干预组与单纯内皮抑素基因组、Egr-内皮抑素基因组相比抑瘤效果相近,P0.05;但到达21 d时,胶体32P干预组治疗效果则明显下降。基因联合胶体32P的干预组效果均好于其它干预组,P0.05-0.01。MVD方面,32P组与其它干预组比较具有统计学差异,P0.01。AI指标,其他干预组与32P组比较具有差异,P0.05。结论 32P联合Egr-Endostatin基因协同抑瘤,可以发挥放射性药物的照射作用,Eg-1的辐射诱导增强作用及Endostatin基因的抑制肿瘤新生血管的三重作用,疗效最为确切。