人胎盘源间充质干细胞对T细胞周期及其活化的抑制作用研究

目的 探讨人胎盘源间充质干细胞(hPMSCs)对T细胞增殖抑制作用机制,为其在临床细胞治疗中的应用提供理论依据.方法 应用消化法分离、培养hPMSCs,体外扩增培养3代后用于实验.应用流式细胞术分析hPMSCs对PHA激发下T细胞周期和早期表型CD25、CD69表达的影响,ELISA法检测细胞因子水平.结果 hPMSCs体外可使PHA刺激下的T细胞滞留于细胞周期的G0/G1期,下调活化T细胞早期表型CD25、CD69的表达,抑制IL-2、IFN-r的分泌.结论 hPMSCs体外可通过对T细胞周期的影响抑制其活化和增殖.     

小鼠脾脏间充质干细胞调节T淋巴细胞的增殖与活化

目的研究小鼠脾脏间充质干细胞(Sp-MSCs)对T淋巴细胞增殖与活化的调节作用。方法采用组织块法从小鼠脾脏中分离培养出Sp-MSCs,并做多向诱导分化实验。分离小鼠T淋巴细胞,开展淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应,分别检测Sp-MSCs对于非特异抗原和同种异体抗原活化的T淋巴细胞的影响。以CFSE流式法检测Sp-MSCs对活化的T淋巴细胞增殖的影响。采用定量PCR分析Sp-MSCs对T淋巴细胞表达的炎性细胞因子的影响。结果流式检测结果显示Sp-MSs C可以抑制非特异抗原和同种异体抗原引起的T淋巴细胞增殖。Sp-MSCs能够有效抑制淋巴细胞转化试验和混合淋巴细胞反应引起的细胞活化。进一步分析发现,Sp-MSCs抑制T淋巴细胞表达干扰素γ,肿瘤坏死因子α和白细胞介素17A。结论 Sp-MSCs能够抑制T淋巴细胞增殖与活化,抑制T淋巴细胞表达多种炎性细胞因子。     

胎盘间充质干细胞研究进展

间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）作为一种人体干细胞来源,越来越多地用于临床,其中,骨髓MSC应用更为广泛。     

干细胞因子对骨髓间充质干细胞定向迁移的影响

目的 初步探讨干细胞因子对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stemcells,BMSCs)定向迁移的影响.方法 密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代.利用KT-PCR方法检测BMSCs对干细胞因子受体c-kit的表达,使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,评估干细胞因子对BMSCs定向迁移的影响以及p38丝裂原活化蛋白激酶通路(p38MAPK)抑制剂SB203580对干细胞因子诱导BMSCs迁移能力变化的影响.结果 通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的MSCs.RT-PCR证实BMSCs表达c-kit;干细胞因子可趋化体外模型中BMSCs通过聚碳酸酯膜向下室内迁移,在0～50ng/mL浓度范围内迁移细胞数量随干细胞因子的浓度增加而增加.加入SB203580后干细胞因子诱导的BMSCs迁移受到抑制.结论 干细胞因子可以趋化BMSCs发生定向迁移,这一迁移过程的细胞内信号转导与p38MAPK通路有关.     

氧浓度对人胎盘间充质干细胞生物学特性的影响

[摘要]　目的　比较不同氧浓度对人胎盘间充质干细胞生物学特性的影响。　方法　组织块培养法分离人胎盘间充质干细胞pMSCs,并利用流式细胞技术进行表面标志鉴定。将第3代pMSCs分别培养于常氧（21%O2）及不同浓度的低氧（5%O2、3%O2、1%O2、0.5%O2）环境中,观察各组细胞形态,MTT检测细胞增殖情况,划痕实验检测细胞迁移能力,ELISA检测细胞VEGF分泌表达量情况。　结果　成功从人胎盘组织分离出间充质干细胞pMSCs,阳性表达CD29、CD44,阴性表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR。低氧培养的pMSCs形态均一,细胞伸展为长梭形,漩涡状排列明显。与常氧组相比,一定范围内低氧（5%O2~1%O2） 培养的pMSCs增殖、迁移增快,分泌VEGF增多,氧浓度越低,变化越明显。过低氧浓度（0.5%O2）培养的pMSCs增殖减慢,分泌VEGF减少。 　结论　一定范围内的低氧可促进pMSCs增殖、迁移及分泌VEGF,氧浓度越低,促进作用越明显。而过低氧浓度则产生抑制作用。     

心肌微环境对胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的 观察心肌微环境对胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells,hPDMSCs)向心肌细胞分化的影响.方法 用心肌细胞培养上清液模拟心肌微环境诱导hPDMSCs向心肌细胞分化,同时设置20％DMEM培养的对照组.每天于显微镜下观察细胞形态学变化,每两天台盼蓝拒染法计数细胞,免疫组织化学法检测α-横纹肌肌动蛋白的表达,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达,RT-PCR法检测心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)、β-肌球蛋白重链(beta-myocin heavy chain,β-MHC)mRNA的表达.结果 对照组细胞保持较快的增殖速度,不表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC;心肌细胞培养上清液模拟的心肌微环境组细胞增殖速度较慢,表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC.结论 心肌微环境能够诱导hPDMSCs向心肌细胞分化.     

胎盘间充质干细胞样细胞的培养及生物学特性的实验研究

目的本研究拟从胎盘组织中分离培养获得间充质干细胞(placenta derived mesenchymal stem cells, PMSCs),研究其生物学特性,探讨其在移植治疗方面的可行性.方法将胎盘组织经胶原酶消化和贴壁培养获得的基质细胞,用免疫荧光标记和免疫细胞化学检测细胞表型,用活细胞记数和碘化丙啶(propidium iodide,PI)检测其增殖能力,用叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole ,BHA)、N2培养基等对培养的细胞分别向神经和脂肪方向诱导分化,继而采用免疫细胞化学等方法对分化的细胞进行鉴定.结果由胎盘组织中分离获得了一群具有与骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)相似的形态和细胞表面标志的细胞:该群细胞增殖能力强;表达CD29、 CD44、CD105 (SH2)、ASMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原以及免疫应答负性调控分子PDL-1,但不表达CD11b、 CD34、CD45、CD19、CD106 (VCAM-1)、CD117、HLA-DR、vWF、MySM、HLA-DR,以及免疫应答正性调控分子CD40、CD40L、CD28、CD80和CD86;可诱导表达神经元标志神经微丝(neurofilament,NF)和星型胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein,GFAP),并且这些细胞表达神经干细胞标志巢蛋白(nestin),向脂肪分化的细胞苏丹Ⅲ染色阳性.结论本实验中获得的胎盘基质细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志和多向分化潜能的特点,它增殖能力强、来源方便、丰富,无伦理学限制,是良好的细胞移植来源.     

间充质干细胞介导白细胞介素因子调节免疫反应的机制研究

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,具有强大的免疫调控作用。目前大多数研究认为干细胞的分泌功能是其发挥免疫调节能力的主要途径。白细胞介素是一种在细胞间传递信息、激活与调节免疫细胞的淋巴因子,亦是间充质干细胞分泌的主要细胞因子之一,参与多种炎性、免疫性疾病的发生与发展,在机体免疫调节中起重要作用。间充质干细胞通过介导白细胞介素,进一步激活与调节免疫细胞,调控其增殖、活化、分化及分泌等多种生物进程,现将间充质干细胞介导白细胞介素调节免疫反应的相关机制做一综述。     

间充质干细胞在人胎盘组织中的染色定位

目的探索间充质干细胞(MSCs)在人胎盘组织中的分布规律。方法取正常剖宫产之足月健康产妇的新鲜胎盘组织,按中央带、中间带、边缘带、绒毛板层、中间层和基底板层分为9组:Aa、Ab、Ac、Ba、Bb、Bc、Ca、Cb、Cc。连续切片,以抗CD166、抗CD44、抗CD29分别做免疫荧光和免疫组化染色。显微镜下观察阳性细胞分布区域,采用HPIAS-1000彩色病理图像分析系统进行图像分析。结果CD166、CD44、CD29阳性表达细胞的分布情况较一致,主要集中于血管内皮下及血管附近间质内。胎盘中央带中间层(Ab)阳性细胞较集中,阳性表达的强度较强,其OD值与其它组差异有统计学意义(P<0.05)。边缘带阳性细胞稀少,阳性表达的强度较弱。结论胎盘各部位均存在CD166、CD44、CD29阳性表达的细胞,但脐带附着处下方胎盘中间层相对其他部位可能为MSCs富集区域。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

人胎盘源间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化的实验研究

目的 从胎盘组织中分离获得人胎盘源间充质干细胞(PMSCs).并诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化,为PMSCs应用于组织工程和细胞治疗提供实验依据.方法 将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁和传代培养获得PMSCs,流式细胞仪检测其表面标志,分别联合应用β-甘油磷酸钠、维生素C、地塞米松体系和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、吲哚美辛、地塞米松体系将其诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞,继而采用碱性磷酸酶检测和Von kossa染色对其进行成骨分化鉴定,采用油红O染色对其进行脂肪分化鉴定.结果 从人胎盘中成功分离获得了PMSCs,形态呈纤维状,细胞增殖能力强;流式细胞仪分析显示PMSCs表达CD29、CD44、CD105、CD106和CD166,不表达CD34、CD45、HLA-DR:人PMSCs经成骨诱导2周后,碱性磷酸酶染色呈强阳性,Von kossa染色可见明显钙结节;人PMSCs经成脂诱导3周后,油红O染色呈阳性,有明显的脂滴出现.结论 建立了有效分离、培养人PMSCs的实验体系,并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化,表明PMSCs可作为新型来源的种子细胞应用于组织工程.     

人羊膜间充质干细胞抑制异体淋巴细胞增殖的实验研究

目的研究人羊膜间充质干细胞分离培养及免疫调节作用。方法从羊膜中分离和培养间充质干细胞,并通过形态学的结构特征及流式细胞术检测其表面标志以鉴定其纯度。建立双向混合淋巴细胞反应体系,根据不同效靶比E/T（hAMSCs/PBMC）加入丝裂霉素处理过的羊膜细胞,用3H掺入法测定淋巴细胞增殖率,观察间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。结果从羊膜组织成功培养出间充质干细胞,细胞贴壁生长,在体外短期内可以稳定增殖和传代,细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表面标志,与混合淋巴细胞反应体系共同培养抑制了淋巴细胞增殖,其增殖抑制率与加入的细胞数量成正比。结论羊膜间充质干细胞可以抑制混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖,对同种异体免疫反应具有负调节作用。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单核源树突状细胞体外成熟的调节作用

目的探讨人胎盘源间充质干细胞（PMSCs）对单核源树突状细胞（mono-DCs）体外成熟的影响。方法采用密度梯度离心法分离人脐血单核细胞,在人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）和人白细胞介素-4（hIL-4）刺激下获得大量未成熟DCs。将DCs和PMSCs共培养4 d,同时加入LPS刺激,分别通过倒置显微镜、流式细胞仪和混合淋巴反应（MLR）检测DCs的成熟。结果共培养DCs呈散在分布,细胞边缘圆滑;与成熟DCs相比,其表面CD80、CD86、CD83、CD40的表达明显较低,而CD14的表达较高;共培养组DCs刺激同种异型淋巴细胞增殖的能力在各个浓度均明显低于对照组（均P〈0.05）。结论 PMSCs可以明显抑制脐血单核源DCs的体外成熟。     

人羊膜间充质干细胞的分离与鉴定

目的：探讨从人胎盘组织中分离羊膜间充质干细胞（hAMSCs）。方法：收集剖宫产足月胎儿胎盘,采用组织块贴壁法分离出羊膜问充质干细胞并传代培养,对P1-P3代细胞进行细胞形态的观察,用流式细胞仪检测细胞膜表面阳性分子CD73．APC、CD90-FITC、CIM4．PE、CDl05．Cy5．5和阴性分子CDllb-PE、CDl9．PE、CD34-PE、CD45-PE、HLA-DR-PE,并采用六孔板法检测细胞增殖情况。结果：hAMSCs的细胞形态呈成纤维状,hAMSCs在培养3-d达到对数增长期,通过流式检测,发现细胞可表达CD73、CD90、CD44和CDl05,未表达CDllb、CDl9、CD34,CD45、HLA-DR。结论：从体外成功分离培养出人羊膜间充质干细胞。     

人胎盘源间充质干细胞对脐血单个核细胞体外生长的支持作用

目的探讨人胎盘源问充质干细胞（PMSCs）对脐血单个核细胞（MNCs）体外生长的支持作用。方法将人胎盘组织经胶原酶消化、贴壁培养获得人PMSCs，用流式细胞仪检测细胞表面标志。以密度梯度离心法分离脐血MNCs和传代后的PMSCs进行共培养，通过细胞计数和流式细胞仪分别检测细胞的生长情况。结果从人胎盘组织中成功分离和培养PMSCs，经流式细胞仪检测其表型为CD29^＋,CD44^＋,CD105^＋、CD106^＋、CD166^＋、CD34^-,CD45^-、HLA—DR^-。人PMSCs＋脐血MNCs共培养组的细胞总数和CD45^＋细胞数在各培养时间点均明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。在培养第7天，CD45^＋、CD14^＋及CD19^＋细胞数共培养组也明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05或P〈0．01）。结论人PMSCs可以作为滋养层细胞有效支持脐血MNCs的体外生长。     

骨髓和脐血间质干细胞联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症269例疗效研究

目的 观察骨髓间质干细胞(BMSCs)和脐血间质干细胞(CMSCs)联合移植治疗杜氏型进行性肌营养不良症(DMD)的临床疗效.方法 2007年6月-2009年3月对269例DMD患者行自体BMSCs和CMSCs联合移植方案进行治疗,患者均使用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF),5～10 μg/kg,2次/d,皮下注射动员骨髓干细胞4 d,于第5天行骨髓采集术,局部麻醉下从髂后上棘抽取骨髓100～180 ml.将采集的骨髓液经Ficoll密度梯度离心后,分离单个核细胞2.0×109,用Uitra cul Ture 培养液调节细胞数量为1×105/ml～1×106/ml,接种于75 mm2培养瓶中,24 h换液,7～10 d后收集全部细胞,总数为4.0×108/ml～1.5×109/ml.将BMSCs移植到患者四肢近端肌肉内.采集脐血80～160 ml,Ficoll密度梯度离心,分离单个核细胞并诱导分化为CMSCs.将CMSC(1.0～4.8)×107细胞悬液,经静脉缓慢输注,每5～7 d 1次,共3次.移植后6个月对患者的肌力、步行10 m和推轮椅10 m所需时间、肌酸激酶水平、肌电图等进行观察.结果 269例患者移植后6个月时随访,218例患者(81.0%)肌力有不同程度的增加.干细胞移植后235例患者复查心肌酶谱,其中188例(80%)患者步行10 m及推轮椅10 m所需时间明显缩短,与移植前比较差异有统计学意义(P<0.05),干细胞移植后患者肌酸激酶水平较移植前明显下降(P<0.01).51例患者复查肌电图,32例(62.7%)患者波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.47例患者复查大腿肌肉磁共振成像,肌肉影像较移植前变化不明显.结论 BMSCs和CMSCs移植治疗DMD,对肌肉组织有一定的修复作用,使DMD患者的运动功能得到改善,肌力有所提高,肌酸激酶较移植前下降.移植后复查肌电图波幅不同程度增高,运动单位增多,多相波减少.MSCs移植无不良反应,患者依从性好,是治疗DMD的新手段.     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者T细胞相关因子调节的体外研究

目的体外观察人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者和正常对照T细胞相关细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17、IL-6的调节作用.方法采用组织块培养法从脐带分离、培养间充质干细胞.用流式细胞术鉴定脐带间充质干细胞的表型.分离再生障碍性贫血患者和正常对照外周血单个核细胞与脐带间充质干细胞共培养.用ELISA法测定外周血单个核细胞组和共培养组培养上清中细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-17和IL-6的水平.结果脐带来源间充质干细胞高表达CD29、CD44、CD105、HLA-I.人脐带间充质干细胞与再生障碍性贫血患者外周血单个核细胞共培养后上清中IL-2水平无明显变化（P〉0.05）而IFN-γ水平有所下降（P〉0.05）,IL-17水平和IL-6水平明显上升（P〈0.01）.人脐带间充质干细胞与正常对照外周血单个核细胞共培养后上清中IL-2和IFN-γ水平明显下降（P〈0.05）而IL-17水平无明显变化（P〉0.05）,IL-6水平明显上升（P〈0.01）.结论人脐带间充质干细胞明显可抑制正常外周血单个核细胞分泌IL-2、IFN-γ,其与外周血单个核细胞共培养后可升高IL-6水平.     

人骨髓间充质干细胞的培养及研究

目的　了解间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的培养条件、生物特性及分化能力。方法　抽取健康成人骨髓,利用密度梯度离心分离培养人MSC,并用流式细胞仪检测细胞表面标记,体外诱导MSC向成骨细胞分化。结果　成功地进行了人MSC的原代和传代培养;MSC CD34、CD45、HLA DR、CD62p等为阴性,CD29、CD44、CD166、CD90 等为阳性;MSC能够分化为成骨细胞。结论　人骨髓MSC在体外有较强的扩增能力,并能够向成骨细胞分化。     

应用EBM-2培养犬脐血间充质干细胞的实验研究

目的应用EBM-2培养犬脐血间充质干细胞(MSC),为MSC的研究提供新的细胞培养方法。方法取犬的脐血,分为四组进行细胞培养。第1组用EBM-2培养;第2组用添加有EGM-2MV的EBM-2在6孔板上培养。第3组用添加有EGM-2MV的EBM-2在纤连蛋白包被的6孔板上培养。第4组用添加有EGM-2MV的EBM-2在25cm2细胞培养瓶中培养。应用免疫组化法检测细胞抗原CD11a、CD11b、CD34、CD29及CD71的表达。结果各组均有纤维母细胞样细胞培养出。第1组细胞形态不良,增殖缓慢;第2组细胞增殖旺盛;第3组细胞克隆不稳定,容易老化;同时出现另一种细胞克隆。第4组细胞培养的结果与第3组相似。免疫组化法检测抗原显示:CD11a(-)、CD11b(-)、CD34(-)、CD29( )、CD71( )。结论在不用纤连蛋白包被的6孔板上,用添加有EGM-2MV的EBM-2细胞培养液可以培养出生长良好、增殖旺盛的MSC。