APOBEC3G真核表达载体的构建及其对HBV复制表达的影响

目的:构建APOBEC3G真核表达载体,在体外初步探讨APOBEC3G对HBV复制表达的影响。方法:应用RT-PCR法从人PBMC细胞中扩增APOBEC3G基因,分子克隆法构建表达APOBEC3G蛋白的真核表达载体pcDNA3.1-APOBEC3G,并脂质体法转染HepG22.2.15细胞。Western-blot鉴定细胞中APOBEC3G蛋白的表达。ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg水平,实时定量PCR检测HBVDNA和HBV mRNA水平。结果:经酶切鉴定及测序证实APOBEC3G真核表达载体被成功构建,APOBEC3G蛋白可在HepG22.2.15细胞中表达。转染APOBEC3G重组质粒的HepG22.2.15细胞的HBsAg、HBeAg、HBVDNA及HBV mRNA水平均明显低于未转染重组质粒的HepG22.2.15细胞。结论:APOBEC3G明显抑制了HepG22.2.15细胞中HBV的复制与表达,成功构建APOBEC3G真核表达载体,为深入研究APOBEC3G抗HBV的作用机制奠定实验基础。     

表达A3C的HBV载体质粒抑制HBV的研究

目的 观察表达人类载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3C(A3C)的复制缺损型HBV载体质粒抑制乙型肝炎病毒(HBV)的作用.方法 利用PCR技术和基因重组方法构建表达A3C和人绿色荧光蛋白(hrGFP)的FIBV载体质粒pcH-LJ3-A3C、pCH-LJ3-hrGFP.分别与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞,提取细胞裂解液及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA进行Southern blot检测;提取细胞裂解液中核心蛋白相关的HBV DNA,PCR扩增,克隆,测序.结果 pCH-LJ3-A3C对细胞浆及细胞培养上清液中病毒颗粒DNA具有抑制作用,使细胞浆内HBV DNA减少31%,使上清液中子代病毒颗粒HBV DNA减少40%;对HBV DNA具有编辑作用,50个克隆测定HBV DNA序列,36克隆出现G-A突变,G-A突变总数量982位点.结论 pCH-LJ3-A3C可以抑制HBV复制,pCH-LJ3-A3C对HBV DNA的编辑作用是其发挥作用的主要原因,pCH-LJ3-A3C可以作为一种新型的抗病毒制剂治疗HBV感染.

Abstract：

Objective To observe the inhibitory effect of a replication-defective hepatitis B virus (HBV) vector plasmid expressing A3C on HBV replication in vitro. Methods The HBV vector plasmisd pCH-LJ3-A3C and pCH-LJ3-hrGFP expressing A3C and hrGFP were constructed using PCR and gene recombination technique. The two recombinant plasmids were separately cotranfected into HepG2 cells along with the wild-type HBV plasmid pCH-3093. The HBV DNA in the cell cytoplasmic lysates and in the cell culture supernatant was extracted for Southern blotting, and the nucleocapsid-associated HBV DNA were amplified by PCR, cloned and sequenced. Results pCH-LJ3-A3C showed obvious inhibitory effect on HBV DNA in the cytoplasmic lysates and cell culture supernatant, causing a reduction of the HBV DNA by 31% and 40%, respectively. The pCH-LJ3-A3C plasmid was capable of editing the HBV DNA. Among the 50 sequenced clones, 36 clones had G-A mutations, with a total of 982 such mutations. Conclusion pCH-LJ3-A3C can inhibit the replication of HBV primarily by editing HBV DNA. The pCH-LJ3-A3C plasmid may serve as a new antiviral agent against human HBV infection.     

HBV全基因真核表达载体的构建及表达

目的：为诱导HBV特异性CTL，构建HBV全基因真核表达载体，并对其在细胞中的表达进行了初步研究。方法：以EcoRⅠ酶切pBR322-2HBV和pcDNA3，回收完整的HBV基因片段及线性化的载体pcDNA3，T4 DNA连接酶连接HBV和pcDNA3，转化、筛选，酶切鉴定HBV的插入方向。以脂质体将构建的pcDNA3-HBV转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，ELISA检测细胞培养上清中HBsAg、HBeAg的表达，RT-PCR检测转染细胞中PreSl mRNA的表达。结果：经酶切鉴定获得正向插入的pcDNA3-HBV，转染HepG2后，建立了新的肝癌细胞系HepG2．02G，细胞培养上清中可检测到高水平的HBsAg，PreSl mRNA在转染细胞中表达。结论：经体外重组，获得携带全长HBV基因片段的pcDNA3-HBV表达载体，并可在肝癌细胞中稳定表达。     

HBV C区基因真核表达载体的构建及转染

目的构建含乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)增强子Ⅱ(enhancerⅡ,EnhⅡ)、核心启动子区(basal core promoter,BCP)和C区基因的真核表达载体,以研究EnhⅡ、BCP和C区基因的生物功能。方法提取HBV DNA,PCR法扩增EnhⅡ-BCP-C区基因片段;HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCR产物,胶回收纯化的DNA片段,连接入载体pBudCE4.1,酶切及DNA测序鉴定重组载体。采用脂质体介导的方法将重组载体DNA转染HepG2细胞和HeLa细胞,酶联免疫吸附试验检测重组载体转染的HepG2细胞、HeLa细胞上清液及细胞裂解物中乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)的表达水平。结果双酶切及DNA测序鉴定,含840 bp HBV EnhⅡ-BCP-C区基因片段的重组载体构建成功。EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HepG2细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后裂解物中HBeAg表达水平均明显高于pBudCE4.1空载体转染HepG2细胞(均P<0.05),EnhⅡ+BCP+C/pBudCE4.1重组载体转染HeLa细胞24、48 h后的上清液和转染48 h后的裂解物中HBeAg表达水平与pBudCE4.1空载体转染HeLa细胞比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论成功构建HBV EnhⅡ-BCP启动-C基因肝细胞特异表达的真核载体,有利于进一步研究EnhⅡ、BCP和C区基因某些突变位点的生物学意义。     

APOBEC3G基因多态性与慢性乙型肝炎易感性的关系

目的探讨载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽3G（APOBEC3G）基因rs185983011位点在人群中的多态性分布,并研究其
与慢性乙型肝炎易感性的关系。方法分别收集186例HBsAg和HBeAg皆阴性的健康者、159例慢性乙型肝炎患者的血液样
本。应用Sanger测序方法检测该研究对象APOBEC3G基因rs185983011位点的多态性,确定其基因型及等位基因分布情况。
并将该位点的多态性与慢性乙型肝炎的易感性之间的关系进行统计学分析。结果SNP rs185983011位点存在于检测人群中的
基因型只有C/C和C/T,其中以C/C为主（97.7%）。SNP rs185983011位点的基因型频率和等位基因频率在慢性乙型肝炎患者组
和健康者组中的分布无统计学差异（P>0.05）。结论研究人群APOBEC3G基因中rs185983011位点的基因型主要是C/C,未发
现该位点的多态性与慢性乙型肝炎易感性存在相关性。
     

APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用

目的研究细胞内在抗病毒因子APOBEC3G对HIV-1及其Vif缺失株的抑制作用。方法 HIV-1野生株病毒(BH10WT)和Vif缺失株病毒(BH10ΔVif)分别由转染293T细胞获得,通过感染MT4和H9细胞,分别检测其反转录酶活性。用分子克隆技术构建APOBEC3G与绿色荧光蛋白融合表达的质粒pEGFP-3G。HIV-1野生株和Vif缺失株质粒与不同剂量的pEGFP-3G共转染293T细胞,APOBEC3G-GFP在细胞内融合表达定位通过荧光显微镜观察。所生成的子代病毒粒子的感染力分别由MAGI检测和反转录酶活性检测方法定量。结果 BH10 WT病毒在H9细胞和MT4细胞中均有所复制,在感染MT4细胞后4 d已经具有较高的反转录酶活性。BH10ΔVif病毒感染H9细胞产生的子代病毒的反转录酶活性接近细胞对照水平,而其在MT4细胞中产生的子代病毒的反转录酶活性在感染后12 d有所显现,即非允许性H9细胞内APOBEC3G对ΔVif病毒株具有很强的抑制作用。与绿色荧光蛋白融合表达的APOBEC3G蛋白定位于细胞质。BH10ΔVif转染293T细胞后生成的病毒滴度为2.75×104 U/mL,随着pEGFP-3G共转染量的升高,所产生的子代病毒滴度从1.48×103 U/mL显著降至0.33×103 U/mL。与0.2μg质粒pEGFP-3G共转染产生的BH10ΔVif病毒的感染力比不表达APOBEC3G的相同病毒的感染力降低近20倍。结论 APOBEC3G具有抗HIV活性,同时HIV Vif在病毒复制过程中发挥关键作用,两者之间相互作用的量效关系为我们构建抗病毒药物筛选平台奠定了可靠的实验基础。     

健康人APOBEC3G基因的克隆及真核表达载体的构建与鉴定

目的克隆人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA editing enzyme,catalyticpolypeptide 3G,APOBEC3G）基因cDNA,构建APOBEC3G基因的真核表达载体,并在体外进行表达和鉴定。方法采用RT-PCR技术从健康人外周血单个核细胞中克隆APOBEC3G基因,将该基因插入pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-A3G真核表达质粒,并利用脂质体将重组质粒pcDNA3.1-A3G转染HepG2和HL7702细胞,经免疫细胞化学、Western blot等方法检测APOBEC3G真核表达情况。结果双酶切鉴定和测序结果表明,APOBEC3G真核表达载体构建成功。免疫细胞化学和Western blot结果均显示,转染pcDNA3.1-A3G的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白均高表达,转染空质粒pcDNA3.1和未转染的HepG2和HL7702细胞APOBEC3G蛋白低表达或不表达。结论成功构建了人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3G真核表达载体pcDNA3.1-A3G,为进一步研究APOBEC3G抗HBV作用奠定实验基础。     

HBV基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的：研究HBVT1862变异的生物学意义。方法：采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞,以ELISA检测HBeAg的表达量。结果：未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论：HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

HBV 基因T1862突变真核表达载体的构建及在Cos7细胞中的表达

目的研究HBV T1862变异的生物学意义。方法采用分子生物学方法,构建HBV前C/C基因EB病毒真核表达载体,利用体外定点突变技术诱导前C/C基因T1862变异,经PCR-RFLP初筛并经测序终鉴定出阳性克隆后,以脂质体介导方法将突变前后的重组质粒转染Cos7细胞, 以ELISA 检测HBeAg的表达量。结果未突变的重组质粒可稳定表达HBeAg,突变后的重组质粒未能检测到HBeAg表达。结论 HBV前C/C基因1862点突变的真核表达载体的构建,为体外研究该点突变引起HBV的一系列生物学改变奠定基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达的载体构建及鉴定

目的:构建HBV X基因与pCDNA3.1相融合的高效真核表达载体,为进一步研究HBV X基因的功能奠定基础。方法:设计并合成HBV X基因的引物,以HBV DNA阳性血清PCR扩增得到HBV X基因全序列;将X基因连接到真核表达载体pCDNA3.1上后,酶切图谱分析、PCR检测和扩增产物序列分析等,鉴定所构建的真核表达载体。结果:以重组载体为模板扩增得到的片段大小与已知HBV X基因大小相同,酶切也得到目的基因片段,测序结果也显示与已知X基因序列相同。结论:成功构建了HBV X基因的真核表达载体,为进一步研究HBVX基因及其产物的功能奠定了基础。     

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的 构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达.方法 以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平.结果 通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA.结论 成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础.     

APOBEC3G在慢性乙型肝炎、肝癌组织中的表达及与HBsAg、HBcAg的关系

目的 探讨APOBEC3G在正常对照、慢性乙肝患者肝脏组织及肝癌组织中的表达情况,以及在慢性肝炎组织中与HBsAg、HBcAg表达的关系.方法 收集正常对照肝组织9例、慢性肝炎肝脏组织37例,以及肝癌组织13例,运用免疫组织化学染色的方法检测APOBEC3G、HBsAg、HBcAg的表达.结果 与正常肝脏相比,慢性乙肝肝炎患者肝脏组织中APOBEC3G的表达增强,差异具有显著性(P<0.05),主要定位于HBV感染的肝细胞及汇管区的炎性细胞胞浆中,但与同时在肝细胞内高度表达的HBsAg、HBcAg强度无明显相关性,r分别为0.04和-0.15.P>0.05.肝癌组织中APOBEC3G也有表达,但未明显强于癌旁组织(P>0.05).结论 HBV慢性感染肝细胞中表达增高的APOBEC3G未能有效控制病毒的活动,并可能与肝癌的发生无直接关系.     

茵兰益肝颗粒剂体外抑制乙型肝炎病毒复制的实验研究

[目的]验证含有茵兰益肝颗粒剂药效成分的药物血清对转染乙型肝炎病毒基因的人肝癌细胞系2.2.15(HepG2.2.15)细胞分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和e抗原的(HBeAg)抑制作用。[方法]组织培养及酶联免疫吸附试验(ELISA)检测。[结果]药物血清第8天对HepG2.2.15细胞半数毒性浓度(TC₅₀)为11.48%,最大药物血清无毒浓度(TC₀)为6.0%。6.0%~3.0%、1.50%、0.75%4种药物血清浓度在HepG2.2.15细胞中第8天对HBsAg的抑制率分别为7.89%~5.8%、1.6%、1.6%,对HBeAg抑制率均为负值。[结论]茵兰益肝颗粒剂对HepG2.2.15细胞分泌HBsAg有较低的抑制率,对HBeAg无抑制作用。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

MAP30 抗乙型肝炎病毒的体外实验

目的 :探讨MAP30 (momordicaanti HIV proteinof30ku)体外抗乙型肝炎病毒 (HBV)的作用 .方法 :以HBVDNA转染的人肝癌细胞株 (HepG2 .2 .15 )为靶细胞 ,与MAP30共同温育 10d ,观察对细胞的毒性 ;用ELISA、荧光定量PCR和Southern印迹法分别检测培养上清中HBsAg ,HBVDNA和细胞内HBVDNA .结果 :MAP30能显著减少HepG2 .2 .15细胞培养上清液中HBsAg ,HBVDNA的分泌 ,在第 8日时 ,对HBsAg抑制率为 5 0 .4 9% ,HBVDNA定量 <1× 10 7拷贝·mL-1;Southern印迹法显示MAP30能抑制HBV复制中间体及共价环状闭合DNA .MAP30未发现对细胞有毒性作用 .结论 :MAP30具有较强的体外抗HBV作用 ,作为新的抗病毒植物蛋白 ,具有其临床应用价值     

乙肝病毒抗原基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建乙肝病毒(Hepatitis B virus,HBV)相关抗原基因真核表达载体,检测各抗原基因在体外真核细胞中的表达情况.方法:以含有1.3倍的HBV全基因组序列的质粒PcDNA3.1-HBV为模板,PCR扩增HBV的各抗原基因片段,通过连接至中间克隆载体Peasy-T1-Simple,酶切及测序鉴定正确后,...     

HBV中片段表面抗原及E抗原真核表达质粒的构建与体外表达

目的 构建乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）中片段表面抗原真核表达质粒和Ｅ抗原真核表达闰。方法 将编码ＨＢＶ中片段表面抗原（ｐｒｅＳ２＋Ｓ）的基因片段和Ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ＿的基因片段分别插入真核细胞表达载体（ｐＪＷ４３０３）中,构建成的重组体经筛选鉴定后,再转染哺乳动物细胞,检测表达产物。结果 电泳鉴定显示目的基因片段正确插入了表达载体。经筛选、纯化的阳性克隆转染哺乳动物细胞后可表达ｐｒｅＳ２＋Ｓ和ＨＢｅＡｇ