OPS两步法玻璃化冷冻小鼠8-细胞胚胎生存发育率的研究

目的为实验动物、家畜和人类胚胎的冷冻保存探索简易、高效的玻璃化冷冻程序。方法以小鼠8-细胞胚胎为材料,在25℃室温和37℃恒温台条件下,利用玻璃化冷冻溶液EDFS30, 对小鼠8-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存,解冻后培养60 h后的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标,同时对解冻后培养1-3 h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。OPS(Open-pulled straw)两步法冷冻保存,即胚胎首先移入预处理液(10％EG 10％DMSO)中平衡30 s,再移入玻璃化溶液中吸入OPS平衡15、25、35、45和60 s连同胚胎直接投入液氮中冷冻保存。结果小鼠胚胎8-细胞冷冻后囊胚发育率最佳组高达95．6％,与对照组(96．8％)差异无统计学意义(P> 0．05)。利用最佳冷冻组获得的165枚胚胎移植于11只假孕63-67 h的受体母鼠,结果有4只妊娠,产仔23只,妊娠产仔率为38．3％(23/60),与对照组37．9％(22/58)差异无统计学意义(P>0．05)。结论 EDFS33为玻璃化冷冻液,OPS两步法能有效地冷冻保存小鼠8-细胞胚胎。     

小鼠胚胎玻璃化冷冻保存影响因素的研究

胚胎置玻璃化1液(VS-1)(含10%甘油 20%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中平衡10或17min后装管置4℃或18℃玻璃化2液(VS-2)(含25%甘油 25%1.2一丙二醇 20?S的PBS液)中。随即投入液氮冷冻保存。结果显示:在VS-1液中平衡10min组的胚胎获较高成活率;4℃的VS-2液显著地改善囊胚冷冻后成活率;桑椹胚冷冻效果优于囊胚。将解冻后120枚胚胎移植于12只受体鼠,获36只成活仔鼠。     

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

玻璃化冷冻与慢速程序冷冻对人ICSI的D3胚胎的效果观察

目的 　比较冷冻环玻璃化冷冻法与慢速程序冷冻法对人ICSI的D3冷冻胚胎复苏的效果。　方法 　将接受卵母细胞浆内单精子注射-胚胎移植（ICSI-ET）患者的取卵周期移植后剩余的D3胚胎分别进行慢速程序冷冻法或冷冻环玻璃化法冷冻 ,比较胚胎复苏后的存活率、妊娠率等指标。　结果 　玻璃化冷冻复苏101个周期 ,411个胚胎、存活392个（95.4%）,种植率18.2%,临床妊娠45例(44.6%) ,其中 3例流产（6.7%）。慢速程序冷冻57个复苏周期 ,234 个胚胎、存活185 个（79.1% ）, 种植率15%,临床妊娠15例 （26.3%）。玻璃化冷冻法的胚胎复苏存活率、完整胚胎率高于慢速程序冷冻法（P<0.05）;种植率高于慢速程序冷冻,但差异无统计学意义。结论 玻璃化法的冷冻复苏率比传统的慢速程序冷冻法高,更适于人类ICSI的D3胚胎的冷冻保存。     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

玻璃化法与程序化法冻融小鼠胚胎复苏及囊胚孵出效果的比较

目的：探讨玻璃化法与程序化法冻融小鼠胚胎复苏及囊胚孵出效果,为玻璃化法应用于人胚奠定基础.方法： 6～8周龄纯净级昆明种小鼠促排卵与雄鼠合笼妊娠后收集2-细胞胚胎,分别采用玻璃化法与程序化法进行冻融及培养,并比较2种方法小鼠胚胎的复苏率、囊胚孵出率.结果： 玻璃化法与程序化法的复苏率分别为63.82%（224/351）、62.57%（209/334）,差异无统计学意义（P＞0.05）;玻璃化法与程序化法囊胚孵出率分别为34.2%（120/351）、31.74%（106/334）,差异无统计学意义（ P＞0.05）.结论： 玻璃化技术具有有效、简便、迅速的优点,是冻贮鼠胚最为理想的方法.     

不同时期和不同来源鼠胚玻璃化冷冻效果的比较

目的：比较不同时期、不同来源的鼠胚玻璃化冷冻的存活率以及发育为囊胚的成功率。方法：采用体外受精和体内受精的方式得到小鼠的2、4、8细胞期胚胎,对其进行玻璃化冷冻、解冻,观察胚胎的存活与囊胚形成,以未冷冻的胚胎作为对照组。结果：由体外受精和体内受精获得的2细胞期胚胎在冷冻复苏后的存活率分别为70.67%、72.06%,囊胚形成率分别为65.33%、67.62%;4细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为88%、89.71%,囊胚形成率分别为81.33%、83.82%;8细胞期胚胎冷冻复苏后的存活率分别为93.33%、94.12%,囊胚形成率分别为92%、94.12%。和对照组相比,2细胞和4细胞期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率差异有统计学意义（P＜0.05）,而8细胞期的胚胎差异无统计学意义（P>0.05）。不同时期胚胎冷冻复苏后囊胚形成率间差异有统计学意义（P＜0.05）,受精方式对处于同一时期的胚胎在冷冻复苏后存活率和囊胚形成率均无明显影响。 结论：玻璃化冷冻可以作为小鼠胚胎保存的有效方法,相对2、4细胞期胚胎,冷冻效果最好的是8细胞期胚胎。     

小鼠胚胎玻璃化冷冻的研究进展

玻璃化冷冻是继常规冷冻方法之后发展起来的一种冷冻方法,它操作简单且不需要高精度的冷冻仪。玻璃化冷冻的效果与玻璃化溶液的种类、冷冻方法及胚胎的不同品种及时期有关。本文综述了近年来有关胚胎玻璃化冷冻的研究进展。     

小鼠胚胎冷冻研究

目的 探讨小鼠胚胎冷冻保存方法。方法 用EG40、ES40、EFS403种冷冻液进行小鼠胚胎快速冷冻，比较解冻后胚胎的发育率、孵化率、着床率。结果 EFS40冷冻液冷冻效果最好，与对照组相比无明显差异；ES40其次，EG40效果最差。结论 EFS40冷冻液适合用于小鼠胚胎冷冻保存。     

Comparison of Efficacy of Two Vitrification Solutions for Mouse Morulae

Objective To study the efficacy of two vitrification solutions for mouse morulae Methods Good morulaes of NIH mice were collected and used to test toxicity of the vitrification solutions EDS40 （40% ethylene glycol, 18% dextran and 0.5 tool sucrose） and EFS40 （40% ethylene glycol, 18% ficoll and 0.5 tool sucrose）. Fine vitrified morulae were packaged in 0.25 mL plastic straws and immersed into liquid nitrogen and cryopreserved for about 2-3 months. Then the straws were heated rapidly, washed in Ham＇s F12 medium and cultured. The viability was determined by morphology and blastocyst formation after being cultured for 48 h. Some embryos were transplanted to recipients after being cultured for 12-14 h. The number of pregnant recipients and young born was counted and analyzed by Chi-squared test. Results The toxicity of EDS40 solution was significantly lower than that of EFS40 （P〈0.05） and the number of embryos developed to the blastocysts after vitrification in EDS40 was significantly higher than in EFS40 （P〈0.05）. The number of zona pellucida and the number of pregnancy and birth integrated after vitrification cryopreservation had no significant difference between EDS40 and EFS40 （P〉0.05）. However, the embryo fineness rates after vitrification in EDS40 was significantly better than in EFS40 （P〈0.01）. Conclusion EDS40 solution has less toxicity and better cryoprotect effect on embryos than EFS 40.     

利用精子冷冻、体外受精技术进行昆明小鼠育种初探

在昆明(KM)小鼠标准化研究中,采集武汉生物制品研究所、上海第一生化制药厂普通级KM小鼠的精子并冷冻运输,冻融精子与中科院上海实验动物中心KM雌鼠的超排卵体外受精(IVF)得到杂交一代2细胞胚胎,用中科院动物中心KM鼠冻融精子对照.无菌条件下2细胞胚胎移植入SPF级假孕鼠,受体饲养于独立通气笼具(IVC)中.平均产仔率为51.9%,离乳率100%.三种群12周龄KM雄鼠精子冷冻复苏率,IVF率,移植成绩均无显著差异(P>0.05).仔鼠经微生物、寄生虫学检测达SPF标准.结果表明,利用冷冻精子,通过IVF、胚胎移植能够方便快速的建立种群间杂交一代,并实现生物净化.     

卵裂球电融合方法制作小鼠多倍体胚胎

目的：探索制作小鼠多倍体胚胎的方法，方法：应用卵裂球电融合方法。制作小鼠四倍体和八倍体胚胎。结果：经卵裂球电融合得到的多倍体胚胎，在体外培养条件下，可以发育到囊胚，其囊胚的形态与正常二倍体囊胚无区别，但囊胚中的细胞数量随着染色体倍性的增加而减少。进行电融合时，电压强度直接影响到卵裂球的融合效率，最适宜的电压强度与胚胎的染色体倍性存在一定的联系。结论：卵裂球电融合方法可以用来制作小鼠多倍体胚胎。     

近交系小鼠胚胎玻璃化冷冻技术研究

目的 对近交系小鼠体内受精的胚胎在三种不同处理温度(20℃、25℃、28℃)进行玻璃化冷冻保存。方法 不同温度下,胚胎在10％EG溶液中预处理5min,再投入EFS40玻璃化溶液中1min,平衡后冷冻。结果 与20℃和28℃相比,三个品系小鼠的胚胎都在25℃冷冻时获得最佳效果,解冻后培养观察发育率分别是87．77％、90．00％、87．18％。结论 该结果对近交系小鼠胚胎保存具有重要意义。     

小鼠早期胚胎性别鉴定的研究

用改进的细胞遗传学方法制备染色体标本,鉴定了小鼠晚期桑椹胚(晚桑)、囊胚和扩展囊胚(扩囊)的性别。在实验中,利用小鼠早期胚胎染色体标本制备的理想实验参数,鉴定了242枚小鼠晚桑、囊胚和扩囊的性别,性别鉴定成功率分别为80.4％、99.0％和94.5％。以细胞遗传学方法鉴定小鼠早期胚胎性别的结果为标准,得出用间接免疫荧光法和PCR(聚合酶链反应)扩增SRY(y染色体的性别决定期)部分序列法分别鉴定100枚和26枚小鼠胚胎性别的准确率相应地为74.0％和92.3％。     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

人卵泡液对体外培养鼠胚发育的影响

昆明种雌鼠经孕马血清促性腺激素（ＰＳＭＧ）和人绒毛膜促性腺激素（ＨＣＧ）超数排卵，与雄鼠交配后在注射ＨＣＧ４２ｈ获得晚期２－细胞鼠胚．置Ｈａｍ′ｓＦ~（１０）为主的培养液中，发育到囊胚的平均比率为６２．０％。实验组培养液中加入５％，１０％，１５％（Ｖ／Ｖ）人卵泡液，囊胚比率为２３．７％（Ｐ＜０．０５），１９．５％（Ｐ＜０．０５），１７．８％（Ｐ＜０．０５）。不同浓度卵泡液组间无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。结果表明：（１）２－细胞晚期鼠胚体外培养结果稳定，适宜作人胚胎及卵子体外培养条件的质量监控。（２）人卵泡液抑制鼠胚体外发育，且这种抑制与卵泡液浓度无关。     

麦管玻璃化法冻存人早期胚胎的临床应用

目的探讨麦管玻璃化法冷冻技术的临床应用效果。方法应用麦管玻璃化法冷冻技术保存17例患者的116枚4～8细胞期胚胎。结果复苏了7例患者的37枚胚胎,存活25枚,胚胎存活率为67.56%,其中完整胚胎24枚,移植23枚,种植2枚,种植率为8.69%(2/23),1例获得妊娠,妊娠率为12.5%(1/8),并足月剖宫产一健康女活婴。结论麦管玻璃化法是一种可应用于临床的冷冻保存人早期卵裂期胚胎的技术。     

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的　原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法　在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果　 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论　本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 ,证明了本方法的可行性