白桦脂酸对γδT细胞杀伤胰腺癌细胞功能影响及机制研究

目的:观察白桦酯酸作用前后对人γδT细胞增殖及对胰腺癌SW-1990细胞杀伤活性的影响,探讨其发生的机制。方法:分离健康者外周血单个核细胞(PBMC)在体外经多种细胞因子诱导为γδT细胞,收集培养第7天的γδT细胞,给予不同浓度白桦酯酸诱导48h,CCK8法检测白桦酯酸对γδT细胞增殖的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测胰腺癌SW-1990细胞增殖率;γδT细胞分泌细胞因子的检测;流式细胞术(FCM)检测白桦酯酸作用前后γδT细胞穿孔素(PFP)、颗粒酶B(GrB)、NKG2D、CD107a的表达变化;乳酸脱氢酶(LDH)释放法测定白桦酯酸对γδT细胞杀伤胰腺癌细胞株SW-1990的活性影响。结果:白桦酯酸浓度在0.013～1.6μg/mL时能促进γδT细胞生长;经白桦酯酸诱导后的γδT细胞PFP、GrB、CD107a、NKG2DIFN-γ和TNF-а的表达显著高于对照组(P<0.05),对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤活性亦显著高于对照组(P<0.05)。结论:白桦酯酸在一定浓度范围内能够促进γδT细胞增殖,并增强其对胰腺癌SW-1990细胞的杀伤活性,其机制可能与上调γδT细胞表面PFP、GrB、CD107a、NKG2D的表达和增加γδT细胞IFN-γ和TNF-а分泌有关。     

肝癌相关抗原Kinectin蛋白致敏树突状细胞诱导的CTL对肝癌细胞株杀伤作用的检测

目的 探讨肝癌相关抗原Kinectin基因重组蛋白Kinectin-MBP(MBP,麦芽糖结合蛋白)致敏树突状细胞(DCs)体外诱导特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞株的杀伤作用.方法 体外基因工程的方法表达、纯化Kinectin-MBP.从正常人外周血中分离单个核细胞(PBMC),重组人粒细胞-巨噬细胞集落因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素4(rhIL-4)联合培养,诱导扩增DCs,并通过形态学、流式细胞术鉴定DCs.DCs经Kinectin-MBP致敏后,ELISA检测细胞上清液中IL-12和IFN-γ的含量;将致敏DCs与自体T淋巴细胞混合培养后,MTT法检测T细胞增殖的能力;同时诱导T细胞增殖转化为CTL,以此CTL为效应细胞,Kinectin表达阳性的肝癌细胞株bel-7404为靶细胞,LDH 4 h释放法检测CTL对肝癌细胞株的杀伤作用.结果 体外重组蛋白技术成功表达、纯化出Kinectin-MBP.PBMC经rhGM-CSF和rhIL-4联合诱导,可成功培养出DCs.DCs经Kinectin-MBP致敏后上清液中IL-12和IFN-γ的分泌量明显增高,且刺激自体T细胞增殖的能力也显著增强;同时Kinectin-MBP致敏的DCs能明显诱导CTL的增殖,此CTL对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株有较明显的杀伤作用,其杀伤率在效靶比为25∶1时达最高峰[为(65.00±1.47 )％],显著高于其他对照组(均P ＜0.001).结论 体外诱导扩增的DCs经肝癌相关抗原Kinectin-MBP致敏后具有较强的刺激自体T细胞增殖的能力,且在体外可诱导同种CTL产生和增殖,后者对Kinectin阳性的7404肝癌细胞株具有较强的杀伤效应.该实验为将Kinectin蛋白运用于以DCs为基础的肝癌临床免疫治疗奠定了基础.     

舒林酸对人γδT细胞的作用研究

目的:探讨舒林酸在预防消化道肿瘤中对人γδT细胞的影响.方法:异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞.不同浓度的舒林酸诱导γδT细胞和胃腺癌细胞(SGC-7901),流式细胞术检测培养前后的γδT细胞表面标记及检测舒林酸诱导的γδT细胞和SGC-7901细胞凋亡百分率.乳酸脱氢酶法测定γδT细胞的杀伤活性.结果:γδT细胞培养10天时从扩增前4.21%增加到70.35%,CD44达94.0%.舒林酸在100 μmol/L时对γδT细胞的生长抑制率达42.1%,明显高于对SGC-7901抑制率(7.4%).γδT细胞和胃腺癌细胞SGC-7901细胞经不同浓度的舒林酸诱导24 h后杀伤SGC-7901细胞作用在12.5 μmol/L时最强.舒林酸浓度在100 μmol/L时对γδT细胞作用24 h的凋亡率(52.71%)显著高于SGC-7901细胞(7.88%).结论:舒林酸在临床常规使用的药物浓度时可增强γδT细胞杀伤瘤细胞作用,超过这一浓度可明显抑制γδT细胞的增殖能力和杀伤活性,而对胃癌细胞株抑制作用不明显.这一结果为临床非甾体类药物预防消化道肿瘤的用量提供了实验依据.     

环磷酰胺对人γδT细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901作用的影响

目的探讨环磷酰胺对人γδT细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901作用的影响。方法异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞,不同浓度的环磷酰胺诱导γδT细胞24 h,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测环磷酰胺对γδT细胞增殖率的影响,LDH法检测γδT细胞对胃癌细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测诱导前后的γδT细胞的凋亡率及NKG2D受体表达水平。结果γδT细胞培养10天时从扩增前4.21%增加到70.35%,当环磷酰胺浓度在0.05~2.0 ng/L时能够促进人γδT细胞的生长,增殖率随着该药物浓度的增高而增高,浓度大于2.0 ng/L时抑制γδT细胞的生长,γδT细胞杀伤活性与对照组比较明显增高,凋亡率与对照组比较明显降低,且γδT细胞表面NKG2D表达水平明显高于对照组。结论环磷酰胺在一定的浓度范围内,促进γδT细胞的增殖,提高γδT细胞对胃癌细胞的杀伤活性,抑制γδT细胞的凋亡,增强γδT细胞表面NKG2D的表达水平,为环磷酰胺在肿瘤免疫治疗中提供了一定的理论依据。     

环磷酰胺对人γδT细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901作用的影响

目的探讨环磷酰胺对人γδT细胞杀伤胃癌细胞SGC-7901作用的影响。方法异戊烯焦磷酸法体外扩增人外周血γδT细胞,不同浓度的环磷酰胺诱导γδT细胞24 h,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测环磷酰胺对γδT细胞增殖率的影响,LDH法检测γδT细胞对胃癌细胞的杀伤活性,流式细胞仪检测诱导前后的γδT细胞的凋亡率及NKG2D受体表达水平。结果γδT细胞培养10天时从扩增前4.21%增加到70.35%,当环磷酰胺浓度在0.05~2.0 ng/L时能够促进人γδT细胞的生长,增殖率随着该药物浓度的增高而增高,浓度大于2.0 ng/L时抑制γδT细胞的生长,γδT细胞杀伤活性与对照组比较明显增高,凋亡率与对照组比较明显降低,且γδT细胞表面NKG2D表达水平明显高于对照组。结论环磷酰胺在一定的浓度范围内,促进γδT细胞的增殖,提高γδT细胞对胃癌细胞的杀伤活性,抑制γδT细胞的凋亡,增强γδT细胞表面NKG2D的表达水平,为环磷酰胺在肿瘤免疫治疗中提供了一定的理论依据。     

人天冬氨酸-β-羟化酶树突状细胞疫苗对肝癌细胞系的体外作用研究

目的：通过对携带人天冬氨酸-β-羟化酶（aspartate-β-hydroxylase,AAH）基因的树突状细胞杀伤肝癌细胞系的研究,探索可用于防治肝癌的树突状细胞疫苗。方法：重组腺病毒（Ad-AAH-IRES2-EGFP）感染C57BL/6小鼠骨髓未成熟树突状细胞（dendritic cells,DCs）制备携带AAH基因的DCs（AAH-DCs）,与同体小鼠脾脏T淋巴细胞共培养后作为效应细胞,以肝癌细胞株HepG2和Huh7分别作为靶细胞,效应细胞分别和靶细胞共培养24 h,CCK-8法检测效应细胞对靶细胞增殖的影响;流式细胞术检测效应细胞对靶细胞凋亡的影响。将AAH-DCs连续3次皮下注射免疫C57BL/6小鼠,乳酸脱氢酶释放法检测免疫后小鼠脾脏T淋巴细胞对靶细胞的裂解效应。结果：AAH-DCs与T淋巴细胞共培养组靶细胞的增殖能力明显低于对照组（P=0.000）,凋亡率明显高于对照组（P=0.000）;实验组靶细胞的裂解率明显高于对照组（P=0.000）。结论：荷载AAH基因的树突状细胞疫苗能够诱导产生细胞毒性T淋巴细胞从而杀伤表达AAH的肝癌细胞。     

黑色素瘤抗原-A3致敏的树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用

【目的】观察经黑色素瘤抗原-A3(melanoma antigen gene,MAGE-A3)致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)活化的淋巴细胞对人肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞的体外杀伤作用。【方法】采用粒—巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)和白介素-4(interleukin-4,IL-4)从人外周血中诱导树突状细胞,经MAGE-A3抗原致敏后与T淋巴细胞共培养,以淋巴细胞为效应细胞,分别以表达MAGE-A3抗原的肝癌细胞株H4M、不表达MAGE-A3抗原的正常肝细胞为靶细胞,收集T淋巴细胞进行肿瘤细胞杀伤试验。【结果】负载MAGE-A3抗原的DCs激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对肝癌细胞有明显的杀伤作用,其对肝癌细胞的杀伤率显著性高于正常肝细胞对照组(P<0.05)。【结论】MAGE-A3蛋白抗原致敏的树突状细胞疫苗可激活特异性的CTL,在体外诱导出较强的对人肝癌细胞株的细胞毒作用。     

白藜芦醇对人γδT细胞生长和杀伤功能的影响

目的 探讨白藜芦醇对人外周血γδT细胞生长和杀伤功能的影响。方法 用异戊烯焦磷酸法体外扩增人γδT细胞,不同浓度的白藜芦醇作用γδT细胞后,MTT法检测γδT细胞生长情况,流式细胞术检测给药前后γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素和CD107a的表达。结果 人外周血单核细胞（PBMC）培养10 d后,γδT细胞比例从扩增前的3.12%增至80.46%;白藜芦醇浓度为0.2～12.5 μmol/L时能促进γδT细胞生长,其中以1.56 μmol/L作用最明显,使细胞增殖率高出对照组约15.90%;白藜芦醇1.56 μmol/L可上调γδT细胞杀伤功能相关标志物颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达,随着给药浓度增高,γδT增殖及其颗粒酶B、穿孔素、CD107a表达逐渐降低。结论 白藜芦醇在一定浓度范围内可促进γδT细胞增殖,且增强γδT细胞杀伤功能相关标志的表达,这可能是其抗肿瘤作用机制之一。     

人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验

目的:探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC)和成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell,mDC).培养肝癌细胞,Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA.通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内;观测电转染的转染率;采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志;通过混合淋巴细胞实验,获取mDC激活的特异性效应T细胞.用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性.结果:电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC.电转染前后imDC分子表达无显著差异,mDC的分子表达与imDC相比发生了变化.转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞.效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞,而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用.结论:电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达;转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞;效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性.     

抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：观察肝癌细胞抗原致敏的树突状细胞（Dendritic cells,DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK）共培养后的细胞增殖活性、表型的变化及其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性。方法：采集健康供者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,常规诱导出DC、CIK,用肝癌细胞HepG2抗原冲击DC（Ag-DC）,并将其与CIK共培养（Ag-DC-CIK）,观察CIK和Ag-DC-CIK的细胞表型及增殖活性,并以肝癌细胞HepG2作为靶细胞,用MTT法检测CIK和Ag-DC-CIK的杀伤活性。结果：肝癌细胞抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,Ag-DC-CIK细胞群增殖活性明显增强,且高表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,其增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高（P<0.05）。结论：肿瘤抗原致敏的DC与CIK共培养获得的Ag-DC-CIK增殖活性和对肝癌细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。     

γδT细胞对宫颈癌细胞体外杀伤作用的探讨

目的:探讨宫颈癌组织中是否存在γδT细胞以及γδT细胞在体外抗肿瘤作用.方法:免疫组织化学法检测10例宫颈癌组织中γδT细胞的数量,固相抗体包被法体外扩增出特异性的γδT细胞后用流式细胞仪检测其纯度,乳酸脱氢酶释放实验检测γδT细胞对宫颈癌细胞株SiHa、HeLa细胞的杀伤能力.结果:免疫组化结果显示人宫颈癌组织中肿瘤浸润γδT细胞阳性染色较癌旁组织显著增强,该细胞通过固相抗体包被法体外扩增30 d之后用流式细胞仪检测细胞表面TCRγδ的阳性率高达(91.2±1.2)％,乳酸脱氢酶释放实验显示体外扩增的γδT细胞能够杀伤宫颈癌细胞株SiHa、HeLa细胞,并且其杀伤效应随效应细胞/靶细胞的比例增高而增强.结论:宫颈癌组织中存在γδT细胞,该细胞在体外对宫颈癌细胞具有杀伤作用,其杀伤效应随效应细胞/靶细胞的比例增高而增强.     

临床试剂rIL-2和实验试剂IL-2对γδT细胞体外扩增影响的研究

目的检测经临床试剂重组白细胞介素2(rIL-2)和实验试剂白细胞介素2(IL-2)体外辅助扩增后γδT细胞的细胞纯度及对肿瘤细胞的细胞毒性差异。方法应用梯度离心法分离10例正常人外周血单个核细胞,经IL-2和唑来膦酸(Zol)联合刺激γδT细胞进行扩增,采用流式细胞仪鉴定γδT细胞及其纯度,并检测其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。结果在Zol存在的情况下,经实验用IL-2刺激的γδT细胞纯度最高达97.3%,经临床试剂rIL-2刺激的纯度为51.42%(P<0.05),且IL-2扩增后的γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用较rIL-2明显。结论在Zol的存在前提下,IL-2能促使人外周γδT细胞迅速增生,达到实验所需要的细胞纯度,并对肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用,而rIL-2则不能。     

溶瘤病毒dl1520体外对肝癌细胞杀伤作用的研究

目的:探讨E1B缺陷溶瘤腺病毒dl1520体外对肝癌细胞Hep3B的杀伤作用。方法:通过细胞病变效应(CPE)观察d l1520对肝癌细胞株的杀伤作用;MTT法测定对肝癌细胞生长抑制作用,并通过空斑法测定病毒增殖,探讨其杀伤机理。结果:d l1520在肝癌细胞株Hep3B中可复制增殖并导致明显细胞病变效应,显著抑制癌细胞的生长。结论:d l1520体外可在肝癌细胞Hep3B中复制并裂解杀伤肿瘤细胞。     

树突状细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞体外对自体肝癌细胞杀伤活性的研究

目的探讨树突状细胞(DC)激活的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)体外对自体肝癌细胞杀伤活性.方法从肝癌患者外周血获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤抗原激活DC,然后用DC来激活TIL,观察TIL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性.结果DC激活的TIL具有很高的对自体肝癌细胞杀伤活性,杀伤率为(89.39±3.05)%,明显高于未经DC激活的TIL、CD激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体肝癌细胞的杀伤率.结论肝癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗肝癌免疫.     

人卵巢癌细胞特异CTL系的免疫学特性初步研究

目的 探讨人卵巢癌细胞体外刺激、诱导的肿瘤特异细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对靶细胞的杀伤活性。方法 应用建株的人卵巢癌细胞（OVA－319），在体外定期刺激、诱导肿瘤患者外周血淋巴细胞，经微量淋巴细胞毒试验和流式细胞术分别测定扩增的淋巴细胞组织相容性白细胞抗原（HLA）Ⅰ类分子表型和膜表面免疫标志物，并通过4－甲基偶氮唑盐（MTT）法分析其对肿瘤细胞的杀伤活性。结果 经卵巢癌细胞刺激、诱导3周后扩增的淋巴细胞主要为T细胞抗原受体（TCR）－α、β及CD8阳性的CTL，具有明显特异性杀伤肿瘤细胞的作用，并发现经OVA－319细胞刺激、诱导后不同个体的卵巢癌患者CTL的杀伤活性与效靶细胞的HLA－A、B位点相同数成正比。结论 肿瘤细胞体外激活的CTL具有特异杀伤靶细胞作用，提示CTL特异杀伤作用与刺激细胞、靶细胞及本身CTL表型的HLA－A、B位点密切联系。     

γ-氨基丁酸对人末梢血γδT细胞作用的实验研究

目的 研究γ-氨基丁酸(GABA)对人外周血γδT细胞的增殖、细胞周期、凋亡的变化、杀伤活性的影响及其可能的作用机制.方法 在体外用不同浓度的GABA与人γδT细胞作用后,用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)以及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测人γδT细胞的增殖能力、T细胞周期、凋亡和杀伤活性的变化.结果 GABA能显著抑制γδT细胞的生长(P＜0.01),并具有浓度依赖性; GABA显著影响细胞周期比例的分布,促进细胞凋亡;GABA抑制γδT细胞对人胰腺癌细胞株SW-1990的杀伤活性.结论 GABA能显著抑制γδT细胞的增殖,抑制γδT细胞的杀伤活性.提示GABA可能是通过影响细胞周期及凋亡对γδT细胞发挥作用,进而影响其杀伤活性.     

树突状细胞激活的肿瘤浸润性淋巴细胞体外对自体肝癌细胞杀伤活性的研究

目的:探讨树突状细胞(DC)激活的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)体外对自体肝癌细胞杀伤活性.方法:从肝癌患者外周血获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤抗原激活DC,然后用DC来激活TIL,观察TIL在体外对自体肝癌细胞的杀伤活性.结果:DC激活的TIL具有很高的对自体肝癌细胞杀伤活性,杀伤率为(89.39±3.05)%,明显高于未经DC激活的TIL、CD激活的T淋巴细胞和未经DC激活的T淋巴细胞对自体肝癌细胞的杀伤率.结论:肝癌患者外周血DC能诱导TIL产生高效而特异的抗肝癌免疫.     

γ-氨基丁酸及其拮抗剂对γδT细胞的作用

目的研究γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)及其A受体拮抗剂印防己毒素(picrotoxin,PTX)对人外周血γδT细胞的增殖、细胞表面受体的表达、杀伤活性的影响及其可能的作用机制。方法在体外用不同浓度的GABA和PTX与人γδT细胞作用后,用MTT比色法和流式细胞仪(FCM)以及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测人γδT细胞的增殖能力、T细胞表面受体的表达和杀伤活性的变化。结果 GABA能显著地抑制γδT细胞的生长(P<0.01),并具有浓度依赖性,PTX对GABA的抑制细胞增殖有拮抗作用;GABA显著降低γδT细胞表面受体NKG2D的表达,增加γδ-TCR的表达,PTX有轻微的协同作用;GABA抑制了γδT细胞对人胰腺癌细胞株SW1990的杀伤活性,PTX能够拮抗GABA的此项作用。结论这些结果提示GABA可能通过多种途径对γδT细胞发挥作用,其杀伤活性主要由其表面受体NKG2D介导的,并且需要γδT细胞同时表达γδ-TCR和NKG2D两种受体。     

ATC-IC致敏的树突状细胞诱导T淋巴细胞抗肿瘤效应的研究

 目的 探讨凋亡的肾癌细胞与G250单克隆抗体形成的复合物（ATC-IC）致敏树突状细胞（DC）后,DC对T淋巴细胞的激活、增殖作用及对肾透明细胞癌细胞的抑癌效应。方法 制备凋亡的肾癌细胞与G250mAb形成的复合物ATC-IC;分离健康供血者外周血单个核细胞及T淋巴细胞,联合应用粒-巨细胞集落刺激因子及白细胞介素从单个核细胞中培养出DC,以制备的ATC-IC刺激DC为实验组,以凋亡的肾癌细胞刺激DC和未经任何因素刺激的DC为对照组,检测各组DC对T淋巴细胞的细胞增殖动力学的影响,并用CCK-8测定诱导的细胞毒性T淋巴细胞对肾癌细胞株786-0和肺癌细胞株A549的杀伤活性。结果 ATC-IC致敏的DC诱导T淋巴细胞强烈的增殖反应,与对照组比较具有统计学差异（P＜0.01）;增殖后的T淋巴细胞对786-0的杀伤率明显高于对照组（P＜0.05）,而2组对A549细胞均无明显杀伤活性。结论 经ATC-IC致敏的DC能诱导T淋巴细胞增殖,在体外可有效的诱导特异性抗肾癌效应。     

γδT细胞与抗结核免疫

T细胞免疫在抗结核感染中起着重要作用,T细胞包括αβT细胞和γδT细胞两类,其中数量较少γδT细胞在抗结核感染中的作用日益受到重视。γδT细胞可直接杀伤靶细胞,分泌细胞因子调节巨噬细胞和αβT细胞,使之尽早发挥抗结核效应。