髓核细胞表型对干细胞治疗椎间盘退变的意义

椎间盘退变导致的下腰痛是社会的主要负担之一,而卧床休息、理疗、抗炎药物治疗及手术治疗等传统治疗方法仅能在短期或一定程度上缓解椎间盘退变给患者带来的痛苦,并不能使患者的生活质量得到显著改善。目前,细胞移植对于椎间盘退行性疾病的治疗有较好的前景,且能更好地衡量功能恢复的效果。其中,了解移植细胞能否产生健康髓核组织至关重要。髓核细胞的表型是独特的,它由一组能反映其生理功能的特征性标志物的表达构成。未来,髓核细胞及其祖细胞的独特生理功能的表型标记将对干细胞治疗椎间盘退变具有重要意义。     

兔椎间盘髓核细胞体外培养自然退变的观察

目的 观察体外培养的兔髓核细胞不同代数之间细胞形态、NOS活性、NO含量、细胞总蛋白含量的变化;制作兔髓核细胞体外培养的退变模型.方法 酶消化及自然传代法分离培养体外兔椎间盘髓核细胞,HE染色光镜观察髓核细胞形态;利用分光光度法检测P1、P3代细胞培养液中NOS活性和NO含量,考马斯亮蓝法检测细胞总蛋白含量.结果 ①成功建立了兔椎间盘髓核细胞的体外培养模型;②随着传代次数的增加,细胞内一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性和NO分泌增加,但细胞总蛋白含量却降低,差别具有统计学意义.结论 通过体外培养兔髓核细胞并进行自然传代,随着传代次数的增加,髓核细胞呈现自然退变现象,为髓核细胞退变机理的研究提供了细胞学基础.     

椎间盘髓核细胞表型的研究进展

髓核细胞特异性表型是识别髓核细胞和研究其生物学行为的基础,同时也是基因干预、细胞移植等生物学修复椎间盘退变的前提。髓核细胞兼有软骨细胞和脊索细胞的表型特点,而特定基因的转录和表达调控又广泛受到椎间盘局部微环境以及椎间盘退行性变的影响。部分髓核细胞亚群还具有祖细胞的生物学特性并表达特定的表型。对髓核细胞表型的研究有助于推动椎间盘退变生物学治疗的进展。     

退变髓核细胞修复及组织工程应用研究进展

髓核细胞退变的病理机制十分复杂,完整的退变过程目前尚未明确.髓核细胞退变保守治疗或手术治疗均具有一定局限性.近年来,生物分子技术和组织工程技术的发展为修复退变髓核细胞提供了新的思路和方法.干预Notch信号通路、调节细胞内的生长因子或抑制因子的表达对修复早期退变髓核细胞均具有积极作用,而细胞移植技术和生物复合材料的兴起...     

腺病毒介导的基因在人退变髓核细胞的表达

目的 通过对人退变髓核细胞的原代培养，了解其生物学特性，并将绿色荧光蛋白基因转染至细胞内，观察基因在细胞内的表达情况。方法 培养人退变髓核细胞，建立体外髓核细胞培养模型，同时进行细胞活力测定，并用腺病毒介导的绿色荧光蛋白基因转染至髓核细胞内，观察基因的表达情况。结果 (1)人退变髓核细胞贴壁及生长的速度均十分缓慢；(2)随着培养时间的延长及传代，细胞活力逐渐降低；(3)转染了绿色荧光蛋白基因的髓核细胞可以持续发出绿色荧光达4周。结论 (1)兔腰椎间盘髓核细胞的生长能力较弱；(2)外源性的基因可以在髓核细胞内得到持续的表达。     

改良法原代培养兔髓核细胞及其生物学特性

目的探索兔髓核细胞培养的最佳方法,并检测其生物学特性。方法以DMEM／F12（1：1,添加FBS 10％,pH7．2）作为基础培养液,用酶消化及机械剪切法原代培养髓核细胞,检测细胞生长形态及代谢。结果髓核细胞多为多角形,另有细胞为圆形或椭圆形,内含空泡;改良法较酶消化组单层培养细胞增殖能力较强。结论改良法髓核细胞生长状态良好,为椎间盘组织工程髓核细胞的培养奠定了基础。     

大鼠椎间盘器官整体培养条件下髓核组织的变化

目的整体培养包括上下软骨终板、纤维环及髓核组织的大鼠椎间盘器官,观察髓核组织的变化,探索一种椎间盘器官整体培养的实用技术。方法取SD大鼠90只,完整取出腰段椎间盘器官共400个,随机分为4组,置入12孔培养板内,配制高渗培养液,对椎间盘器官进行整体培养,观察髓核细胞成活率、组织完整性及基质变化情况。结果体外培养2周的椎间盘组织形态、细胞存活率及髓核组织成分与新鲜离体椎间盘无统计学差异。结论利用高渗培养液可对椎间盘器官进行整体培养,为椎间盘的生理与病理的研究提供一种理想的模型。     

人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究

目的 观察探讨退变与正常髓核组织中内质网应激水平的差异.方法 获取正常和退变髓核组织共9例(均为海军总医院骨科2016年1月至2017年6月期间住院手术患者),取组织及分离培养髓核细胞,通过透射电镜观察内质网形态、免疫组化法对髓核组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达分布进行定性分析,RT-PCR及Western blot对髓核细胞中GRP78、CHOP进行mRNA和蛋白质水平的分析.结果 透射电镜结果显示退变髓核细胞的内质网扩张、肿胀,正常片状折叠结构消失;免疫组化染色及Western blot检测结果均可见退变髓核组织GRP78、CHOP的表达升高;RT-PCR提示较之于正常组,退变组GRP78[(1.076 ±0.13)vs(2.471 ±0.53)]、CHOP[(1.09 ±0.21)vs(6.873±1.4)]明显升高(P＜0.05).结论 退变髓核细胞中内质网应激水平较正常髓核细胞升高,提示内质网应激可能在髓核细胞退变过程中发挥作用.     

髓核研究的现状难以诠释椎间盘退变之道

最近,《关节炎和风湿病》（Anhrilis Rheum）杂志上刊载的1篇题为“人退变椎间盘髓核细胞中,整合素传导通路的变化”的研究文章引起了我们的关注。我们对该文进行仔细研读后,结合我们在人髓核细胞和椎间盘退变领域的研究,就人髓核细胞的培养,椎间盘退变的分级以及正常椎间盘的界定等方面提出了我们的见解,并就相关问题进行了对比和总结。我们撰写的Letter发表在《Anhrilis Rheum》杂志上。     

转染BMP7基因对兔髓核细胞生物学行为的影响

目的观察转染重组BMP7腺病毒（Ad-BMP7）后,兔髓核细胞BMP7和Ⅱ型胶原的表达情况。方法⑴取20只新西兰大白兔,15只作为实验组,5只作为实验对照组。实验组椎间盘注射Ad-BMP7,实验对照组注射携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒（Ad-GFP）,另设空白对照组。⑵分别于注射后1、2、4周各处死5只实验组兔子,注射后1周处死全部实验对照组兔子。RT-PCR和免疫组织化学染色检测BMP7的表达情况,免疫组织化学染色检测Ⅱ型胶原的表达情况。结果⑴实验组的髓核细胞显示了BMP7染色阳性结果,1、2、4周组阳性染色率差异无统计学意义（P〉0.05）。⑵实验组的髓核组织间质Ⅱ型胶原呈阳性染色,1、2、4周的灰度值单因素方差分析,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;SNK两两比较,第1周与第2、第4周差异有统计学意义（P〈0.05）,第2、第4周间差别无统计学意义（P〉0.05）。结论Ad-BMP7转染兔髓核细胞后,能获得长期表达,并能促进Ⅱ型胶原合成。     

重组BMP7腺病毒的构建及转染兔髓核细胞的表达

目的构建重组BMP7腺病毒（Ad—BMP7），观察其转染兔髓核细胞后的表达。方法（1）真核表达载体pcDNA3．1（＋）-BMP7经一系列特定的限制性内切酶酶切，重组了BMP7的腺病毒载体，并转染293细胞进行扩增、滴度测定。（2）取20只新西兰大白兔，15只作为实验组，5只作为实验对照组。实验组椎间盘注射Ad-BMP7，实验对照组注射携带绿色荧光蛋白（GFP）基因的腺病毒（Ad—GFP），另设空白对照组。分别于注射后1周、2周和4周各处死5只实验组兔子，注射后1周处死全部实验对照组兔子。RT—PCR和免疫组织化学染色检测BMP7的表达情况。结果（1）重组Ad-BMP7经限制性内切酶PI-SeeⅠ和I-CeuⅠ双酶切获得BMP7基因片段，PCR扩增得到特异的扩增片段，表明重组的Ad—BMP7载体构建成功。（2）实验组的髓核细胞显示了BMP7染色阳性结果，1、2和4周组的阳性染色率差异无显著意义（P〉0．05）。结论重组BMP7腺病毒的构建及其在兔髓核细胞的表达，为研究其对体内髓核细胞生物学行为的影响奠定了基础。     

骨髓间充质干细胞对退变髓核细胞功能的逆转作用

目的 研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)对退变髓核细胞(dNPCs)的营养修复作用。方法 针刺抽吸法制备SD大鼠退变椎间盘动物模型,分离培养髓核细胞(NPCs)及BMSCs,并将BMSCs和dNPCs分别复合藻酸盐后等比例接种于transwell共培养系统上下室中进行体外非直接接触共培养作为实验组,单纯NPCs和dNPCs分别复合藻酸盐后作为阳性及阴性对照组。光镜下观察细胞生长情况,选取合适细胞复合藻酸盐在共培养体系中培养7 d后回收各组NPCs,对回收细胞的CollagenⅠ、Ⅱ和Aggrecan行Western blot及免疫荧光检测,RT-PCR检测CollagenⅡ、SOX9和Aggrecan的mRNA的表达情况。结果 共培养7 d后,RT-PCR检测结果显示BMSCs+dNPCs组的Collagen Ⅱ、SOX9和Aggrecan的mRNA表达接近NPCs组,但明显高于dNPCs组(P均＜0.05)。Western blot检测结果显示BMSCs+dNPCs组的Collagen Ⅱ和Aggrecan含量接近甚至超过NPCs组,但明显高于dNPCs组(P均＜0.05);CollagenⅠ含量与NPCs组相近,但明显低于dNPCs组(P＜0.05)。Collagen Ⅱ和Aggrecan免疫荧光染色结果显示,BMSCs+dNPCs组和dNPCs组胞质都被染成红色,在核周围着色较深,BMSCs+dNPCs组胞质着色范围及核周围深染范围明显大于dNPCs组。结论 在Transwell非直接接触共培养条件下,BMSCs能够促进dNPCs外基质的表达,提示BMSCs能够在一定程度上逆转椎间盘dNPCs的功能。     

miR-483/CREB1轴介导桃叶珊瑚苷抑制髓核细胞胞外基质降解的研究

目的研究miR-483/CREB1轴在桃叶珊瑚苷(aucubin,AU)抑制人退行性髓核(nucleus pulposus,NP)细胞胞外基质(extracellular matrix,ECM)降解中的功能作用。方法AU处理人退行性NP细胞后,检测细胞活性、ECM相关蛋白及cAMP反应元件结合蛋白1(c AMP responsive element binding protein 1,CREB1)的表达。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)和Western blot检测miR-483表达变化对CREB1丰度的影响;双荧光素酶报告实验(luciferase,LUC)检测miR-483和CREB1-3’-UTR的靶向结合;CREB1过表达载体和(或)miR-483 mimics共转染后,AU处理,检测CREB1及ECM相关蛋白的表达。结果AU可显著增强NP细胞活性(P=0.0004),抑制ECM降解酶基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)、血小板反应蛋白解整合素金属肽酶-5(a disintegrin and metalloproteinase domain with thrombospondin motif-5,ADAMTS-5)与CREB1的表达,促进胶原蛋白Ⅱ型胶原α1(collagen type II alpha 1 chain,COL2A1)和miR-483的表达(P<0.001)。miR-483过表达可抑制CREB1的表达(P<0.0001),LUC实验表明miR-483可与CREB1-3’-UTR靶向结合。功能实验结果表明CREB1可削弱AU对NP细胞ECM的降解的抑制作用,而miR-483可部分逆转CREB1对AU的抑制作用。结论AU诱导NP细胞表达miR-483,进而抑制CREB1的表达,增强NP细胞的活性,抑制ECM的降解。     

腰椎间盘突出症后路髓核摘除28例并发症分析

目的：探讨腰椎间盘突出症后路髓核摘除手术并发症的发生原因，并提出相关防治措施。方法：自1996年6月-2006年6月，我院共有326例腰椎间盘突出症行后路髓核摘除术，其中椎板间开窗290例，半椎板切除29例，全椎板切除7例。结果：有28例出现手术并发症，包括神经根损伤3例，硬脊膜损伤5例（其中脑脊液漏1例），硬膜外血肿1例，椎间隙感染2例，椎间隙定位错误2例，极外侧型突出遗漏2例，术后腰椎失稳7例，原间隙髓核再突出6例。结论：我们只要充分认识极外侧型腰椎间盘突出症的特点，熟悉腰神经根的形状及走行，术前全面查体并常规拍腰椎X片，结合影像学资料认真分析，合理选择手术适应症及手术方式；术中注意无菌操作、正确定位、仔细解剖、规范操作、取净髓核、严密止血、充分引流；术后加强管理，围手术期应用抗生素，以上并发症是可以避免的。     

人工髓核(PDN)置换术治疗腰椎间盘突出症

目的探讨人工髓核(PDN)置换术治疗腰椎间盘突出症的临床应用效果.方法2002年5月以来应用后路PDN置换术治疗L4-5单一间隙椎间盘突出症3例,术前JOA评分分别为5、6、10分,平均7分.结果随访率100%,截止2002年12月,平均随访6月(4月～8月),术后JOA评分分别为28、28、29分,平均28.3分.结论PDN置换术为腰椎间盘突出症治疗提供了一种新方法,其近期疗效满意,但远期疗效还有待进一步随访观察.     

髓核细胞与骨髓基质细胞移植对受损椎间盘退变的影响

目的 探讨移植兔骨髓基质细胞(MSC)和髓核细胞(NPC)对受损椎间盘退变的影响及影像学特点.方法 采用原代细胞培养法获取并扩增NPC及MSC.2岁龄新西兰白兔随机分为3组:盐水注射组3只,MSC移植组6只,NPC移植组6只,L3/4、L4/5、L5/6椎间盘进行髓核穿刺抽吸后,分组注入盐水、MSC和NPC.未处理的L2/3、L6/7、 L7/S1椎间盘作为对照组采集数据. 术前及术后4、6、8周,相同条件下摄取腰椎侧位X光片,运用Image-pro plus6.0测量椎间盘高度指数(DHI)计算%DHI;Merge eFilm Workstation测量MRI T2像椎间盘信号强度并进行标准化(ST2WI),计算%ST2WI.结果 两细胞移植组较之盐水组均能够有效的抑制损伤椎间盘进行性的高度丢失、骨性终板破坏、骨赘形成、细胞外基质丧失等.NPC组第6周%DHI为(74.31±2.59)%,第8周为(79.29±2.53)%,两者间差异有统计学意义(P<0.05),提示8周时NPC组椎间盘高度恢复;且第8周时NPC组与MSC组的%DHI之差异无统计学意义.%ST2WI数据显示第8周时NPC组T2信号强度高于MSC组[(70.63±7.60)% vs (54.32±7.92)%,P<0.05],提示NPC组细胞外基质的合成可能超过MSC组.结论 NP及MSC两种细胞移植能够有效避免椎间盘损伤后发生的进行性的退变过程.8周后NPC组较MSC组显示出更强的基质合成能力,椎间盘高度及含水量出现恢复的迹象.提示外源性NPC能够良好的适应受体椎间盘环境,并发挥相应的细胞外基质分泌功能.     

实验性非压迫腰椎间盘髓核突出大鼠模型的建立

目的：设计一种新的非压迫性腰椎间盘髓核突出动物模型。方法：选择7只Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，将自身尾椎髓核混悬液注射到腰椎硬膜外腔建立动物模型。测量术前、术后3、5、7、9d大鼠后肢机械刺激缩爪阈值。结果：在没有明显机械压迫下，造模后大鼠出现明显的痛觉过敏反应。结论：本模型简单、可靠、费用低廉，为进一步研究腰椎间盘突出症和根性神经痛提供了理想的动物模型。     

聚肌苷酸-聚胞苷酸对人髓核细胞基质金属蛋白酶-1、13表达的影响

目的 探究聚肌苷酸-聚胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid,Poly(I:C)]对人髓核细胞(nucleus pulposus cells,NPC)基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)-1、13表达的影响.方法 取人椎间盘组织,采用酶消化法分离并体外培养NPC.不同时间不同剂量的Poly(I:C)刺激NPC,利用qPCR和Western blot方法检测MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达情况;siRNA分别沉默TLR-3、RIG-1和MDA-5后,Poly(I:C)刺激NPC,qPCR检测MMP-1、13的mRNA表达情况.结果 分离培养的NPC 5~6 d后,贴壁生长;Poly(I:C)刺激NPC后,MMP-1、13的mRNA和蛋白质表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默TLR-3后,MMP-1、13的mRNA 表达水平受到明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA沉默RIG-1和MDA-5后,MMP-1、13的mRNA 表达水平不受影响(P>0.05).结论 Poly(I:C)通过TLR-3受体途径促进NPC表达MMP-1、13.