水通道蛋白1、2、5在膜迷路积水豚鼠耳蜗中的分布及表达研究

目的观察水通道蛋白(aquaporin,AQ)1、2、5(AQP1、AQP2、AQP5)三种蛋白在膜迷路积水豚鼠耳蜗的表达及分布情况,探讨其在内淋巴积液中可能的发生机制。方法选择健康红目豚鼠60只,随机分为空白组(30只)和模型组(30只),模型组给予醋酸去氨加压素6μg·kg-1·d-1腹腔注射10 d,空白组以1 ml生理盐水腹腔注射10 d;常规饲养7天后取出耳蜗,通过免疫组化、Western-blot方法观察AQP1、AQP2、AQP5蛋白在豚鼠耳蜗的分布及表达。结果免疫组化示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达的光密度值分别为0.134±0.021、0.273±0.053;AQP2表达分别为0.089±0.013、0.261±0.100;AQP5表达分别为0.264±0.065、0.151±0.098;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达明显上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。Western-blot示空白组、模型组豚鼠耳蜗组织中AQP1表达分别为0.214±0.034、0.313±0.032;AQP2表达分别为0.283±0.050、0.544±0.042;AQP5表达分别为0.291±0.041、0.199±0.033;与空白组比较,模型组AQP1、AQP2蛋白表达上调(P<0.01),AQP5蛋白表达明显下调(P<0.05)。结论AQP1、AQP2、AQP5蛋白均可能参与了豚鼠耳蜗膜迷路积水的发生。     

杀菌-通透性增强蛋白对分泌性中耳炎大鼠水通道蛋白和黏蛋白表达的影响

目的观察杀菌-通透性增强蛋白对分泌性中耳炎模型大鼠中耳黏膜中水通道蛋白和黏蛋白表达的影响,探讨可能的作用机制。方法采用内毒素制备分泌性中耳炎大鼠模型,将70只大鼠随机分为模型组(10只)和杀菌-通透性增强蛋白(bactericidal-permeability increasing protein,BPI)组(60只),另取10只大鼠作为正常对照组,采用ELISA法检测给药后各组大鼠中耳积液中水通道蛋白AQP1、AQP4及黏蛋白MUC5B、MUC5AC水平,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠中耳黏膜中AQP1、AQP4及MUC5B、MUC5AC mRNA的表达水平。结果模型组AQP1蛋白及mRNA表达量显著低于正常对照组,而AQP4、MUC5B、MUC5AC蛋白及mRNA表达量显著高于正常对照组(P<0.01)。经BPI治疗后,AQP1的表达升高,而AQP4、MUC5B、MUC5AC的表达降低(P<0.05或0.01)。结论 AQP1、AQP4及MUC5B、MUC5AC在分泌性中耳炎病变的形成中起一定作用;BPI通过提高AQP1,抑制AQP4及MUC5B、MUC5AC的表达和分泌,从而减轻分泌性中耳炎的积液分泌;BPI是一个潜在的治疗分泌性中耳炎的药物,可能有效预防慢性分泌性中耳炎的发生。     

正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白的表达及意义

目的检测正常和膜迷路积水豚鼠内耳水通道蛋白（aquaporins,AQPs）的表达,探讨其机理和意义。方法 20只健康豚鼠随机分为实验组和对照组,每组10只,实验组（膜迷路积水模型组）豚鼠腹腔注射醋酸去氨加压素,4μg&#183;kg-1&#183;d-1,共1周,诱导其内耳膜迷路积水,对照组豚鼠腹腔注射等量生理盐水。用免疫组化方法检测两组豚鼠内耳水通道蛋白的表达,并进行比较。结果对照组豚鼠内耳中有AQP0、1、2、3、5、7、8的表达,其中AQP0仅在血管纹和螺旋神经节细胞有较弱的表达;AQP1分布于包绕骨迷路、内淋巴囊、内淋巴管的纤维细胞,基底膜鼓阶面细胞、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘纤维细胞、Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、椭圆囊壁、球囊壁、螺旋神经节等;AQP2表达在血管纹、Corti’s器、螺旋神经节细胞和内淋巴囊中;AQP3、7、8三者的分布类似,在螺旋神经节和包绕膜迷路的组织中表达,包括Corti’s器、内外螺旋沟、血管纹、螺旋韧带纤维细胞、螺旋缘、椭圆囊壁、球囊壁、内淋巴囊等;AQP5则表达在Corti’s器、内外螺旋沟、螺旋神经节、螺旋韧带纤维细胞。实验组豚鼠内耳中,血管纹AQP2的表达与对照组较正常豚鼠表达增加,其它亚型AQPs的表达与对照组无明显差异。结论正常豚鼠内耳中有多种AQPs表达,膜迷路积水后豚鼠内耳中AQP2的表达增强,提示膜迷路积水可能与AQP2表达上调有关。     

大鼠变应性鼻炎模型中T-bet和GATA-3的表达

目的:探讨在大鼠变应性鼻炎(AR)模型单核细胞中T-bet/GATA-3基因的动态表达。方法:20只SD大鼠,雌雄各半,随机分为实验组和对照组,每组各10只。实验组用卵蛋白致敏,以氢氧化铝溶胶和灭活的百日咳杆菌为佐剂,卵蛋白滴鼻建立大鼠AR模型;对照组以氢氧化铝溶胶和灭活的百日咳杆菌生理盐水皮下注射,生理盐水滴鼻。分别在致敏结束、首次激发10h、末次激发10h心脏采血,分离血单核细胞。用RT-PCR法测定单核细胞中T-bet/GATA-3mRNA的表达,对结果进行统计学分析。结果:致敏结束、首次激发10h、末次激发10h3个时间点实验组T-bet mRNA的相对表达量分别为0.404±0.187、1.676±0.708、0.503±0.514,GATA-3mRNA的相对表达量分别为0.434±0.147、0.600±0.480、1.029±0.690;对照组T-bet mRNA的相对表达量分别为0.487±0.212、0.486±0.148、0.495±0.103,GATA-3mRNA的相对表达量分别为0.596±0.249、0.474±0.101、0.550±0.119。实验组首次激发后10hT-bet m...     

小鼠耳蜗血管纹Na-K-2Cl联合转运子1在顺铂耳毒性发生时的改变

目的研究顺铂(cis-dichlorodiammine platinum,Cisplatin)耳毒性发生后耳蜗血管纹Na-K-2Cl联合转运子1(NKCC1)的表达情况,并初步探讨其机制。方法选取健康CBA/CaJ小鼠20只,随机分为对照组和实验组各10只,实验组动物连续腹腔注射顺铂3.5mg.kg-1.d-1,建立顺铂耳毒性小鼠模型,对照组注射等量生理盐水。以听性脑干反应(ABR)阈值作为评价听功能的指标,检测给药前后小鼠听功能的改变,并采用免疫组织化学(SP法)结合免疫荧光实验技术,观察对照组和实验组小鼠腹腔注射顺铂前后耳蜗血管纹NKCC1表达的变化。结果NKCC1在小鼠耳蜗血管纹主要表达于边缘细胞,而顺铂作用后血管纹边缘细胞的NKCC1表达明显减弱,图像分析显示两组平均灰度值差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论小鼠顺铂耳毒性作用后血管纹边缘细胞NKCC1的表达量明显减弱,这可能是顺铂耳毒性发生机制中的一个重要环节。     

不同剂量放射线对小鼠畸变产物耳声发射和外毛细胞Prestin蛋白表达的影响

目的 探讨单次不同剂量放射线照射对小鼠畸变产物耳声发射(DPOAE)和耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达的影响及放射线照射导致感音神经性聋的可能机制.方法 选取48只健康的Balb/c小鼠随机分成4组,每组12只(耳),分别给予0(对照组)、8(第1组)、12(第2组)、16 Gy(第3组)放射剂量的放射线照射,在照射后第7天对4组小鼠行DPOAE检测,同时分别采用Western-Blot分析和荧光实时定量中PCR检测4组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA表达的变化情况.结果 放射线照射第7天时,第1、2和3组小鼠3、4、6、8、10和12 kHz DPOAE幅值均较正常对照组小鼠明显降低(均P<0.05),正常对照组、第1、2和3组小鼠3、4、6、10、12 kHz DPOAE幅值依次减小(均P<0.05);第1、2和3组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达均较正常对照组小鼠下降(均P<0.05),正常对照组、第1组、第2组和第3组小鼠耳蜗组织Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达依次下降(均P<0.05).结论 单次放射线照射可损伤小鼠的听觉功能,使小鼠耳蜗外毛细胞Prestin蛋白及Prestin mRNA的表达下调,下调程度与照射剂量的大小呈正相关性;放射线致感音神经性听力损失可能与其导致耳蜗外毛细胞Prestin蛋白表达下调有关.     

H2-Ab1基因在变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中表达的研究

目的：研究H2-Ab1基因在变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中的表达并与正常小鼠比较。方法：选取24只8周龄成熟雌性129/sv小鼠随机分成实验组、对照组,每组12只。实验组采用卵清蛋白（OVA）致敏激发,建立小鼠变应性鼻炎模型,对照组以磷酸盐缓冲液代替OVA。造模成功后取小鼠鼻腔黏膜固定后染色评估鼻黏膜嗜酸粒细胞、肥大细胞浸润等病理学变化,检测小鼠血清H2-AB1蛋白、IL-4和IFN-γ细胞因子水平和OVA特异性IgE抗体浓度。取鼻黏膜提取RNA行实时荧光定量PCR检测H2-Ab1mRNA的表达情况。结果：与对照组相比,实验组小鼠鼻腔黏膜纤毛部分脱落,黏膜下可见嗜酸粒细胞及肥大细胞浸润,血清中OVA特异性IgE、IL-4及H2-AB1浓度显著增高,IFN-γ浓度降低（P〈0.05）,H2-Ab1mRNA表达水平增高。结论：H2-Ab1mRNA及H2-AB1蛋白在变应性疾病中表达增高,提示HLA-DQB1基因对变应性鼻炎发病机制中的Th1/Th2失衡可能起到重要的调节作用。     

水通道蛋白-1,2在大鼠内耳中表达的研究

目的 通过研究水通道蛋白1（aquaporin 1,AQP1）和水通道蛋白2（aquaporin 2,AQP2）在大鼠内耳组织中的表达及分布,为临床治疗梅尼埃病提供实验依据.方法选取6只健康雄性SD大鼠,断头后行内耳组织切片,用兔抗大鼠AQP1和AQP2的特异性多克隆抗体分别进行免疫组织化学染色,观察AQP1和AQP2在内耳组织中的表达情况.结果 AQP1在内耳组织中的分布有一定的规律,主要分布于血管纹的中间细胞,螺旋韧带Ⅲ型纤维细胞,基底膜以及圆窗膜,染色强度为中重度,前庭阶及鼓阶的外淋巴表面的细胞呈现较弱的阳性反应,其余部位为阴性反应.AQP2主要表达于螺旋韧带Ⅱ、Ⅳ及Ⅴ型纤维细胞,呈中重度染色反应,圆窗膜也有轻度表达,其余部位为阴性反应.结论 AQP1和AQP2分布于内耳中水及离子代谢的重要部位,提示两种蛋白可能参与内耳内环境稳态的调节.     

内耳免疫反应中细胞凋亡及Bcl-2与Bax的表达

目的 研究内耳免疫反应时细胞凋亡以及Bcl 2和Bax的表达情况,探讨自身免疫性内耳病发病机制。方法 选用健康SD大鼠60只,随机分成实验组30只（皮下注射Ⅱ型胶原与弗式佐剂）,佐剂组15只（皮下注射弗式佐剂）,对照组15只（予等量生理盐水）,免疫后进行畸变产物耳声发射（DPOAE）检测,扫描电镜形态学观察,DNA末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡及免疫组化检测Bcl-2和Bax的表达。结果 实验组DPOAE幅值下降（P<0.05）,部分毛细胞纤毛排列紊乱、簇状缺失, Corti器、血管纹和螺旋神经节可见TUNEL阳性染色, 且Bax/ Bcl-2表达比值上调,而对照组和佐剂组未见明显改变。结论 内耳免疫反应可诱导细胞凋亡发生, Bcl 2和Bax蛋白在其中起了重要调节作用。     

变应性鼻炎小鼠鼻黏膜白细胞介素-9及其受体mRNA表达水平的研究

目的　探讨白细胞介素9（interleukin-9,IL-9）及其受体IL-9R mRNA在变应性鼻炎小鼠鼻黏膜中的表达及其作用。方法　SPF级Balb/c小鼠16只,随机分为两组,每组8只。实验组卵清蛋白致敏建立变应性鼻炎小鼠模型;对照组使用生理盐水替代。每组随机取4只小鼠,病理检查证明造模成功。每组剩余4只小鼠取其鼻黏膜,实时定量PCR检测小鼠鼻黏膜中IL-9及IL-9R mRNA表达水平。结果  IL-9及IL-9R mRNA在对照组以及实验组中均有表达,实验组小鼠鼻黏膜中IL-9及IL-9R mRNA表达水平均高于对照组（P＜0.05）。小鼠鼻黏膜中IL-9 mRNA表达水平与IL-9RmRNA表达水平呈正相关（r =0.857,P＜0.05）。结论　IL-9及其受体IL-9R参与了变应性鼻炎发生发展中,并起到重要作用,该结果为进一步了解变应性鼻炎发病机制提供了新的视角,为变应性鼻炎靶向药物治疗提供新的线索。     

耳后入路圆窗膜显微注射小鼠耳蜗基因转染新途径的研究

目的研究腺病毒携带目的基因经小鼠耳后人路圆窗膜显微注射途径耳蜗转导的可行性,为以小鼠作为动物模型的内耳基因治疗提供实验基础和解剖学依据。方法12只C57BL／6J小鼠分为2组,实验组（8只）以重组腺病毒携带的增强型绿色荧光蛋白基因（enhanced green fluorescent protein,EGFP）、对照组（4只）以人工外淋巴液经耳后入路圆窗膜显微注射注入耳蜗内。分别于术后5、14天取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,在激光共聚焦显微镜下观察GFP表达。结果术后动物存活10只（每组死亡1只）。实验组转染后耳蜗底回基底膜及螺旋神经节上目的基因有表达,14天组强于5天组。对照组耳蜗未见荧光表达。结论耳后入路操作简单、损伤小、易于暴露圆窗龛。耳后入路圆窗膜显微注射腺病毒携带目的基因转导的方法能够将目的基因成功转导至耳蜗组织并表达。     

浆膜蛋白RTN1和RTN4基因在小鼠内耳的表达

目的 探讨浆膜蛋白RTN1和RTN4基因在小鼠内耳的表达。方法 采用5只成年小鼠内耳组织提取总RNA，逆转录后获得小鼠内耳细胞cDNA，根据RTN1和RTN4基因编码区序列设计的引物进行PCR扩增，通过PCR产物分析和DNA测序确定RTN1和RTN4是否在小鼠内耳细胞表达。结果 采用小鼠内耳组织总RNA，RT—PCR扩增出RTN1和RTN4基因部分编码区，扩增产物测序证实小鼠内耳中有RTN1和RTN4基因的表达。结论 RTN1和RTN4基因在内耳有表达，为RTN1和RTN4与连接蛋白26（connexin26）蛋白的互作关系提供了进一步的证据。浆膜蛋白RTN1和RTN4可能与连接蛋白26在听觉生理中起作用。     

听泡注射庆大霉素豚鼠内耳中的自由基

为探讨注射庆大霉素（ＧＭ）后内耳自由基的耳毒性作用，以求对氨基糖甙类耳毒性机制有更充分的了解，选取２１只豚鼠，其中１８只豚鼠予以听泡内注射５ｍｇ庆大霉素为实验组，３只豚鼠以空白液注射为对照组。注射４８小时后处死实验组中的９只和全部对照组，取出豚鼠的螺...     

水通道蛋白1在哮喘豚鼠嗜酸粒细胞迁移趋化中的作用

目的 观察豚鼠哮喘模型中水通道蛋白1(aquapofin 1,AQP)在嗜酸粒细胞(eosinophils,EOS)运动中的作用,探讨AQP1是否可以作为EOS趋化活性的标志.方法 选取健康雄性Hartley系豚鼠建立哮喘模型,分别提取外周血及支气管肺泡灌洗液中的EOS,应用原位分子杂交和免疫荧光及激光扫描共聚焦显微镜技术,从基因水平及蛋白质水平检测外周血及支气管肺泡灌洗液中EOS表达AQP1的情况.结果 AQP1在哮喘豚鼠外周血和支气管肺泡灌洗液的EOS内均有表达,外周血中AQP1 mRNA(平均灰度值92.904±3.290,-x±s,下同)和蛋白(荧光强度425.081±17.474)的表达强度均高于灌洗液中AQP1 mRNA(109.200±5.756)和蛋白(279.926±11.293)的表达强度,差异具有统计学意义(t值分别为9.519和27.020,P值均<0.05).结论 变应性疾病状态下,EOS可能通过合成更多的AQP1来加速其向炎性靶器官的运动,AQP1有望成为EOS趋化活性的标志之一.     

RAN干扰抑制AQP1表达对Hep-2细胞迁移能力影响的实验

目的通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Hep-2细胞中水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达,探讨AQP1对喉癌细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。方法构建AQPl特异性的siRNA重组质粒,免疫组化检测RNAi抑制AQP1表达的效果;分别用细胞基质黏附实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验检测细胞黏附、运动和侵袭能力。结果AQP1-siRNA重组质粒有效的抑制了Hep-2细胞中AQP1的表达。细胞基质黏附实验结果显示：Hep-2细胞与细胞外基质的黏附率,AQP1-siRNA实验组为（41．6±4．2）％与阴性对照组（43．6±3．9）％和空白对照组（45．2±4．0）％无明显差异（尸均〉0．05）;体外细胞运动和侵袭实验结果显示：Hep-2的穿膜细胞数,实验组分别为（36±3）和（23±4）个／高倍镜,显著低于空白对照组的（70±5）和（65±4）个,高倍镜以及阴性对照组的（72±4）和（69±4）个／高倍镜（P均〈0．01）,而后两组细胞间运动和侵袭能力方面差异均无显著性（P〉0．05）。结论AQP1 RNAi重组质粒能够阻断AQP1的表达,对Hep-2细胞的黏附力没有影响,但能够抑制喉癌细胞的运动和侵袭能力,与喉癌的转移机制密切相关。     

水通道蛋白-2及加压素的调控——水通道蛋白-2在内淋巴囊的表达和调控

水通道蛋白-2(AQP2)是一种加压素调控的四聚体通道蛋白，是水转运的特异性通道，主要表达于肾脏集合管主细管腔侧(顶端)的细胞膜上和细胞质内。研究发现不论是人类还是大鼠的内耳组织，水通道蛋白-2仅在内淋巴囊表达，其它内耳组织则未见表达；而AQP2是肾脏尿液的重吸收，充血性心衰的水潴留等生理、病理机制的重要环节。这个发现无疑对有关内耳水代谢疾病的研究，如梅尼埃病，开辟了一个新的方向。AQP2在肾脏和内淋巴囊的特异性表达，进一步揭示了耳肾相关的机制，也提示了内淋巴囊在耳肾相关中的重要地位。     

神经营养因子受体在顺铂中毒大鼠耳蜗螺旋神经节中的表达

目的 探讨神经营养因子受体TrkB、TrkC和p75在顺铂中毒大鼠螺旋神经节中的表达及意义.方法 成年Wistar大鼠50只,随机分为对照组(生理盐水5 ml/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d),用药1 d组(顺铂5 mg/kg,腹腔注射),用药3 d组(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续3 d),用药5 d组A(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第6天处死),用药5 d组B(顺铂5 mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5 d,第12天处死),每组10只,建立在体顺铂耳毒性模型.通过反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测耳蜗中TrkB、TrkC及p75的mRNA表达最,通过免疫组织化学染色测定TrkB、TrkC及p75蛋白在螺旋神经节巾的表达.结果 成功建立顺铂耳毒性大鼠模型,随着给约时间的延长,TrkB、TrkC和p75在螺旋神经节中的表达呈动态变化.TrkB的mRNA和蛋白表达(x±s,下同)在用药1 d及3 d组分别达到0.76±0.06、88.78±4.28及0.82±0.09、91.64±4.06,与对照组及其他用药组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);TrkC的mRNA和蛋白表达在用药1 d组达到0.80±0.06和89.66±2.76,与对照组及其他用药纽比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05);p75的mRNA和蛋白在对照组和各用药组的表达分别为0.64±0.04、55.16±3.10、0.77±0.04、78.46±3.86、1.01±0.09、105.02±6.61、1.18±0.09、111.10±6.08、0.51±0.04、42.74±±5.20,各用药组与对照组比较差异具有统计学意义(P值均＜0.05).结论 TrkB、TrkC在给药后早期有一过性表达增强,后期表达下降同时听力损失明显,p75在给药后表达逐渐增强.TrkB、TrkC可能参与顺铂中毒性螺旋神经节损伤后的修复过程;p75可能参与顺铂对螺旋神经节细胞的毒性作用,介导神经元凋亡.     

水通道蛋白1在小鼠内淋巴囊的超微结构定位

目的研究水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）在小鼠内淋巴囊表达的精确定位，进一步探讨AQP1在内淋巴囊的作用。方法选取正常昆明小鼠30只，断头分离内耳内淋巴囊，应用冰冻切片免疫荧光染色法研究AQP1在内淋巴囊的组织分布情况，借助免疫电镜观察AQP1在内淋巴囊的超微结构定位。结果AQP1在内淋巴囊上皮下结缔组织层有表达。在纤维细胞胞膜特别是细胞突起的胞膜上可见大量胶体金颗粒标记，而上皮细胞的胞膜未见胶体金颗粒的标记。结论富含AQP1的内淋巴囊上皮下组织可能与内淋巴的吸收及平衡调节密切相关。     

顺铂致聋后大鼠耳蜗螺旋神经元NeuroD的表达

目的检测神经分化因子NeuroD在大鼠耳蜗螺旋神经元顺铂损伤后的表达变化。方法通过免疫组织化学及Real-TimePCR技术,观察耳蜗螺旋神经元损伤1d、3d、5d后NeuroD的表达变化。正常成年SD大鼠32只随机分为对照组(生理盐水5ml/kg,1次/d,腹腔注射,连续5d),用药1d组(顺铂5mg/kg,腹腔注射),用药3d组(顺铂5mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续3d),用药5d组(顺铂5mg/kg,1次/d,腹腔注射,连续5d),每组8只,建立顺铂耳毒性模型。采用Real-TimePCR、免疫组织化学染色检测不同时间螺旋神经元NeuroD的mRNA及蛋白表达变化。结果成功建立顺铂耳毒性大鼠模型,随着用药时间的延长,神经分化因子NeuroD在耳蜗螺旋神经元中呈动态变化。NeuroD的mRNA和蛋白表达在用药1d及3d组分别为2.17±0.39、1.15±0.20及7.02±0.69、2.42±0.40,与对照组及用药5d组比较具有统计学意义(P值<0.01)。结论 NeuroD在用药1d后开始增加,3d后达到高峰,5d后下降;在用药早期有一过性表达增强,后期表达下降同时听力损失明显。表明NeuroD可能参与顺铂损伤螺旋神经元后的修复过程。