沉默线粒体核糖体蛋白L35基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响

目的：探讨慢病毒介导沉默线粒体核糖体蛋白L35（MRPL35）基因对人食管癌TE-1细胞生长的影响,并阐明其机制。方法：选择3种人食管癌TE-1、ECA109和KYSE150细胞,采用实时定量PCR法检测3种细胞中MRPL35 mRNA相对表达水平。食管癌TE-1细胞分为shMRPL35组和shCtrl组,分别加入沉默靶基因带有嘌呤霉素抗性的si-RNA慢病毒和带有嘌呤霉素抗性的阴性对照si-RNA慢病毒进行感染,建立稳定沉默MRPL35基因的食管癌细胞系,实时定量PCR及Western blotting法检测各组细胞中MRPL35基因沉默效率,采用CCK-8法检测各组细胞生长曲线,Annexin Ⅴ-PE/7AAD双染色后流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：3种食管癌细胞均表达MRPL35基因,3种细胞中MRPL35 mRNA表达水平比较差异无统计学意义（P>0.05）。实时定量PCR法和Western blotting法检测,shMRPL35组TE-1细胞中MRPL35 mRNA和蛋白表达水平明显低于shCtrl组（P<0.05）。与shCtrl组比较,shMRPL35组TE-1细胞生长速度明显降低（P<0.05）,凋亡率明显升高（P<0.01）。结论：沉默MRPL35基因可抑制食管癌细胞TE-1增殖,并通过凋亡途径发挥作用。     

中医引经药葛根对食管癌细胞系TE-1及ECA109AQP1mRNA表达的影响

目的 探讨中医引经药葛根对食管癌细胞系TE-1及ECA109 AQP1 mRNA表达的影响.方法 以5 g/L及10 g/L的葛根素注射液干预食管癌细胞系TE-1及ECA109,干预24 h后用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测AQP1 mRNA表达,观察表达结果.结果 AQP1在食管癌细胞系ECA109及TE-1中均有少量表达;葛根素可上调ECA109及TE-1细胞系AQP1表达.结论 葛根素通过上调AQP1 mRNA的表达,从而影响食管癌细胞水转运.     

辐射抗性食管癌细胞亚系TE-1R的建立及其辐射抗拒机制的研究

目的建立辐射抗性食管癌细胞亚系TE-1R,并探讨其辐射诱导的凋亡性及辐射抗性机制。方法采用分次、间歇照射的方法（2Gy,5次）诱导人食管癌细胞系TE-1产生具有稳定辐射抗性的细胞亚系TE-1R,显微镜下观察细胞形态学差异。以TE-1和TE-1R细胞为实验对象,给予6MVX射线单次照射（2Gy）,流式细胞仪分析细胞照射后的凋亡情况,RT—PCR法和Western Blot法分别检测食管癌TE-1、TE-1R细胞中复制蛋白AI（RPA1）mRNA和蛋白的表达情况。结果筛选出辐射抗性食管癌细胞亚系TE—1R。2Gy射线照射后12、24和48hTE-1R细胞的凋亡率低于TE—1细胞（P〈0．05）。RPA1 mRNA和蛋白在TE—1R细胞中的表达高于TE-1细胞（P〈0．05）。结论成功建立了辐射抗性的食管癌细胞亚系TE-1R,新的细胞亚系TE-1R比其亲本细胞系TE-1对射线更加抗拒,RPA1可能在食管癌细胞辐射抗性的修复中起着重要作用。     

11β-羟类固醇脱氢酶1型在小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系NIT-1中的表达

目的 探讨 11β-羟类固醇脱氢酶 1 型(11β-HSD1)在 C57BL/6J 小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系 NIT-1 中的表达及其生物学意义.方法 以11β HSD1 肝脏组织中的表达为阳性参照,RT-PCR 法和 Western blot 法检测小鼠胰腺组织中 11βHSD1 mRNA 和蛋白表达.细胞免疫化学法检测 NIT-1 细胞中 11β-HSD1 的分布与表达,RT-PCR 法和Western blot 法检测 NIT-1 细胞中 11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达.结果 ①在正常 C57BL/6J 小鼠胰腺组织中有 11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达,其表达量均低于肝脏组织(均P<0.01).②细胞免疫化学染色示 NIT-1 细胞胞质见棕黄色染色阳性颗粒,同时 NIT-1 细胞中有11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达.结论 小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系 NIT-1 中有11β-HSD1 基因表达,为研究糖皮质激素代谢对胰岛细胞功能的影响以及其它潜在的生理功能,提供了一条研究途径.     

miRNA-7过表达对食管癌细胞TE-1顺铂敏感性的影响及机制研究

目的:探讨miRNA-7过表达对食管癌细胞TE-1顺铂敏感性的影响及其可能机制。方法:选择食管癌细胞株TE-1,采用Lipofectmin 2000瞬时转染TE-1细胞,转染对照组瞬时转染miRNA-7-Negative Control,转染组瞬时转染miRNA-7-mimic,未转染的食管癌细胞株TE-1为空白对照组。采用实时荧光PCR方法检测3组表皮生长因子受体(EGRF)mRNA、miRNA-7水平;分别采用Western blot法和CCK-8法检测转染组和转染对照组EGRF蛋白水平及对顺铂敏感性的变化。使用免疫荧光标记法,在聚焦显微镜下观察转染对照组及转染组EGFR分布情况。结果:转染对照组与空白对照组EGFR mRNA、及miRNA-7水平差异均无统计学意义(P>0.05);转染组miRNA-7基因表达水平高于转染对照组与空白对照组(P<0.05),转染组EGFR mRNA基因表达水平显著低于转染对照组与空白对照组(P<0.05);在顺铂浓度为16.66、33.33、66.66μmol/L时,转染对照组的细胞抑制率均高于转染组(P<0.05);转染后48 h,转染对照组浆蛋白及核蛋白中EGFR的表达水平高于转染组(P<0.05);转染对照组EGFR荧光定位主要分布在胞浆及胞膜中,细胞阳性率为100.0%;转染组主要表现为EGFR高表达,但是在胞浆及胞膜中表达水平降低,细胞核呈现出约95.0%的阳性。经Spearman秩相关分析结果提示,miRNA-7与EGFR表达之间呈负相关(r=-1.462,P<0.05)。结论:miRNA-7过表达会降低食管癌细胞TE-1对顺铂的敏感性,其机制可能与EGFR核转位增多有关。     

下调miR-21可以增强食管癌TE-1细胞的放射敏感性

目的研究miR-21下调对食管癌TE-1细胞的放射敏感性的影响。方法采用慢病毒介导的方法将含有反义miR21表达基
因的载体转染至食管癌TE-1细胞系,嘌呤霉素筛选稳定下调miR21的食管癌细胞亚系,命名为TE-1-miR21-;荧光定量PCR检
测TE-1-miR21-中miR21的相对表达量;细胞克隆形成实验测定TE-1和TE-1-miR21-细胞的放射敏感性;RT-PCR和
Western-blot法测定TE-1和TE-1-miR21-细胞中β-catenin的变化;流式细胞术检测TE-1和TE-1-miR21-细胞中p75NTR+细胞的比例。
结果成功构建稳定下调miR21的食管癌细胞亚系TE-1-miR21-,荧光定量PCR结果显示miR21表达量明显下调;细胞克
隆形成实验提示TE-1-miR21-细胞较TE-1细胞的放射敏感性明显增强;RT-PCR结果分析显示,TE-1-miR21
-细胞与TE-1细胞的β-catenin mRNA的表达量无明显差异;Western blot的结果分析显示,TE-1-miR21- 细胞在接受高剂量照射（8Gy,10Gy）
时,β-catenin蛋白量明显下降;流式细胞仪分析结果显示,TE-1-miR21-细胞中p75NTR+细胞的比例较TE-1细胞明显降低。
结论下调miR21可以增强食管癌TE-1细胞的放射敏感性;下调miR21增强放射敏感性的机制可能与wnt/β-catenin信号通路的活化程度降低以及食管癌TE-1细胞中p75NTR+细胞比例减少有关。
     

DNA损伤修复通路因子53BP1在骨髓干细胞自我更新和分化发育中的作用

目的 探讨DNA损伤修复通路因子53BP1在骨髓干细胞自我更新及定向分化过程中发挥的作用.方法 构建53BP1全身敲除C57/6小鼠模型,免疫荧光染色检测53BP1在细胞中的定位,Western blotting对53BP1蛋白表达水平进行检测及鉴定;流式细胞术进行细胞分选和计数、细胞周期检测、以及细胞表面分子mark...     

53BP1在宫颈癌组织中的表达及其与P53和HPV感染的关系

目的 探讨P53结合蛋白1(53BP1)在各级宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌组织中的表达及其与P53、HPV感染的关系.方法 选取临床资料完整的60例宫颈癌、30例CIN和20例正常宫颈组织,分别采用免疫荧光法检测53BP1核聚形成情况、RT-PCR检测53BP1 mRNA的表达、免疫组化SP法检测P53蛋白和凯普HPV-DNA分型检测HPV感染情况.结果 53BP1核聚水平在20例正常宫颈组织均表达稳定型,30例CIN中70.0％表现为低DDR型,30.0％表现为高DDR型,60例宫颈癌中除2例缺失型外均表达高DDR型或强DDR型;53BP1 mRNA在宫颈癌组织中相对表达量明显低于正常宫颈组织(P＜0.05);P53蛋白在宫颈癌及CIN中的阳性率明显高于正常对照组(P =0.000,P=0.02);53BP1核聚类型与HPV感染以及P53蛋白表达情况均呈正相关(r =0.433,P=0.001;r=0.478,P=0.000),53BP1 mRNA表达水平与HPV感染呈负相关(r=-0.443,P=0.000).结论 53BP1作为抑癌基因参与了宫颈癌的发生发展,它的表达与HPV感染以及P53蛋白表达密切相关,提示其可能在HPV感染引起宫颈癌的发生发展中具有一定的作用.     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

接头蛋白SH2B1在食管癌中的表达及意义

目的:研究接头蛋白SH2B1在食管癌组织中的表达水平及其临床病理意义。方法:选取120例食管癌患者手术切除的标本中的食管癌组织、癌旁组织及正常组织,分别采用免疫组织化学SABC法及Western印迹检测SH2B1的表达水平,同时分析SH2B1在食管癌组织中的表达水平与临床病理特征的关系。采用RT-PCR和Western印迹检测SH2B1在食管癌细胞株TE-1,Eca-109和正常人食管上皮细胞株HEEC中的表达水平。结果:SH2B1蛋白在食管正常组织、癌旁组织、癌组织中表达逐步增强(P<0.05),并且SH2B1蛋白在食管癌组织中的表达水平与食管癌患者的肿瘤浸润程度、TNM分期、淋巴结转移密切相关(P<0.05),而与性别、年龄、饮酒与否、肿瘤类型、分化程度均无明显相关(P>0.05);SH2B1在食管癌细胞株TE-1,Eca-109和正常人食管上皮细胞株HEEC中均表达,但在食管癌细胞株TE-1,Eca-109中均较正常人食管上皮细胞株HEEC中表达明显增高(P<0.05)。结论:SH2B1在人类食管癌中过量表达,并可能与食管癌侵袭和转移密切相关。     

HOXA1基因反义寡核苷酸对食管癌细胞生长的影响

  目的  探讨同源异形盒A1(HOXA1)基因反义寡核苷酸（ASODN）对食管癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响及机制。  方法  采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测正常食管上皮细胞Het-1A和人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白的表达,筛选高表达的食管鳞癌细胞进行后续实验;设计合成HOXA1 ASODN链、正义寡核苷酸(SODN)链及无义寡核苷酸（N-ODN）链;将筛选出的高表达的食管鳞癌细胞分为HOXA1 ASODN组（5、10、15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞）、对照组（细胞常规培养,不进行细胞转染）、SODN组（细胞转染15 μmol/L的SODN）和N-ODN组（细胞转染15 μmol/L的N-ODN）。采用噻唑蓝(MTT)法、流式细胞术、Transwell小室分别检测细胞活力、凋亡率及侵袭迁移能力;Western blot检测HOXA1、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-AKT）、细胞增殖核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、B细胞淋巴瘤-2蛋白（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。  结果  与正常食管上皮细胞Het-1A比较,人食管鳞癌TE-1、EC9706和Eca109细胞HOXA1蛋白表达均升高,差异有统计学意义（P<0.05）。HOXA1蛋白在Eca109细胞表达最高,因此选用Eca109细胞进行后续实验。转染HOXA1 ASODN的Eca109细胞HOXA1蛋白表达降低（P<0.05）。随着Eca109细胞转染HOXA1 ASODN浓度及时间增加,Eca109细胞活力降低,与对照、SODN、N-ODN组比较差异有统计学意义（P<0.05）。15 μmol/L的HOXA1 ASODN转染Eca109细胞后,与对照组比较,细胞侵袭和迁移能力降低,凋亡率升高,p-AKT、PCNA和MMP-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高（P<0.05）。  结论  HOXA1基因反义寡核苷酸可抑制食管癌细胞增殖、侵袭和迁移能力,并诱导凋亡,机制与抑制磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路可能有关。     

DEC1参与顺铂诱导食管鳞癌的细胞衰老

目的 探究化学治疗药物顺铂对食管鳞癌细胞衰老的影响及其机制。方法 检测4种食管鳞癌细胞株(ECA109、EC9706、TE-1、TE-3)和一株正常的人类永生化食管上皮细胞株(Het-1a)中细胞衰老因子p53、分化型胚胎软骨发育基因1(differentiated embryo-chondrocyteexpressed gene1, DEC1)的mRNA和蛋白的表达情况;选取TE-3为研究对象,采用MTT方法检测不同浓度的顺铂(2、4、6、8、10 μmol/L)对TE-3增生的情况,并结合衰老相关的β半乳糖苷酶染色方法,筛选出诱导细胞衰老的最适浓度。以顺铂最适浓度(4 μmol/L)作用TE-3 48 h,采用Western blotting方法检测顺铂作用前后p53、DEC1蛋白水平的表达情况。结果 检测食管鳞癌细胞系中细胞衰老因子p53、DEC1的mRNA和蛋白的表达,发现食管鳞癌细胞与食管上皮细胞相比,p53的表达均有不同程度下降,DEC1的表达均有不同程度升高。用不同浓度的顺铂(2、4、6、8、10 μmol/L)作用TE3,MTT显示顺铂对细胞TE-3的增生抑制作用呈剂量和时间依赖性;结合衰老相关的β半乳糖苷酶染色,发现顺铂可诱导TE-3出现细胞衰老,并在顺铂4 μmol/L作用48 h时细胞衰老现象最明显;在顺铂4 μmol/L作用TE-3细胞48 h检测对照组与实验组的p53、DEC1的蛋白表达情况,发现实验组中TE-3的p53、DEC1的表达量分别升高了4.6倍(P=0.040)、2倍(P=0.032)。结论 顺铂可诱导食管鳞癌细胞呈现细胞衰老表型,细胞衰老相关基因p53和DEC1可能参与这一过程。     

人食管鳞状细胞癌细胞株MT-3 mRNA的表达

目的 研究人食管鳞状细胞癌细胞金属硫蛋白-3(MT-3)mRNA的表达.方法选取5种人食管癌细胞株,其中TE-1、TE-13、TTN和ECA-109为食管鳞状细胞癌细胞株,OE33为食管腺癌细胞株.应用RT-PCR技术检测各细胞株中MT-3 mRNA的表达.以正常人外周血单核细胞作为正常对照.结果 RT-PCR产物回收经DNA 序列测定表明为目的 基因MT-3 mRNA.凝胶电泳图像显示所有被测样本均有MT-3 mRNA表达;数据分析显示,人食管癌细胞株TE-1、TE-13、TTN、ECA-109和OE33中MT-3 mRNA的相对表达量分别为0.230±0.023、0.516±0.020、0.140±0.009、0.176±0.015和0.085±0.011,明显低于正常对照的0.762±0.026,经比较差异均有统计学意义(P<0.01).结论人食管鳞状细胞癌细胞株中广泛存在MT-3 mRNA表达水平下降.提示食管鳞状细胞癌的发生可能与MT-3 mRNA的异常低表达有关.     

THAP11通过抑制p53的泛素化影响食管癌细胞的增殖和凋亡

目的：探讨死亡相关蛋白(thanatos-associated protein,THAP)11对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其潜在 的机制。方法：采用蛋白质印迹法检测人食管上皮细胞Het-1A和人食管癌细胞(Eca109,TE-1和Ec 9706)中THAP11的 表达。将食管癌TE-1细胞分为空白对照(NC)组、阴性对照(LV-LC)组、TRA P11(LV-TRA P11)组,按分组处理细胞后, 采用MTT 法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,caspases试剂盒检测caspase-3和caspase-9的活性。采用体外泛素 化实验检测TE-1细胞的p53泛素化水平。结果：与Het-1A细胞相比,食管癌细胞中THAP11的表达显著下降(P<0.05)。 LV-THAP11转染食管癌细胞后,细胞活力降低(P<0.05),凋亡率升高(P<0.05),caspase-3和caspase-9活性升高(P<0.05)。 THAP11能够提高食管癌细胞中p53蛋白的表达(P<0.05)。与LV-LC组相比,转染THAP11后食管癌细胞中p53的表达上调 (P<0.05),MDM2调节的p53的泛素化也被抑制。结论：THAP11通过抑制p53的泛素化抑制食管癌细胞的增殖,促进食管 癌细胞的凋亡。     

MC1R在食管鳞癌细胞和组织中高表达

目的 通过分析MC1R在食管鳞癌细胞和组织中的表达水平及其与相关临床病理参数的相关性,探讨MC1R在食管鳞癌中的临床意义。方法 通过生物信息学分析MC1R在食管癌中的表达情况;以RT-PCR和Western blotting方法比较分析人食管上皮细胞BAr-T、人食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30、KYSE150、KYSE510、TE-1、TE-13、EC9706、人胃癌细胞SGC7901及19对食管鳞癌组织和对应癌旁组织中MC1R的表达水平;以IHC方法比较分析32对食管鳞癌组织切片和对应癌旁组织切片中MC1R的表达水平;使用t检验进行组间MC1R表达量的差异比较,使用Fisher’s精确检验分析MC1R表达水平与临床病理特征之间的关系。结果 生物信息学分析显示MC1R在食管癌组织中显著高表达（P<0.05）;食管鳞癌细胞ECA109、KYSE30、KYSE510、TE-13、EC9706和胃癌细胞系SGC7901中MC1R表达量高于食管上皮细胞（P<0.05）;食管鳞癌组织切片中MC1R相对表达量显著高于癌旁组织（P<0.05）。MC1R高表达现象主要存在于老...     

敲减cGAS基因对人食管鳞癌细胞TE-1增殖、迁移和凋亡的影响

［摘要］目的: 探究环鸟苷酸腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate adenosine monophosphate synthase,cGAS）蛋白在食管鳞癌组织中的表达及其对人食管鳞癌TE-1细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法: 免疫组化分析60例食管鳞癌患者癌组织与癌旁组织中cGAS的表达。荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测正常食管上皮细胞与食管鳞癌细胞中cGAS的表达。使用慢病毒构建稳定敲减cGAS的细胞系（TE-1）,荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证敲减效率。CCK8和克隆形成实验检测cGAS敲减后TE-1细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果： 免疫组化结果显示cGAS在食管鳞癌组织中的表达明显高于癌旁组织;食管鳞癌细胞系TE-1、KYSE 150中cGAS的mRNA和蛋白表达明显高于食管正常上皮细胞Het 1A。荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测结果显示,敲减cGAS后,TE-1细胞cGAS mRNA和蛋白水平的表达明显降低。CCK8、克隆形成实验、划痕实验和Transwell实验表明,敲减cGAS抑制食管鳞癌TE 1细胞增殖、迁移的能力,流式细胞分析显示敲减cGAS促进TE-1细胞凋亡。结论： 敲减cGAS在食管鳞癌细胞增殖、迁移中发挥抑制作用,有效促进细胞凋亡。     

2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖对人食管癌细胞的抗增殖研究

目的探讨2-(3-羧基-1-丙酰氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖(COPADG)对人食管癌细胞Eca-109和TE-1的增殖及其细胞周期的影响.方法采用体外细胞培养,通过MTT比色分析法观察不同浓度COPADG对Eca-109及TE-1细胞生长的抑制作用;流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响;透射电镜下观察细胞的形态学变化.结果COPADG能有效的抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,且存在时间及剂量依赖性(P＜0.01);不同浓度的COPADG作用48 h之后,流式细胞仪检测均显示G0/G1期细胞比例增加(P＜0.01),而S期细胞比例减少(P＜0.01),在Eca-109细胞中出现了典型的凋亡峰;电镜下可观察到凋亡的典型形态学变化.结论COPADG能有效抑制人食管癌细胞Eca-109及TE-1的增殖,改变其细胞周期分布,导致明显的G0/G1期阻滞,并在一定浓度下诱导肿瘤细胞凋亡.