缺氧诱导因子-1α基因转染对缺氧损伤HepG2细胞的保护作用

目的:观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染对HepG2细胞缺氧损伤的影响并初步探讨其作用机制。方法:腺病毒转染的人HepG2细胞常氧培养24h后分为4组:Ad-GFP转染常氧培养组(Ad-GFP transfected-normoxia组)、Ad-HIF转染常氧培养组(Ad-HIF transfected-normoxia组)、Ad-GFP转染低氧培养组(Ad-GFP transfected-hypoxia组)和Ad-HIF转染低氧培养组(Ad-HIF transfected-hypoxia组)。观察各组细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞内活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)含量和诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)活力。结果:Ad-HIF转染的HepG2细胞可高效表达HIF-1α。Ad-GFP transfected-hypoxia组的细胞活力显著低于Ad-GFP transfected-normoxia组(P0.05);Ad-HIF transfected-hypoxia组的细胞活力与Ad-HIF transfected-normoxia组比较无显著差异。Ad-GFP transfected-hypoxia组细胞内ROS含量显著高于Ad-GFP transfected-normoxia组(P0.05);Ad-HIF transfected-hypoxia细胞内ROS含量与Ad-HIF transfected-normox-ia组或Ad-GFP transfected-hypoxia组比较均无显著差异。Ad-HIF transfected-normoxia组和Ad-GFP trans-fected-hypoxia组细胞内NO含量和iNOS活力均显著高于Ad-GFP transfected-normoxia组(P0.05);Ad-HIFtransfected-hypoxia组细胞内NO含量和iNOS活力与Ad-GFP transfected-hypoxia组和Ad-HIF transfected-nor-moxia组比较无显著差异。结论:基础性HIF-1高表达可显著减轻缺氧时HepG2细胞的损伤程度,其机制可能与HIF-1高表达提高HIF-1调控的缺氧相关基因的基础表达水平和其产物含量有关;也可能与HIF-1高表达防止缺氧时ROS的过度增加有关。     

5-Aza-CdR抑制HepG2细胞DLK1基因表达及细胞生长

目的 探讨去甲基化药物5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对DLK1基因及肝癌细胞系HepG2增殖、侵袭的影响.方法 不同浓度的5-Aza-CdR及PBS作用HepG2细胞后,RT-PCR、Western blot检测DLK1基因及蛋白的表达水平;MTT、Transwell和流式细胞术检测HepG2细胞的生长、侵袭力及细胞周期的变化.结果 HepG2细胞经5-Aza-CdR处理后,DLK1 mRNA、蛋白表达量降低;MTT试验显示细胞生长速度依5-Aza-CdR浓度出现不同程度减慢;流式结果表明G1期细胞减少,S期细胞增加,出现S期阻滞;Transwell证实侵袭能力显著降低(P＜0.05).结论 去甲基化药物5-Aza-CdR能有效地抑制DLK1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞HepG2生长、增殖、侵袭能力.     

HIF-1α和HIF-2α对基因表达的调控

低氧诱导因子-1(hypoxia induc ib le factor-1,H IF-1)和H IF-2是调节氧稳态的核心转录因子,在机体的病理和生理过程中起关键作用,在肿瘤形成中也发挥非常重要的作用。H IF-1和H IF-2是由α和β两个亚基组成的异源二聚体,其活性主要由H IF-α亚基决定。虽然H IF-1α和H IF-2α在分子结构、DNA结合活性和转录活性方面有许多相似性,但两者在具体的目的基因表达调控上又明显不同,从而各自在许多与低氧有关的病理生理过程中发挥特异的作用。     

HIF-1α基因RNA干扰对肝癌HepG2细胞VEGF表达的抑制

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞缺氧反应网络的关键调节转录因子,而HIF-1α是决定HIF-1 活性的亚单位.HIF-1能在缺氧条件下促进血管内皮生长因子(VEGF) 依赖性的肿瘤血管形成.本研究构建了针对HIF-1α的pSUPER-EGFP siRNA表达载体,抑制HepG2细胞HIF-1α的表达.RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测结果显示,RNA干扰能明显抑制HIF-1α的表达;在缺氧培养条件下,HepG2细胞中VEGF有较高的表达,当HIF-1α基因表达被有效抑制,VEGF mRNA和蛋白质的表达随之大幅下降.本研究结果表明,HIF-1α是血管生成因子VEGF表达的调节因子,通过RNA干扰导致的HIF-1α基因抑制,能下调VEGF的表达,提示HIF-1α基因可作为抗抑制VEGF依赖性的肿瘤血管生成的一个靶点.     

TGF-β1基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响

目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1)基因转染对大鼠树突状细胞生物学特性的影响。方法 将TGF-β1基因导入体外培养的大鼠树突状细胞，经过G418筛选后，采用Western blot和水貂肺上皮细胞(Mv1)生长抑制试验，了解转染细胞TGF-β1的表达及其生物学活性。通过混合淋巴细胞反应，观察转染的树突状细胞对T淋巴细胞增殖的影响。结果 FGF-β1基因转染的树突状细胞可以分泌TGF-β1，而且具有特异性抑制Mv1增长的生物学活性。在混合淋巴细胞反应中，TGF-β1基因转染的树突状细胞对T淋巴细胞的增殖有抑制作用，而空载体pcDNA3对照组与未转染组的树突状细胞具有强烈的激发T细胞增殖的能力。结论 利用构建的TGF-β1表达质粒转染大鼠树突状细胞，转入的TGF-β1基因可以在树突状细胞内稳定表达，并且使树突状细胞的生物学特性发生相应的改变。     

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响

目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.     

HIF-1基因RNA干扰对肝癌HepG2细胞VEGF表达的抑制

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是细胞缺氧反应网络的关键调节转录因子,而HIF-1α是决定HIF-1活性的亚单位。HIF-1能在缺氧条件下促进血管内皮生长因子(VEGF)依赖性的肿瘤血管形成。本研究构建了针对HIF-1α的pSUPER-EGFP siRNA表达载体,抑制HepG2细胞HIF-1α的表达。RT-PCR和Western blot蛋白印迹检测结果显示,RNA干扰能明显抑制HIF-1α的表达;在缺氧培养条件下,HepG2细胞中VEGF有较高的表达,当HIF-1α基因表达被有效抑制,VEGF mRNA和蛋白质的表达随之大幅下降。本研究结果表明,HIF-1α是血管生成因子VEGF表达的调节因子,通过RNA干扰导致的HIF-1α基因抑制,能下调VEGF的表达,提示HIF-1α基因可作为抗抑制VEGF依赖性的肿瘤血管生成的一个靶点。     

基因芯片筛选HepG2与HepG2.2.15细胞中的差异表达基因

目的 探讨HepG2细胞及HepG2.2.15细胞中差异表达的基因并对其基因表达谱进行生物学信息分析.方法 用Trizol一步法提取HepG2细胞及HepG2.2.15细胞的总RNA,并纯化mRNA,反转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针,与基因芯片杂交;采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,把图像信号转化为数字信号,最后以差异为2倍的标准来确定差异表达基因.结果 在54614个基因表达谱的筛选中,发现有4462个基因表达水平显著上调,2592个基因表达水平显著下调.结论 HBV基因组及其表达产物对于肝细胞基因表达谱有显著影响,可能参与了肝癌的发生发展.     

RNAi沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2的影响

目的:探讨利用RNA干扰沉默WT1基因对人肝癌细胞HepG2细胞生长,凋亡的影响,为肝癌的基因治疗提供理论依据。方法:利用脂质体将siRNA真核表达载体转入HepG2细胞中,并检测转染效率;利用免疫细胞化学染色方法检测HepG2细胞中WT1蛋白水平的表达,测定基因沉默效果;用MTT法测定HepG2细胞生长曲线;电镜下观察细胞凋亡形态,流式细胞仪检测凋亡率。结果:利用脂质体为载体将siRNA真核表达载体转染HepG2细胞,转染率达70%以上,转染后细胞中WT1蛋白表达水平下降;RNA干扰沉默WT1基因可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。结论:靶向WT1的序列特异性siRNA可显著抑制WT1基因的表达;下调HepG2细胞WT1基因表达可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

华蟾酥毒基对肝癌HepG2细胞c-Src基因表达的影响

目的观察华蟾酥毒基作用于HepG2细胞后,c-Src基因的表达改变。方法华蟾酥毒基作用于HepG2细胞6 h后,提取细胞RNA和蛋白,半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测c-Src mRNA的表达变化,Western blot法检测c-Src蛋白的表达。结果华蟾酥毒基作用于HepG2细胞6 h后,c-Src mRNA和蛋白的表达均降低。结论华蟾酥毒基可在转录和翻译水平上抑制HepG2细胞c-Src的表达。     

细胞因子诱导HepG2细胞ICAM—1表达的研究

目的 研究IFN-γ、TNF-a和IL-1对HepG2细胞细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法 用IFN-γ、TNF-a和IL-1在体外诱导HepG2细胞表达ICAM-1,并用细胞FLISA检测HepG2细胞ICAM-1表达水平。结果 未经刺激的HepG2细胞ICAM-1表达水平很低。TNF-a、IL-1、IFN-γ刺激后,HepG2细胞ICAM-1表达均明显增强,其表达水平与细胞因子浓度呈一定的剂量依赖关系;随着细胞因子刺激时间的延长,HepG2细胞ICAM-1表达也逐渐增多。结论IFN-γ、TNF-a和IL-1等细胞因子能诱导体外培养HepG2细胞ICAM-1增强表达。     

人HepG2细胞低氧习服模型的建立

目的：建立人HepG2细胞的低氧习服模型，以探讨细胞低氧习服的机制。 方法： HepG2细胞在1%O2低氧条件下培养24 h后，正常氧压条件下培养24 h，以此为一个周期，连续低氧处理6个周期，期间以MTT法、透射电镜观察法、Northern杂交检测细胞达到低氧习服后，细胞增殖能力、细胞超微结构以及细胞内EPO基因表达的变化。 结果： HepG2细胞在1%O2低氧条件下培养48 h后，细胞增殖受到抑制，超微结构受到损伤；而经过6周期的间断低氧处理后，再低氧48 h，细胞的增殖能力恢复到常氧对照组水平，提示细胞耐氧能力明显升高，细胞的形态、胞浆突起数量、线粒体数目和结构都接近于常氧对照组水平。急性低氧能够引起HepG2细胞内EPO基因表达增强，而低氧习服的HepG2细胞再低氧48 h，EPO基因表达量接近到常氧对照细胞水平。 结论： HepG2细胞经过6个周期低氧处理后，细胞耐低氧能力增强，急性低氧促进EPO基因表达的作用受到抑制，细胞达到低氧习服状态。     

血小板因子4基因转染对肺癌细胞中血管生成因子基因表达的影响

目的：进一步探讨人血小板因子4（hPF4）抑制血管生成的作用机制,方法：构建含全长hPF4cDNA重组真核表达载体pcDNA3-hPF4,北朝鲜其转染到有肺巨细胞癌细胞系PLA801D细胞内,应用RT-PCR及免疫组化法观察肿瘤细胞自分泌的血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)、白细胞介素8（IL-8）等的mRNA和蛋白表达水平的变化,结果：导入pcDNA3-hPF4,PLA801D细胞能稳定表达hPF4mRNA,其VEGF、bFGF、IL-8的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,hPF4可直接调控VEGF、bFGF、IL-8等基因转录,影响其蛋白质生物合成,结论：提示hPF4可直接下调肿瘤细胞自分泌的VEGF、bFGF及IL-8等血管生成因子基因转录,抑制肿瘤细胞释放肿瘤血管生成因子,是hPF4抗血管生成抑制肿瘤细胞生长的机制之一。     

Fas配体对HepG2细胞凋亡的影响

细胞凋亡 (apoptosis)与肿瘤的发生、增殖与转移有着较为密切的关系 ,而Fas Fas配体 (FasLigand ,FasL)被认为是传导细胞凋亡信号的“死亡信号传递分子”。其中FasL主要存在于免疫活性细胞 ,通过与靶细胞膜Fas结合 ,导致靶细胞凋亡。为研究FasL在肝癌细胞凋亡过程中的作用 ,我们首先采用ELISA法对慢性乙型肝炎、肝硬化与肝癌患者血清中Fas及可溶性FasL(sFasL)水平进行了初步检测 ,结果显示肝癌患者血清中sFas明显升高 ,而FasL的浓度又明显低于慢性肝炎及肝硬化者 ,提示在肝癌的发生中 ,FasL及Fas与肝癌细胞凋亡有重要关系。我们…     

缺氧诱导因子1a基因转染心脏干细胞修复坏死心肌：应用前景

背景：心脏干细胞移植到心肌梗死区,可以有效改善心室重塑,提高心脏功能,但移植细胞在梗死区的缺氧微环境中存活率较低。研究表明缺氧诱导因子1α可在缺氧条件下稳定表达,同时增加心肌细胞的活性及存活能力。 目的：分别从心脏干细胞的特点,缺氧诱导因子1α保护心脏的作用机制,载体的选择及移植途径等方面来具体阐述缺氧诱导因子1α基因转染心脏干细胞治疗心肌梗死的研究进展。 方法：应用计算机检索CNKI和PubMed数据库中2000年1月至2015年1月关于心脏干细胞和缺氧诱导因子1α的文章,在标题和摘要中以“心脏干细胞、缺氧诱导因子1α、移植途径”或“Cardiac stem cells, Hypoxia Inducible Factor 1(HIF-1a), gene delivery”为检索词进行检索,最终选择关于心脏干细胞、缺氧诱导因子1、基因载体的37篇文献进行综述。 结果与结论：多项研究证实缺氧诱导因子1α可以在缺氧的环境中提高心脏干细胞的生存率。大量动物实验证实了心脏干细胞和缺氧诱导因子1α对梗死缺氧区域具有保护和修复作用。目前缺氧诱导因子1α基因转染心脏干细胞尚未有成功的报道,但并不影响研究者对相关领域的探索,相信在不久的未来,基因修饰心脏干细胞将会在临床得到广泛应用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

转化生长因子β1基因转染对大鼠骨髓树突状细胞免疫功能的影响

目的 研究人转化生长因子β1(TGFβ1)基因修饰对大鼠骨髓树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法 构建TGFβ1-pcDNA3质粒并转染未成熟DC。检测转染后DC的TGFβ1表达及其功能变化,输注1周后柃测TGFβ1-DC在受者脾和淋巴结的分布、T细胞凋亡水平及T细胞端粒酶表达。结果 TGFβ1-pcDNA3质粒转染DC能有效抑制DC的成熟和分化,并下调Dc的多种功能。TGFβ1基因转染不仅能降低DC对LPS的反应,同时抑制DC在MLR中刺激T细胞增殖的能力。TGFβ1-DC输注受者后,1周内可在脾和淋巴结内形成微嵌合,并有效诱导T细胞的凋亡,抑制T细胞端粒酶的活性和表达。结论 TGFβ1基因能有效抑制DC的多种功能,可用于诱导机体免疫耐受。     

mdr1基因转染的CIK细胞耐药性及杀伤活性的研究

目的:将多药耐药基因(mdr1)转入CIK细胞,观察转染前后其对紫杉醇的耐药性及对Lewis肺癌细胞杀伤活性的影响。方法:常规方法:培养CIK细胞,在细胞对数生长期,将mdr1的重组质粒转染CIK,通过RT-PCR鉴定耐药基因表达;MTT法检测CIK细胞对紫杉醇敏感性的变化,同时检测转染前后CIK细胞对Lewis肺癌细胞的杀伤活性变化;Western blot检测细胞中mdr1编码的P-gp蛋白的表达的变化;通过计算瘤重抑制率(TWI)检测转染前后的CIK细胞对Lewis肺癌移植瘤的抑制作用。结果:转染mdr1后的CIK细胞mdr1 mRNA阳性,同时P-gp的表达较转染前及转染空质粒的CIK细胞均有显著增高(P<0.05),转染后的CIK细胞对紫杉醇的耐药性有显著提高,但对Lewis肺癌细胞的杀伤活性无明显变化(P>0.05)。结论:将mdr1基因转入CIK细胞后,细胞获得了多药耐药性,同时保持了原有的对肿瘤细胞的杀伤活性。     

HIF-1α介导了间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外生物学行为的影响

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是否介导间歇低氧对人肺腺癌A549细胞体外活力、凋亡以及侵袭的影响。方法:采用体外转染方法将特异性针对HIF-1α的siRNA导入A549细胞,在间歇低氧条件下培养后通过real-time PCR和Western blot法检测HIF-1α及其下游Bcl-2、Bax、P53、P21、VEGF的mRNA和蛋白表达;通过MTT法和流式细胞术分别检测A549细胞的活力、凋亡及细胞周期;通过Transwell小室检测A549细胞的侵袭能力。结果:未转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧空白对照组(IHC组)、间歇低氧空载体对照组(IHE组)及间歇低氧阴性对照组(IHN组)]经间歇低氧干预后的HIF-1α、Bcl-2及VEGF表达均明显高于常氧对照组(RA组),Bax及P21表达均明显低于RA组(P0.05),而转染HIF-1α-siRNA的A549细胞[间歇低氧siRNA组(IHS组)]较IHC组、IHE组及IHN组经间歇低氧干预后的HIF-1α、BCL-2及VEGF表达均明显下调,Bax及P21表达较均明显上调(P0.05);所有间歇低氧组A549细胞的P53表达均较RA组升高(P0.05),但各间歇低氧组之间无显著性差异。IHC组、IHE组及IHN组A549细胞经间歇低氧干预后较RA组的细胞活力增强,凋亡率下降,侵袭力增强(P0.05),而IHS组A549细胞经间歇低氧干预后细胞周期被阻滞于G1期,较未转染组的细胞活力下降,凋亡增加,侵袭能力下降(P0.05)。结论:间歇低氧可通过HIF-1α途径调控其下游基因表达进而促进A549细胞的活力和转移;通过RNA干扰技术造成HIF-1α基因沉默可以抑制间歇低氧引起的A549细胞生长和转移。     

miR-181b对肝癌HepG2细胞增殖以及Bcl-2和SP1蛋白表达的影响

目的: 研究miR-181b对人肝癌G2细胞(HepG2)中B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)和转录因子SP1蛋白及mRNA表达的调节作用,探讨miR-181b对HepG2细胞增殖的影响。方法: 用人工合成的miR-181b相应的双链互补DNA片段,插入miRNASelect^TM pEGP-miR载体中,经测序鉴定后克隆microRNA的高表达质粒;用脂质体将miR-181b高表达质粒转染进HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选获得阳性克隆。用RT-PCR技术和Western blotting方法分别检测该细胞系中Bcl-2和SP1的mRNA和蛋白表达情况。用MTT法检测HepG2细胞增殖的变化情况。结果: Western blotting结果显示miR-181b能够减少Bcl-2和SP1蛋白质的表达,RT-PCR分析显示Bcl-2和SP1 mRNA表达减少。MTT显示转染后细胞的生长速率比未转染的细胞明显减慢。 结论: miR-181b抑制HepG2肝癌细胞增殖, 提示可能与其下调Bcl-2和SP1 的表达有关。     

BCL-2 基因转染的人胃黏膜上皮细胞株GES-1的建立与鉴定

目的构成BCL-2基因表达的人胃黏膜上皮细胞系GES-1细胞模型。方法质粒pcDNA3-BCL-2经酶切鉴定后,以脂质体法转染人胃黏膜上皮细胞GES-1,经G418筛选获得细胞克隆,荧光免疫组化法鉴定BCL-2基因表达阳性细胞。结果经酶切鉴定为携带BCL-2基因的质粒pcDNA3-BCL-2,荧光免疫组化结果显示7个克隆中,均有不同程度的BCL-2基因表达。BCL-2主要表达在胞质及细胞核膜。结论GES-1细胞为BCL-2表达阳性的细胞,为进一步研究BCL-2基因与胃癌的关系提供了理想的细胞模型。