改良大鼠心脏微血管内皮细胞的培养方法及鉴定

目的 建立一种分离大鼠心脏微血管内皮细胞的方法.方法 雄性SD大鼠2只,快速取出心脏,去除左室外约1/4层,充分剪碎剩余组织,Ⅱ型胶原酶和胰酶先后消化20~30 min,过滤并离心收集细胞,加入培养液置于细胞培养箱中培养.结果 原代细胞基本于接种后1~2 h已大部分贴壁,24 h细胞充分伸展,并进入对数生长期,细胞增殖迅速,培养3 d时,可见细胞汇合度达80%~90%,细胞长至融合后呈典型的＂铺路石＂或＂鹅卵石＂征.免疫细胞化学鉴定表明在分离培养的大鼠心脏微血管内皮细胞中有特定Ⅷ因子及CD31表达,体外小管形成实验证明大鼠心脏微血管内皮细胞具有小管形成的能力.原代周期3~4 d,传代周期2~3 d,P2代细胞纯度达95%以上.传至P4代仍未见细胞形态及分裂增殖活性下降.结论 本方法培养大鼠心脏微血管内皮细胞简单有效,重复性好,且获得细胞数量多、纯度高,有利于实验人员掌握.     

大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养

目的采用大鼠脂肪间充质干细胞与壳聚糖支架体外联合培养为颅脑损伤大鼠模型神经修复提供种子细胞。方法取SD大鼠附睾周围脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞,传至第3代流式细胞仪检测细胞表面标记CD29、CD90、CD44表达;冻干燥法制备壳聚糖支架材料,再取第5代细胞以2×106/m L的密度接种于壳聚糖三维支架上,促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果。结果分离培养的脂肪间充质干细胞表面标记CD29、CD90、CD44阳性表达率分别为91.05%、92.76%、96.56%,达到理想的纯度;制备的壳聚糖三维支架具有合适的三维多孔结构;培养基诱导7 d左右可见检测神经细胞特异性标志(巢蛋白和β-tubulinⅢ)的表达,分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接。免疫荧光染色鉴定结果证实,神经球高表达巢蛋白(Nestin)阳性率(65.23±0.98)%,分化细胞β-tubulinⅢ阳性率(62.35±5.71)%,微管相关蛋白2(MAP2ab)阳性率(12.87±2.63)%。结论大鼠脂肪间充质干细胞联合壳聚糖支架培养可在体外培养得到较高比例神经细胞特异性标志的Nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现,该特异性标志表达的细胞用于大鼠颅脑外伤模型神经修复实验。     

大鼠脂肪干细胞的分离培养及向软骨表型分化的实验研究

目的探讨从大鼠的脂肪组织中分离、培养脂肪干细胞（ADSCs）并定向诱导分化为软骨细胞的可行性。方法取Wistar雄性大鼠脂肪组织培养,传代。并用免疫荧光法检测传代ADSCs表面抗原CD29表达。取第3代ADSCs用含有TGF－β4,的培养基定向诱导培养,行Ⅱ型胶原免疫组化染色进行检测鉴定。结果显微镜下可见脂肪干细胞的形态特点。并经免疫荧光法进行检测证实。定向诱导ADSCs向软骨细胞分化,观察细胞形态变化,并通过Ⅱ型胶原免疫组化检测,证实向表达II型胶原的软骨细胞表型分化的可行性。结论证实大鼠脂肪组织中存在干细胞来源细胞。并且细胞在体外培养条件下生物学性状保持稳定。通过外源性转化生长因子TGF－β定向分化、诱导、培养可表现出软骨细胞的部分特性。证实脂肪干细胞具有向软骨细胞定向分化的能力。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外生长增殖特点的实验研究

目的 了解应用全骨髓贴壁法分离的大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长、增殖特点,以及接种密度、培养时间对细胞增殖的影响,为预防和治疗机体退行性疾病等提供多潜能的种子细胞.方法 通过全骨髓贴壁法分离SD大鼠BMSCs,在体外条件下培养,应用倒置显微镜观察细胞形态学特征及流式细胞仪鉴定、检测大鼠BMSCs表面标志抗原,并通过分析对接种于96孔板不同接种密度(2×103、5×103、1×104个细胞/ml)连续培养10 d细胞生长曲线的特点,研究接种密度和培养时间对BMSCs生长、增殖的影响.结果 流式细胞仪分析CD29细胞阳性率为97.68%(7607/7788),CD34、CD45细胞阳性率分别为7.93%(661/8340)、2.76%(215/7788),符合BMSCs表面标记物表达特征.通过换液及消化传代,3代以上的BMSCs较为均一纯化,呈典型的旋涡或放射状生长,约传代至7～10代时出现细胞衰老并衰老细胞逐渐增多;中等密度(5×103个细胞/ml)接种细胞的生长曲线呈较典型的S形曲线.第1、2天为潜伏期;第3～5天为对数生长期;第6天细胞数目进入平台期;第8～10天细胞数量稍有下降.结论 全骨髓贴壁法是获得BMSCs较为简便有效的方法,且中等量接种密度更有利于细胞增殖,可获得更多的种子细胞.     

新生大鼠海马神经干细胞的培养与传代

目的：探讨新生大鼠海马神经干细胞（Neural Stem Cells,NSCs）体外分离培养的条件和传代的新方法。方法：从新生大鼠海马中分离神经干细胞,采用无血清培养技术,在表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblastgrowth factor,bFGF）和B27联合作用下使其不断增殖克隆,采用神经小球分离试剂盒进行传代,利用免疫荧光染色的方法对培养的细胞进行鉴定。结果：从新生大鼠海马分离的细胞群可不断增殖形成细胞克隆球,并能稳定传代,呈nestin阳性表达,且具有多向分化能力。采用神经小球分离试剂盒传代的细胞球生长快,数量多,体积大,折光性好。结论：利用无血清技术和特定生长因子,可以使来源于新生大鼠海马的NSCs在体外扩增,利用大鼠神经小球分离试剂盒可以有效地进行传代,稳定高效地培养出NSCs。     

昆明鼠胚胎干细胞系建立中原代克隆生长及其传代方法的研究

目的:探讨昆明鼠胚胎内细胞团分离方法、原代干细胞克隆分离时机及干细胞传代方法对干细胞建系效率的影响。方法:取昆明鼠3.5d囊胚建胚胎干细胞系,比较全胚培养法与免疫外科法两种内细胞团分离方法对胚胎干细胞建系效率的影响,观察原代克隆的分离时机,机械法传代和酶消化传代对胚胎干细胞建系效率的影响。结果:全胚培养法30个囊胚建系3个,免疫外科法32个囊胚建系4个,两组均可以有效地形成胚胎干细胞系;昆明鼠原代干细胞克隆分离最佳时机是增殖4～6d;5代以前的干细胞以机械传代方法较好,5代后用酶消化法传代效果较好。结论:全胚培养法和免疫外科法均能有效建立昆明鼠胚胎干细胞系,采用机械化与酶消化法相结合传代更适合昆明鼠干细胞建系。     

关于改良差速贴壁法原代培养大型成年哺乳动物绵羊肌源性干细胞的研究

目的探讨改良差速贴壁法原代培养成年大型哺乳类动物绵羊肌源性干细胞(muscle-derived stem cells,MDSC)的可行性。方法改良差速贴壁法分离培养原代绵羊MDSC,并通过免疫荧光检测及western blotting法检测干细胞抗原-1(stem cell antigen,Sca-1),Desmin及CD 34表达情况。Western blotting法检测贴壁细胞(pp)1~pp6的Desmin表达情况来反应纯化情况。结果利用改良差速贴壁法可以成功分离培养出绵羊MDSC,该干细胞Sca-1,Desmin及CD 34表达均阳性,贴壁慢的细胞Desmin表达增高,在pp6中表达最高。结论改良差速贴壁法可以成功分离培养原代绵羊MDSC,且可扩增至20代。     

克隆筛选法体外纯化骨髓间充质干细胞

目的尝试使用简单的克隆筛选法来纯化骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）并进行鉴定。方法对早期分离培养的BMSCs，采取低密度接种（10／cm^2），待有单克隆形成，用细胞刮除去其他细胞，将克隆的细胞以低密度接种，待再次有单克隆形成时可重复以上操作，反复进行筛选。对筛选的BMSCs生物学特性进行观察，FACs鉴定BMSCs的标记物的表达，并进行成脂、成骨诱导试验。结果采用克隆筛选法培养BMSCs在传代筛选2—3代后即可获得形态均一的细胞群，FACs鉴定细胞高表达BMSCs的阳性标记物（CD2998．8％，CD9098．4％），低表达BMSCs的阴性标记物（CD312．6％，CIM53％）。BMSCs能被高效地诱导向脂肪和骨分化。结论本实验采用的克隆筛选法可在短期内获得高纯度的BMSCs，方法简单易行而效率高。     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的优化

目的探索脐血来源的间充质干细胞体外分离培养的更优方法。方法无菌条件下抽取正常足月剖宫产胎儿的脐带血,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞。50份脐血分为对照组和改良组,每组25份,分别以1.5×10^7/ml的细胞密度接种于25 cm^2培养瓶中。对照组贴壁3 d后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液;改良组贴壁0.5 h后弃上清,去除未贴壁细胞,更换新鲜培养液。结果对照组杂细胞较多,最终成功培养出8份脐血间充质干细胞;改良组杂细胞较少,最终成功培养出18份脐血间充质干细胞。经流式细胞仪检测脐血间充质干细胞的免疫表型,结果显示,所培养出的脐血间充质干细胞不表达或极弱表达CD34、CD106等造血细胞标志,稳定地高表达CD29、CD44、CD105等间充质细胞相关的表面抗原标记物。结论采取脐血单个核细胞贴壁0.5 h弃上清更换新鲜培养液可以明显提高脐血间充质干细胞的培养成功率,其结果优于脐血单个核细胞贴壁3 d弃上清更换新鲜培养液。     

食蟹猴精原干细胞分离纯化及鉴定

目的掌握食蟹猴精原干细胞 (spermatogonial stem cells,SSCs) 体外培养生长特性,建立食蟹猴精原干细胞分离、纯化、培养及初步鉴定的方法。 方法经手术获取2岁14天食蟹雄猴单侧睾丸,采用三步酶消化法分离获得单细胞悬液和差异贴壁法富集精原干细胞。将细胞培养于经丝裂酶素C处理的STO细胞层上,使用添加神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、GDNF家族受体α (GFRa1) 三种重要生长因子的无血清培养液体外培养,20d后采用CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR对培养的食蟹猴细胞进行SSCs初步鉴定。 结果通过差异贴壁法分离纯化富集的SSCs,接种到丝裂霉素C处理的STO饲养层细胞上,第2天开始分裂增殖。用含有生长因子的培养基培养2 d细胞形成小集落,5 d后细胞集落明显。培养20 d后,SSCs呈葡萄串状细胞簇,符合SSCs的形态特征,这些细胞经CDH1标记分子免疫荧光染色和RT-PCR均呈阳性表达。 结论本研究成功建立食蟹猴精原干细胞的分离纯化及鉴定体系。基于STO饲养细胞的添加GDNF、bFGF和GFRa1三种生长因子的无血清培养体系可用于食蟹猴精原干细胞培养,CDH1可作为食蟹猴精原干细胞鉴定的标志物。     

槲皮素逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素耐药及其相关机制的研究

目的 探讨槲皮素（quercetin,Que）逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素（doxorubicin,Dox）耐药及其相关机制。方法 用不同浓度的槲皮素处理MCF - 7细胞及其阿霉素耐药的MCF - 7/dox细胞,MTT法筛选无毒剂量的槲皮素用于实验。用无毒剂量的槲皮素联合不同浓度的阿霉素处理MCF - 7和MCF - 7 /dox细胞,MTT法检测细胞增殖率,Transwell法检测细胞侵袭能力,流式细胞法检测细胞凋亡率和人乳腺癌干细胞表面标志物CD44+/CD24 - /low的表达, Western - blot检测人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10 ,PTEN）及磷酸化的丝氨酸/苏氨酸激酶（Phosphorylated serine/threonine kinases,p - AKT）的表达。结果 与MCF - 7细胞组相比较,MCF - 7/dox细胞组的乳腺癌干细胞表面标志物CD44+/CD24 - /low表达增高(P＜0.01),且PTEN的表达降低、p - AKT的表达升高(P＜0.05);与单用阿霉素组相比较,阿霉素与槲皮素联合应用能抑制细胞增殖和侵袭、诱导细胞凋亡、杀死肿瘤干细胞,并能上调PTEN、下调p - AKT的表达。结论 槲皮素能有效逆转人乳腺癌MCF - 7细胞阿霉素耐药,其机制可能与槲皮素协同阿霉素杀死人乳腺癌干细胞,调控PTEN/AKT信号通路有关。     

改良的人脐带间充质干细胞培养方法

目的:建立人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法,探讨hUCMSCs的成脂成骨分化潜能。方法:用酶消化法、传统组织块法和改良组织块法从人脐带中分离间充质干细胞,流式细胞仪检测其免疫表型;用不同的培养体系诱导hUCMSCs向成骨细胞及成脂细胞分化,并对其进行鉴定。结果:改良的hUCMSCs培养方法培养细胞纯度更高,在相同的培养时间内,改良组织块法所获得的细胞数量是酶消化法的2～3倍,是传统组织块法的20～30倍,细胞呈长梭形生长;高表达CD73、CD90、CD44、CD105,不表达CD31、CD45、CD34;茜素红染色及油红O染色证实了hUCMSCs可分化为脂肪细胞和成骨细胞。结论:建立了hUCMSCs的培养新方法,证实了hUCMSCs的增殖能力和多向分化潜能,为其治疗应用提供支持。     

无机砷暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响

目的 探究无机砷(iAs)暴露对人脐带间充质干细胞的增殖及分化的影响,为iAs的发育毒性研究提供实验依据。方法 以具有多向分化潜能的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)为细胞模型,用不同浓度的亚砷酸盐(NaAsO₂)染毒hUCMSCs 24 h,检测细胞活力;用5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs 24 h,做细胞生长情况检测、多能性标志蛋白CD45、CD105及多能性标志基因Oct4、Nanog的检测,彗星实验检测DNA损伤情况、细胞分化实验检测;染毒后hUCMSCs的向成脂、成骨和成软骨分化及其特异性基因PPARγ、ALP、COMP表达量的检测。采用独立样本t检验进行两组间均数差异的比较,采用单因素方差分析进行多组间均数的比较。结果 随着NaAsO₂浓度的升高,hUCMSCs存活率逐渐降低(F=13.650,P<0.001);5μmol/L的NaAsO₂染毒hUCMSCs,对其细胞增殖的没有显著影响(t=0.507,P=0.615);多能性标志蛋白CD45、CD105仍有表达,多...     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

人脐带间充质干细胞的分离、鉴定及向肝细胞的定向诱导分化

目的 分离纯化人脐带间充质干细胞(UCMSCs),探讨UCMSCs是否能在体外条件下被诱导成为肝细胞样细胞.方法 无菌条件下采集健康新生儿脐带,采用胰酶、胶原酶顺序消化法分离单个细胞,通过贴壁培养方法分离纯化间充质干细胞(MSCs).从形态、表面抗原、成脂肪细胞和成骨细胞分化潜能三方面进行鉴定.随后通过细胞因子诱导的方法将间充质干细胞诱导为肝细胞样细胞.结果 从人脐带中成功分离纯化得到UCMSCs,细胞呈纤维状;表达CD44、CD105、CD73、CD90,不表达与造血细胞和内皮细胞相关的CD34、CD45、CD31等标志物,不表达与移植物抗宿主病相关的HLA-DR等分子;在不同细胞因子作用下,可以被诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞和卵圆形肝细胞样细胞.结论 人脐带中含有较丰富的MSCs,在体外条件下可以被诱导为肝细胞样细胞.     

亚硒酸钠抑制人胃癌BGC823细胞的作用及其机制探讨

目的观察亚硒酸钠对体外培养的人胃癌BGC823细胞增殖的抑制作用及其作用机制。方法用不同浓度(0、4.0、8.0、10.0μmol/L)的亚硒酸钠处理BGC823细胞24h后,采用四甲基偶氮噻唑蓝比色法(MTT法)检测亚硒酸钠对细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪PI染色检测细胞周期,AnnexinV/PI双染法定量检测BGC823细胞凋亡率,FAS蛋白染色流式细胞仪定量检测各实验组细胞间FAS蛋白表达,荧光显微镜观察DAPI染色细胞形态。结果亚硒酸钠可明显抑制BGC823胃癌细胞的增殖,呈剂量依赖性;亚硒酸钠可阻滞细胞于S期和增加BGC823胃癌细胞凋亡率并随剂量增大作用增强;DAPI染色观察到亚硒酸钠给药组出现细胞核浓缩、边缘化以及凋亡小体等细胞凋亡的形态特征;亚硒酸钠可呈剂量依赖地增强FAS蛋白表达。结论亚硒酸钠可显著抑制人BGC823胃癌细胞的增殖,使细胞阻滞于S期,并可诱导细胞凋亡,其机制可能与上调FAS蛋白有关。     

乳腺癌患者外周血ALDH1~(high)CD44~+CD24~(-/low)细胞含量变化及其临床意义

目的:检测乳腺癌患者外周血ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量的变化,探讨其与乳腺癌发生的关系及临床意义。方法:观察对象为46例Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者和12名健康女性志愿者(对照组)。采用流式细胞仪检测、分析各组外周血中ALDH1high细胞和ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量及其变化情况。结果:①所有样本均能检出ALDH1high细胞,各组间均数比较差异无统计学意义(P>0.05);②Ⅳ期乳腺癌组的外周血ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05),而其他各组间比较差异无统计学意义(P>0.05);③Ⅳ期乳腺癌患者原发癌灶免疫组化结果各不相同,但均可在外周血中检出ALDH1highCD44+CD24-/low细胞。结论:①各组中的ALDH1high细胞含量无显著差异,说明ALDH1具有普遍干细胞性质;②ALDH1highCD44+CD24-/low细胞含量与乳腺癌的发生有明显相关性。③ALDH1highCD44+CD24-/low细胞与乳腺癌的免疫分型无相关性。     

两株人胚胎干细胞的无饲养层扩增

目的:建立两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的无饲养层的培养体系,观察条件培养基所需的饲养层密度,并探索最佳的传代方式。方法:两株人胚胎干细胞hES-846XX和hES-1846XY分别使用不同密度(3×105/mL、6×105/mL和1.2×106/mL)获得的条件培养基(CM)在无饲养层培养体系培养12代以上,用机械分离法和Ⅳ型胶原酶法进行传代,观察比较结果并对所得hESCs鉴定。结果:6×105/mL～1.2×106/mL之间的密度都是合适密度;Ⅳ型胶原酶在长期传代中优于机械法传代;所得细胞维持干细胞未分化状态和全能性。结论:无饲养层的培养体系可以用于中国胚胎干细胞培养,两株中国人胚胎干细胞(hESCs)的倍增周期、所需饲养层密度及分化率等方面与国外hESCs有明显差别。