小鼠视网膜神经节细胞的纯化培养

目的 建立小鼠视网膜神经节细胞的体外纯化培养方法。方法 实验研究。采用Thy-1.2单克隆抗体免疫吸附法,将8～ 12只生后4～6d的C57BL/6小鼠视网膜消化后,制成视网膜神经细胞混合悬液,应用胶质细胞特异性抗体CD11b室温孵育后,去除混悬液中的胶质细胞,应用特异性抗体Thy-1.2吸附混合悬液中的视网膜神经节细...     

提前光刺激对小鼠神经节细胞感光视蛋白melanopsin表达的影响

目的探讨提前光刺激对小鼠神经节细胞发育不同阶段感光视蛋白melanopsin表达的影响。方法对出生4dC57BL/6J小鼠右眼建立提前开睑接受光刺激模型，左眼作为自身对照，应用免疫荧光、RT-PCR和Western blotting方法比较小鼠5天龄、6天龄、7天龄、14天龄和90天龄时提前开睑组和对照组视网膜感光视蛋白melanopsin的分布及转录和翻译水平的表达变化。结果Melanopsin阳性细胞在5天龄时就已经在视网膜上明显表达，随着小鼠视网膜发育的逐渐成熟，提前开睑组和对照组melanopsin表达均逐步下降；组内比较，在6天龄、7天龄、14天龄时melanopsin提前开睑组表达量均少于各自对照组，差异具有显著性（P〈0.05）：90天龄时melanopsin表达最少，且提前开睑组和对照组差异无显著性（P〉0.05）。结论小鼠14天龄之前是melanopsin阳性神经节细胞发育的关键阶段，在此阶段内，melanopain阳性神经节细胞数量逐渐减少，提前开睑光刺激使melanopsin阳性神经节细胞数量进一步减少。本研究结果有助于揭示melanopsin在视网膜神经节细胞发育过程中的表达变化及其可能的分子机制。     

大鼠视网膜神经节细胞中Aβ-42表达的研究

以往研究显示,β-淀粉样多肽(amyloid-β-peptide,Aβ)主要表达在神经再生性疾病的神经元中,如Alzheimer’s病(AD)和青光眼,正常神经元中很少见到。本研究主要目的是观察大鼠视网膜神经节细胞中Aβ-42的表达。所有大鼠分为7个实验组:分别为出生后3d、6d、13d、15d、25d、60d和90d大鼠。生后15d和25d组大鼠进一步分为12h光照/12h黑暗组和24h黑暗组。所有大鼠眼视网膜包埋后进行冰冻切片,免疫细胞化学染色后检测Aβ-42的表达。结果发现:生后13d以内各组大鼠未发现Aβ-42的表达,生后15d以上各组大鼠均可检测到Aβ-42的表达。同时也发现,随着鼠龄的增加,大鼠视网膜神经节细胞Aβ-42的表达逐渐增加,生后60d达到高峰。此外,仅24h黑暗组大鼠视网膜未检测到Aβ-42的表达。本研究第一次指出,正常视网膜神经节细胞表达Aβ-42,并且Aβ-42的表达需要光线照射。本研究结果提示,Aβ-42可能在视力的发育中发挥重要作用。     

大鼠视网膜神经节细胞中内源性α晶状体蛋白的表达及其变化规律

目的 观察大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中内源性d晶状体蛋白的表达情况.方法 原代培养大鼠RGCs,取胰酶消化后即刻的细胞以及原代培养1～7 d的细胞行免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜观察,并通过RT-PCR方法检测原代培养1～7 d、9 d、12 d的RGCs中内源性α晶状体蛋白mRNA的表达情况.结果 免疫荧光染色结果显示在原代培养后2 d的RGCs中,内源性α晶状体蛋白在少许RGCs膜上表达阳性;原代培养3～5 d,内源性α晶状体蛋白表达明显增强并达到高峰,呈戒环状分布,然后逐渐降低.mRNA检测结果表明,在RGCs原代培养过程中均有内源性α晶状体蛋白的表达,且在培养第3-5天其表达达到高峰,后逐渐降低.结论 大鼠RGCs可表达内源性α晶状体蛋白,在离体培养的RGCs中呈一过性高表达,其表达可能与细胞增殖及细胞活力有关.     

DJ-1蛋白对视神经钳夹伤后小鼠视网膜神经节细胞及视功能的影响

目的:观察Park7基因编码的DJ-1蛋白对小鼠视神经钳夹损伤（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视功能的影响。方法:健康雄性C57BL/6J小鼠37只和116只分别随机分为正常组、ONC 2 d组、ONC 5 d组、ONC 7 d组和对照组、Park7组、Park7-ONC组、ONC组、绿色荧光蛋白（GFP）-O...     

Math5对视网膜神经节细胞的分化调控

视网膜神经节细胞是视网膜发育中第一个产生的神经元,它的分化由视网膜前体细胞的内部信号和视网膜微环境的外部信号共同决定。Math5是Ath5在小鼠的表达形式,后者是视网膜神经节细胞分化的必要基因,但视网膜神经节细胞的分化还需要其他基因共同参与。本文就Math5 对视网膜神经节细胞的分化调控及其与其他基因的相互作用作一综述。     

蛇毒神经生长因子对鼠视网膜神经节细胞微管相关蛋白-1B的影响

目的 通过对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)微管相关蛋白-1B(microtubule associated protein-1B,MAP-1B)的研究,观察蛇毒神经生长因子(venom nerve growth factor,vNGF)在鼠视神经夹伤后对RGCs的保护作用.方法 将Wistar大鼠40只随机分为实验对照组、实验治疗组,每组20只.制作视神经夹伤模型,用头部宽1 mm的微型血管夹夹伤大鼠右眼视神经后,实验治疗组向右眼玻璃体内注入vNGF 100 BU(0.025 mL).实验对照组向右眼玻璃体内注入0.025 mL平衡盐液.2组的左眼均未做任何处理,作为正常对照组.于损伤后3 d、7 d、14 d、30 d、60 d取材,在光镜下计数RGCs,透射电镜观察不同时间段各组视网膜形态学变化,并进行MAP-1B免疫组织化学染色分析.结果 光镜下,伤后3～30 d实验治疗组的RGCs数目高于实验对照组,差异有显著统计学意义(P＜0.01),伤后2组RGCs数目均比正常对照组少,差异有显著统计学意义(P＜0.01).伤后60 d,实验治疗组与实验对照组之间的RGCs数目差异无统计学意义(P＞0.05),实验治疗组、实验对照组与正常对照组差异有显著统计学意义(P＜0.01). 电镜下,伤后14 d实验治疗组视网膜微管数目比实验对照组多,排列也较整齐.免疫组织化学结果实验治疗组2周内MAP-1B表达逐渐增强,1个月时明显减弱;实验对照组3 d时有MAP-1B表达,到2周时表达明显减弱.结论 在视神经损伤早期,vNGF能减轻视神经夹伤后微管的损坏,提高MAP-1B的表达强度,提高RGCs的存活数量,对RGCs有明显的保护作用.     

鼠青光眼模型视网膜神经节细胞中热休克蛋白27表达的研究

目的探讨热休克蛋白27(HSP27)在鼠青光眼模型视网膜神经节细胞(RGCs)中的表达及其与血清中相应抗体的关系。方法将49只Wistar大鼠随机分为高眼压组(32只鼠)、sham对照(假手术)组(12只鼠)及正常对照组(5只鼠)。电凝鼠巩膜表面至少3组静脉及角膜缘周围血管,减少房水静脉回流,建立鼠青光眼模型。分别于术后1、2、3、4及8周分别处死大鼠。处死前测眼压,抽血2ml,供酶联免疫吸附测定使用,分析视网膜组织内HSP27蛋白抗原产生的血清中相应抗体水平。同时对鼠眼视网膜组织进行石蜡切片,采用免疫组化法检测RGCsHSP27的表达及分布情况,并对检测结果进行统计学分析。结果高眼压组右眼术后眼压明显升高,术后3d眼压(27.52±6.63)mmHg(1mmHg=0.133kPa),术后1周眼压(31.42±6.18)mmHg,此后眼压基本稳定。术后各时间点高眼压组右眼眼压与其术前、左眼及sham组右眼和左眼比较,差异有统计学意义(P<0.01)。血清中抗HSP27抗体滴度在术后1周缓慢升高,2、3周达高峰,此后逐渐下降至接近正常水平。术后2周和3周,高眼压组血清中HSP27抗体含量与sham对照组和正常对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01和P<0.05)。RGCs中HSP27阳性表达率在术后各时间点,高眼压组右眼与左眼、sham对照组右眼和左眼及正常对照组右眼和左眼比较,差异有统计学意义(P<0.01)。RGCs中HSP27阳性表达随着眼压升高及高眼压持续时间延长逐渐增强,且视网膜神经纤维层中也出现较明显的HSP27的阳性表达。结论内源性HSP27表达增强可能在青光眼视神经病变中具有重要作用。     

蛇毒神经生长因子对鼠视网膜神经节细胞GAP-43表达的影响

目的通过对视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)生长相关蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)的研究,观察蛇毒神经生长因子(venom nerve growthfactor,vNGF)在鼠视神经横断伤后对RGC的保护作用。方法将24只SD大鼠随机平均分为实验对照组、实验治疗组。各组右眼制作视神经横断伤模型,实验治疗组向玻璃体腔内注入0.8 g.L-1vNGF 0.025 mL,实验对照组向玻璃体腔内注入0.025 mL平衡盐液。左眼未做任何处理,作为正常对照组。于损伤后7 d、14 d取材,应用病理图像分析计数RGC及观察大鼠视网膜神经纤维层厚度变化,进行GAP-43免疫组织化学染色分析。结果光镜下,伤后7~14 d,实验治疗组大鼠RGC数目明显高于实验对照组,有非常显著性统计学差异(P<0.01),2组均比正常对照组RGC数目下降,有非常显著性统计学差异(P<0.01)。免疫组织化学结果:实验治疗组7 d时GAP-43表达明显,14 d时稍减弱;实验对照组7 d时有GAP-43表达,但较实验治疗组弱,到14 d时表达明显减弱。结论在视神经横断伤后,vNGF能增加并延长GAP-43的表达强度,提高RGC的存活数量,对RGC有明显的保护作用。     

缺氧对视网膜Muller细胞上水通道蛋白-4表达的影响

目的利用体外培养的视网膜Muller细胞,研究在缺氧条件下视网膜Muller细胞上水通道蛋白-4（AQP-4）表达的变化。方法采用组织块培养法从新西兰大白兔视网膜中获取Mullerr细胞,在含20％胎牛血清的DMEM培养液中原代培养,培养的细胞通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫细胞化学染色及透射电子显微镜进行鉴定。取第2代细胞进行实验,将化学缺氧诱导剂CoCl,联合DMEM培养液培养24h的细胞作为缺氧组;将DMEM培养液单独培养24h的细胞作为对照组。采用免疫细胞化学法及半定量RT．PCR法分别检测2组Muller细胞上AQP-4蛋白及AQP-4mRNA的表达。结果Muller细胞（第2代）上GFAP的阳性率为90％以上,细胞质染色呈棕色。细胞内含特征性的中间丝,细胞表面有微绒毛,细胞质内含丰富的细胞器。CoCl,联合DMEM培养液培养24h后Muller细胞上AQP-4蛋白的表达较对照组明显增加（t=6．74,P〈0．05）;AQP-4mRNA的表达亦明显增加（t=21．79,P〈0．05）。结论缺氧能增强Muller细胞上AQP-4的表达,进而使视网膜内液体的积聚增加。提示Muller细胞在糖尿病视网膜病变（DR）或增生性视网膜病变的视网膜水肿形成过程中起重要作用。     

大蒜素对人视网膜母细胞瘤细胞中PDCD5表达的影响

目的 探讨大蒜素对人视网膜母细胞瘤(Rb)细胞的抑制作用及其对程序化细胞死亡因子5(PDCD5)表达的影响.方法 分别用不同质量浓度的大蒜素、顺铂及大蒜素和顺铂联合处理人Rb细胞,在作用24、48、72 h后观察Rb细胞的形态,并应用免疫细胞化学法检测不同处理条件下各时间点PDCD5的表达情况.结果 人Rb细胞在不同质量浓度大蒜素、顺铂以及大蒜素和顺铂联合作用下,细胞生长受到抑制.不同质量浓度的大蒜素均可以上调人Rb细胞中PDCD5的表达.与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05).随着大蒜素作用时间的延长,PDCD5的表达依次上升.大蒜素(15μg/mL)和顺铂(3μg/mL)联合用药可增强对人Rb细胞的生长抑制,与单独用药比较,上调PDCD5表达的作用差异有统计学意义(P<0.05).结论 Rb细胞中存在与细胞凋亡有关的PDCD5蛋白低表达.大蒜素可抑制人Rb细胞的生长,且抑制作用具有时间和质量浓度依赖性.大蒜素和顺铂联合用药作用强于单独用药,可提高药物对肿瘤细胞的生长抑制.     

视网膜变性小鼠视网膜组织中FasL蛋白表达的动态变化

背景 视网膜移植是治疗视网膜变性性疾病的新方法,但如何避免或减少视网膜移植后的免疫排斥反应是亟待解决的问题之一.目前的实验研究中常将正常C57 BL/6小鼠视网膜作为供体,视网膜变性(rd)小鼠作为受体.研究表明视网膜中Fas配体(FasL)蛋白通过FasL/Fas途径诱导Fas+炎症细胞凋亡,推测可能与视网膜移植后的免疫排斥反应密切相关. 目的 探讨FasL蛋白在不同鼠龄C57BL/6小鼠和rd小鼠视网膜中的表达特点,揭示小鼠视网膜的免疫特性,为视网膜移植免疫排斥反应的研究提供参考依据.方法 分别将出生后(PN)-0周(出生日)、PN-1周、PN-2周、PN-3周、PN-4周的正常C57BL/6小鼠和rd小鼠处死制备眼球冰冻切片,采用免疫荧光技术摄片,并经激光扫描共焦显微镜采集图片,用图像分析软件对各鼠龄不同品系小鼠间视网膜中FasL蛋白表达的荧光强度(FI)变化进行半定量分析. 结果 PN-1周C57BL/6小鼠视网膜发育尚不完善,FasL蛋白在视网膜各层均呈阳性表达.PN-2、3、4周C57BL/6小鼠已发育成10层的视网膜结构,FasL蛋白在视网膜色素上皮(RPE)、内节段(IS)、外界膜(OLM)、外丛状层(OPL)、内核层(INL)、内丛状层(IPL)及节细胞层(GCL)呈阳性表达.PN-1周rd小鼠视网膜结构与同龄C57BL/6小鼠接近,FasL蛋白在视网膜各层均呈阳性表达.PN-2周至PN-4周rd小鼠视网膜中外核层(ONL)细胞随着鼠龄增大逐渐减少,FasL蛋白在RPE、OPL、INL、IPL及GCL呈阳性表达;PN-2、3、4周rd小鼠RPE中FasL蛋白表达FI值分别为184.199±16.747、186.797±7.904和184.319±18.795,均明显高于同龄C57BL/6小鼠的160.402±22.851、160.995±22.799和105.787±17.676,差异均有统计学意义(t=-3.360,P=0.002;t’=-4.277,P=O.000;t=-12.175,P=0.000);各周龄rd小鼠与C57BL/6小鼠间视网膜IPL中FasL蛋白表达的FI值差异均无统计学意义(均P＞O.05).结论 rd小鼠随着鼠龄增加视网膜ONL细胞逐渐减少,其RPE内免疫赦免相关抗原FasL蛋白的表达强度明显高于同龄C57BL/6小鼠.     

Muller细胞对青光眼视网膜神经节细胞影响的研究进展

视网膜神经节细胞（RGCs）的过度凋亡是青光眼病理改变的基础。Mller细胞作为视网膜的主要神经胶质细胞,对于维持神经元的完整性、代谢、内环境稳态以及信号转导等均具有重要的作用。随着对Mller细胞研究的逐渐深入,发现Mller细胞不仅参与了青光眼性RGCs的凋亡机制,而且还参与了RGCs的代偿性保护机制。那么Mller细胞是如何对RGCs起作用,它又是通过什么机制参与青光眼引起的RGCs凋亡以及代偿性保护作用呢？就这些问题的最新研究进展进行综述。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞中Fas/FasL mRNA表达的影响

目的：通过检测不同压力及时间纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞（retinal gangal ,Cells,RGCs)中Fas/FasL mRNA的表达，探讨Fas/FasL在RGCs凋亡中的作用，方法：用SD系大鼠脑源性星型胶质细胞同化培养液双界面法培养羊抗鼠Thy1.1单克隆抗体纯化的SD系大鼠RGCs，分别在0mmHg(对照组）和20，40，60and 80mmHg(1kPa=7.5mmHg)的压力下培养24h及48h后,用免疫组化和原位杂交对RGCs中Fas/FasL及其mRNA的变化进行定性及半定量观察，TUNEL法检测各组织细胞的凋亡，结果：纯化的RGCs培养24h用羊抗鼠FITC－Thy-1.1单克隆抗体进行鉴定阳性，纯度为97％，免疫组化和原位杂交检测Fas/FasL及其mRNA，结果培养24h对照组无表达，20mmHg组有较弱的表达信号，40，60及80mmHg组表达逐渐增强，与对照组比较差异均有显著性（P＜0．05），培养48h对照组弱表达，压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h各组表达增强，差异有显著性（P＜0．05），TUNEL法检测细胞凋亡，培养24h对照组未见细胞凋亡。20mmHg见少量细胞凋亡，随着压力的增高细胞凋亡数增多，凋亡指数增高，与对照组相比均有显著性差异，培养48h组压力≥20mmHg各组较相同压力培养24h组凋亡指数增高，差异有显著性（P＜0．05），结论：压力可激活视网膜神经节细胞Fas/FasL mRNA表达，Fas/FasL系统活化参与了青光眼高眼压下视网膜神经节细胞的凋亡。     

压力对大鼠纯化视网膜神经节细胞诱导型一氧化氮合酶mRNA及其蛋白表达的影响

目的 研究不同压力下纯化培养的大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs)中诱导一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS)mRNA及其蛋白质的表达,探讨青光眼患者RGCs损伤的机制。方法 将纯化培养的Sprague-Dawley大鼠RGCs随机分成对照组A,B,C,及D组,分别在0,20,40,60及80mmHg(1mmHg=0.133KPa)的压力下培养48h后,用原位杂交,RTPCR及Western blot法检测RGCs中iNOSmRNA及其蛋白质的表达,并用全自动图像分析系统测定其吸光度值。结果 纯化培养的RGCs纯度为98％。原位杂交,RT－PCR及Western blot法检测RGCs中iNOS mRNA及其蛋白表达结果变化均呈平行关系;对照组无表达,A组有较弱的表达信号,B,C及D组表达逐渐增强;3项检测结果用全自动图像分析显示;A组iNOSmRNA均弱表达,与对照组比较差异有显著意义（P＜0．05）;B,C及D组均为强表达,各组与对照组比较差异有非常显著意义（P＜0．01）。结论 压力可激活RGCs中iNOSmRNA及其蛋白质的表达,由此产生过量的NO损伤RGCs成为青光眼的发病因素之一。     

视网膜神经节细胞钾离子通道的表达与功能

视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）不可逆性凋亡是视神经损害的主要原因.在许多视神经相关疾病中如青光眼、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、葡萄膜炎和玻璃体视网膜病变等,RGCs凋亡是视觉障碍的一个主要原因.RGCs的电性能主要取决于离子通道的存在.各种离子通道中,钾离子通道起到了非常关键的作用.本文就钾离子通道在RGCs上的表达及其功能进行综述.     

下调热休克蛋白B8在视神经损伤中对小鼠视网膜神经节细胞的保护作用

目的:观察敲低热休克蛋白B8 （HspB8）对鼠视神经钳夹（ONC）后视网膜神经节细胞（RGC）及视网膜功能的影响。方法:构建敲低HspB8的重组腺相关病毒（AAV) 2-小发夹HspB8 （shHspB8）-绿色荧光蛋白（GFP）。雄性C57BL/6J小鼠66只随机分为正常对照组、ONC组、AAV2-shHspB8组...     

高血糖对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的影响

目的 通过观察大鼠视网膜病理改变,从组织病理学角度揭示高血糖对大鼠视网膜神经节细胞的影响。方法 将100只大鼠分为对照组10只和糖尿病组90只。糖尿病组用链脲佐菌素造模,9个月后通过组织化学法观察高血糖对观察组大鼠视网膜内层神经节细胞的影响。结果 糖尿病组大鼠视网膜内层厚度降低、视网膜神经节细胞数目明显减少、视网膜神经节细胞肿胀平均周长、面积升高,视网膜神经节细胞黑度值降低,与对照组比较差别有显著意义(P＜0．01)。结论 高血糖能使糖尿病大鼠视网膜变薄,神经节细胞肿胀、数目减少,从而对糖尿病大鼠视网膜内层造成损害。     

损伤晶状体对视网膜神经节细胞存活的影响

目的 研究晶状体损伤对视网膜神经节细胞存活的影响.方法 40只Wistar大鼠随机分为3组:正常组(8只)、单纯损伤组(16只)和晶状体损伤组(16只).4周后处死动物,常规病理切片并计数视网膜神经节细胞的数量.结果 正常组视网膜层次清楚,单纯损伤组视网膜明显变薄,晶状体损伤组视网膜虽变薄,但不如单纯损伤组明显;视网膜周边部神经节细胞数量每高倍视野下平均值正常组为53.25±1.96;单纯损伤组为4.06±1.45;晶状体损伤组为25.00±1.49.各组之间两两比较,差异均具有显著统计学意义(P＜0.01).结论 晶状体的损伤能够极大地提高视网膜周边部神经节细胞的存活数量,损伤后晶状体的变化在此过程中起关键性作用.