大肠埃希菌O157：H7特异基因检测与毒力基因分析

目的：对江苏省2000和2001年分离的经血清玻片凝集试验初筛为大肠埃希菌O157：H7（E.coliO157:H7)的菌株进行O157O抗原及H7抗原特异性基因检测，了解2000年监测点宿主动物分离O157菌株毒力基因携带率及毒力基因图谱。方法：用聚合酶链反应法检测O157特异基因，H7特异基因，多重引物聚合酶链反应法检测VT1，VT2，eaeA,hly等毒力基因并进行分析。结果：134株血清玻片凝集试验初筛为E.coliO157:H7的菌株经特异基因检测确定为E.coliO157的占72.4%(97/134),E.coliO157:H7的仅为29.1%(39/134)；非O157菌株占26.9%(36/134)，有44.3%(58/134)的O157菌株鞭毛抗原不是H7。2000年宿主动物分离菌株，经特异基因检测为非O157的不携带毒力基因（0/18）；为E.coliO157:H?的菌株，毒力基因携带率为10.7%(3/28)；确定为E.coliO157:H7的菌株，毒力基因携带率高达93.1%(27/29)。且毒力基因型以VT2 eaeA hly为主。结论：特异性基因检测鉴定E.coliO157:H7，可大大减少血清玻片凝集试验的误判，结合毒力基因检测，可分析E.coliO157:H7菌株毒力基因型的变化，对制定切实有效的防制对策控制E.coliO157:H7流行具有重要意义。     

应用多重引物PCR技术检测O157∶H7毒力基因

目的 对江苏省6个不同地区不同宿主动物中分离的O157∶H7菌株进行毒力基因的检测分析.方法 应用肠出血性大肠杆菌(EHEC)的多重引物聚合酶链反应(PCR)方法,以志贺样毒素(SLT2和SLT1)基因、"粘附抹平"因子eaeA基因和溶血素(hly)基因为靶基因进行检测.结果 江苏省分离的O157∶H7菌株毒力基因携带率为56.5%,不同地区的分离株携带率有所不同,个别地区高达90%以上,有的地区则未检测到带毒力基因的菌株,这一结果与不同地区发病率的高低有平行的关系.疾病高发地区,菌株毒力基因携带率达85.7%(36/42),低发或散发地区为52.6%(10/19),非流行地区为8.3%(2/24).不同的宿主动物分离株其毒力基因携带阳性率从高到低依次为羊＞牛＞猪＞鸡.仅有的一份兔粪便标本分离株也检出毒力基因.菌株毒力基因图谱以SLT2+eaeA+hly为主,占79.2%,其次为SLT2+SLT1+eaeA+hly和SLT2+hly,分别占16.6%和4.2%;有毒力基因的菌株均有hly和SLT2,绝大多数菌株有eaeA基因,携带SLT1的菌株则较少,这与国外一些报道有所不同.结论 O157∶H7 毒力基因图谱是一个重要的分子流行病学标志,应用多重引物PCR方法检测O157∶H7 毒力基因,简便、快速、特异、敏感,对流行病学调查分析、制定预防和控制对策有重要的参考价值.     

福建省O157∶H7大肠杆菌毒力及特征基因的初步研究

[目的]对福建省分离的80株E. Coli O157∶H7菌株进行毒力及特征基因的检测分析.[方法] 应用聚合酶链反应 (PCR),以志贺毒素基因 (stx)、粘附抹平因子基因 (eaeA)、溶血素基因(hlyA)、O157抗原编码基因 (rfbO157) 和H7抗原编码基因 (fliCH7) 为靶基因进行检测.[结果] 福建省分离的O157∶H7菌株毒力基因携带率为6.25%(5 / 80). 菌株毒力基因图谱为stx+eaeA+hlyA和eaeA+hlyA.rfb O157 基因阳性与O157血清型符合率为100 %.[结论] 福建省分离的O157∶H7菌株毒力基因携带率 (6.25%) 低于江苏省疾病高发地区 (85.7%,P<0.05).     

福建省O157：H7大肠杆菌毒力及特征基因的初步研究

目的 对福建省分离的80株E.coli O157：H7菌株进行毒力及特征基因的检测分析。方法 应用聚合酶链反应（PCR），以志贺毒素基因（stx)，粘附抹平因子基因（eaeA)，溶血素基因（hlyA)，O157抗原编码基因(rfbO157)和H7抗原编码基因（fliCH7)为靶基因进行检测。结果 福建省分离的O157：H7菌株毒力基因携带率为6．25％（5／80）。菌株毒力基因图谱为stx eaeA hlyA和eaeA hlyA。rfb O157基因阳性与O157血清型符合率为100％。结论 福建省分离的O157：H7菌株毒力基因携带率（6．25％）低于江苏省疾病高发地区（85．7％，P＜0．05）。     

O157∶H7宿主动物及传染源3年监测研究

目的 :探明家禽家畜的O15 7∶H7感染与饲养情况。方法 :用细菌学与PCR等技术检测O15 7∶H7及其毒力基因。结果 :从牛、羊、猪、鸡的粪便中检出O15 7∶H7及其毒力基因VT2 、eaeA和hly ,带菌率的高低依次为牛 >羊 >鸡 >猪 ,腹泻病流行前期禽畜的带菌率高于流行期 ;该地农村禽畜饲养密度高 ,户饲养数 10 .2只 (头 ) ,人均 2 .4只 (头 ) ,饲养方式以散养为主 ,散养率 87.76%。结论 :牛、羊、猪、鸡是该地O15 7∶H 7的主要宿主动物和传染源 ,加强对其实行良好的饲养方式与粪便无害化管理及注重个人与环境卫生是防治O15 7∶H7引起感染性腹泻的关键     

从农村耕牛粪便中检出产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7

目的：调查东阳市家畜、家禽中O157：H7的携带状况,并进一步了解分离到的1株STEC O157：H7的分子生物学特性。方法：随机采集全市各乡镇的家畜、家禽粪便及其生鲜肉样品,进行大肠埃希菌O157：H7的检测,应用O157和H7特异性抗血清凝集试验进行菌株血清型的鉴定;选用ATB全自动微生物鉴定仪和VITEK 2-COMPACT进行常规生化及药敏试验;使用PCR检测O、H抗原编码基因和SLTl、SLT2、hly、eaeA 4种毒力基因。结果：在109份样品中,分离出1株经细菌生化鉴定为大肠埃希菌O157,血清型为O157：H7的菌株;使用PCR检测到O157：H7的O、H抗原编码基因和毒力基因SLT2、hly、eaeA,但未检测到毒力基因SLTl。结论：从东阳市的一头农村耕牛粪便中分离到1株STEC O157：H7,提示疾控中心要加强主动监测,及时发现可能发生的疫情,通过有效干预,防范肠出血性大肠杆菌O157：H7所致食源性疾病的发生。     

江苏省1999年大肠埃希菌O157∶H7宿主动物带菌情况调查

目的　了解江苏省不同地区大肠埃希菌O15 7∶H7宿主动物带菌情况及其毒力基因阳性率。方法　在不同流行强度的地区分别设立监测点 ,采集猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本 ,用免疫磁珠法进行病原菌分离培养 ,并用多重引物聚合酶链反应进行毒力基因分析。结果　 6个监测点共采集猪、鸡、羊、牛等家畜家禽粪便标本 176 7份 ,共检出大肠埃希菌O15 7∶H7170株 ,总带菌率为 9.6 2 %。其中 ,以牛、羊带菌率较高 ,分别为 19.0 5 %和 12 .0 1%。对 85株菌进行SLT1、SLT2、eaeA和hly 4种毒力基因的检测 ,5 6 .4 7%的菌株毒力基因阳性 ,且以同时带有SLT2、eaeA和hly 3种毒力基因最为常见 ,占带毒菌株的 79.17%。结论　宿主动物带菌率与当地疾病流行强度有关 ,即有确诊病人的地区宿主动物带菌率及菌株毒力基因阳性率最高 ,其次为仅有零星病例的地区 ,而无相关病例的地区最低。提示加强宿主动物大肠埃希菌O15 7∶H7监测 ,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义     

2005～2007年中国食品中疑似O157大肠埃希菌的鉴定及毒素基因的检测

目的对中国2005～2007年食源性疾病监测网分离疑似O157大肠埃希菌进行鉴定,了解各种不同类型监测食品中大肠埃希菌O157的分布及毒力基因的携带情况。方法运用API20E生化试剂条进行初步鉴定,使用血清分型和PCR方法确定菌株,并检测毒力基因。结果(1)通过API20E生化初步鉴定共获得154株疑似O157大肠埃希菌。(2)通过血清学方法和特异基因的检测,共确定89株大肠埃希菌O157,其中42株是O157:H7(47%),其余的菌株为O157:NM和O157:hund(未确定型)。(3)毒力基因的检测:42株O157:H7和6株O157:NM携带eaeA+hlyA基因;共29株菌携带stx基因,主要分布在不发酵山梨醇O157:H7菌株中。(4)监测的生羊肉、生牛肉、生猪肉、生鸡肉、蔬菜沙拉等食品中均检出了携带stx基因的O157:H7。结论鉴定结果显示中国部分监测食品中均分离到有一定程度致病力的大肠埃希菌O157。     

江苏省肠出血性大肠杆菌O157:H7监测资料分析

目的 :了解江苏省肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7在宿主动物与人群中的分布及其毒力基因携带状况 ,调查不同人群中致泻性大肠杆菌的感染率。方法 :用免疫磁珠分离法 (IMS)对江苏省6个监测点的宿主动物和人粪便标本进行 O15 7:H7的分离培养 ,并用多重引物 PCR方法 (MPCR)检测分离菌株的志贺氏样毒素 (SL T1和 SL T2 )、粘附抹平因子 (eae A)及溶血素 (hly) 4种毒力基因。结果 :监测共采集腹泻病人及健康人群粪便标本 130 8份 ,宿主动物粪便标本 130 7份。其中 ,流行前期腹泻病人粪便标本 70 7份中检出肠道致病菌阳性标本 110份 ,阳性率 15 .5 6 %。菌株有 6种肠道致病菌 ,包含 1株 O15 7:H7。流行后期腹泻病人粪便标本 30 2份和健康人群粪便标本 2 99份 ,均未检出肠道致病菌。宿主动物粪便标本 130 7份 ,检出 O15 7:H710株 ,阳性率 0 .76 %。流行后期阳性率2 .2 7% ,非常显著地高于流行前期 (χ2 =16 .94 ,P<0 .0 1)。不同宿主动物中检出存在差异 ,其中牛检出率最高为 1.77%。 11株 O15 7:H7菌株毒力基因测定 ,携带 SL T2 +eae A+hly10株 ,携带 eae A+hly1株。枯水期与丰水期水源水标本 6 9份 ,未检出 O15 7:H7。结论 :江苏省腹泻病人和宿主动物中均能检出肠出血性大肠杆菌 O15 7:H7,且菌株均携带毒力基因。     

绿色荧光蛋白在大肠杆菌O157∶H7检测中的应用

目的　将绿色荧光特征引入大肠杆菌E coliO15 7∶H7,用于传统检测方法的改进及目的菌的应用研究。方法　将pGFP质粒转化E coliO15 7∶H7,构建一种工程菌 (E coliO15 7∶H7 pGFP) ,并进行了选择性培养基的筛选。以E coliO15 7∶H7 pGFP对鸡肉与牛奶等食品样品进行接种与回收试验 ,同时设定不同温度模拟食品储存的不同情况。结果　pGFP质粒可以在E coliO15 7∶H7菌株中稳定存在。将E coliO15 7∶H7 pGFP接种食品样品 ,以LBan培养基平板回收发现 :较高温度存放肉类与牛奶 ,其污染的E coliO15 7∶H7菌量可在 12h增加 35 0 0 0～ 2 0 0 0 0 0倍 ,而 4℃存放可以使污染菌量缓慢下降。结论　构建了一种具有紫外灯下发出绿色荧光与氨苄青霉素抗性等特性的重组菌株———O15 7∶H7 pGFP ,并设计了适合E coliO15 7∶H7 pGFP生长的选择性培养基———LBan。该重组菌株可应用于检测方法的改进及该菌特性的研究 ,是一种非常有用的工程菌     

四川省大肠杆菌O157∶H7分子流行病学、耐药性及对消毒剂抗性研究

目的研究从四川省分离的大肠杆菌O157∶H7菌株流行病学特征。方法用多重PCR测定67株大肠杆菌O157∶H7的slt、eaeA、hly毒力基因;对不同来源的大肠杆菌O157∶H7进行质粒和PFGE分型;测定67株大肠杆菌O157∶H7的耐药性和对消毒剂的抗力。结果62.7%的株菌(42/67)携带有毒力基因,毒力图谱类型主要为slt1+slt2+eaeA+hly。67株菌共有6种质粒谱型和7种PFGE谱型。64.2%(43/67)的菌株分别对7种不同的抗生素耐药,其中有23、35、34株菌分别对氨苄青霉素、四环素和SMZ耐药。不同来源的大肠杆菌O157∶H7抗性谱不同,80.6%(54/67)的菌株对酒精和季铵盐产生了抗性,所有菌株对洗必泰敏感。结论四川省不同来源的大肠杆菌O157∶H7带毒率相似,但毒力基因谱型不完全相同。细菌有较高的耐药性。菌株对常用消毒剂有很高的抗性,在消毒灭菌时需要用较大剂量的消毒剂才能将其杀灭。不同来源的大肠杆菌O157∶H7耐药性、质粒和PFGE谱型有一定的相似性,提示菌株可能在人、动物、食品以及外环境之间相互传播并存在流行的可能。     

浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7的分子生物学特性研究

目的:了解自浙江省杭州市腹泻婴儿中分离的1株大肠埃希菌O157:H7(HZ1-11株)的分子生物学特性.方法:应用ATB1525细菌半动化生化鉴定系统鉴定菌种.应用O157特异性抗血清玻片凝集试验、H7特异性抗血清试管凝集试验、以及PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因,进行菌株血清型的鉴定.应用多重Real-timePCR和常规PCR检测stx1、stx2、hly和eae毒力基因.对菌株进行脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型,并与国内代表菌株进行比较.ATB1525药敏检测仪和纸片法检测菌株的抗药性.结果:细菌生化鉴定为大肠埃希菌,山梨醇阴性.血清型为O157:H7.毒力基因stx2、hly和eae均阳性,stx1阴性.PFGE谱带同江苏分离O157:H7菌株几乎完全相同,带型的相似度为97%.结论:该菌株为浙江省首株产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)O157:H7,与国内近年在江苏等地流行的STECO157:H7菌株密切相关.STEC O157:H7已开始对浙江地区的人民健康构成了威胁.     

O157：H7宿主动物及传染源3年监测研究

目的探明家禽家畜的O157∶H7感染与饲养情况.方法用细菌学与PCR等技术检测O157∶H7及其毒力基因.结果从牛、羊、猪、鸡的粪便中检出O157∶H7及其毒力基因VT2、eaeA和hly,带菌率的高低依次为牛＞羊＞鸡＞猪,腹泻病流行前期禽畜的带菌率高于流行期;该地农村禽畜饲养密度高,户饲养数10.2只(头),人均2.4只(头),饲养方式以散养为主,散养率87.76%.结论牛、羊、猪、鸡是该地O157∶H7的主要宿主动物和传染源,加强对其实行良好的饲养方式与粪便无害化管理及注重个人与环境卫生是防治O157∶H7引起感染性腹泻的关键.     

对流行地区的E.coli O157∶H7病原学分析及研究

目的对流行地区O157∶H7进行病原学分析.方法 PCR方法对O157∶H7菌株毒力基因谱检测比较,同时用PFGE和RAPD方法对O157∶H7菌株的同源性分析比较.结果流行地区分离的O157∶H7菌株,100%携带Hly、eaeA基因,95.35%携带SLT2基因,11.63%携带SLT1基因.PFGE图谱表明流行地区分离的O157∶H7菌株与日本分离的O157∶H7菌株有明显差异,为不相关菌株;与国内标准菌株882364为近似型(相似,但不相同).流行地区病人分离菌株与外环境家畜家禽类便及昆虫肠道分离菌株的PFGE图谱完全相同.结论携带O157∶H7菌株的家畜家禽可能是导致疫情发生的传染源.PFGE用于O157∶H7病原学分析,对流行病学研究有重要意义,但不适宜基层.RAPD方法用于O157∶H7病原学分析,技术简便、省时.     

龙岩市1999～2005年O157大肠杆菌监测研究

[目的]为了解龙岩市O157大肠杆菌人的感染、食品污染以及动物和媒介昆虫带菌情况.[方法]1999～2005年采集腹泻病人粪便、动物粪便以及各类食品、苍蝇、养殖场污水等标本,mEC增菌后用SMAC进行分离,纯化菌株经生化鉴定、血清分型、毒力及特征基因检测等.[结果]共检测2212份标本,检出O157大肠杆菌29株,阳性率为1.31%.其中猪粪为3.42%,牛粪为2.62%,牛肉为2.33%,鸡肉为2.06%,养殖场污水为2.27%.其余标本均未检出目的菌.O157:H718株,O157:NM 6株,O157:H?5株.对12株O157:H7,进行了rfbO157和fliCH7基因的测定,结果rfbO157均为阳性,而fliCH7均为阴性.对18株(O157:H7 14株、O157:NM 3株、O157:H?1株),进行了SIT2、SLT1、eaeA、hly4种毒力基因检测,结果仅2株O157:H7 eaeA hly阳性,1株O157:H7 hly阳性,其余菌株均为阴性.检出菌株对环丙沙星、氟嗪酸、丁胺卡那、庆大霉素敏感.检出ESBLs 2株.[结论]我市畜、禽中存在O157大肠杆菌,未检出含有SLT2、SLT1毒素的菌株,未发现O157大肠杆菌病例和食物中毒患者,应加强宿主动物O157大肠杆菌监测.     

12株疑似O157:H7大肠菌PCR鉴定研究

目的:对12株疑似O157:H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法:利用单一PCR和多重聚合酶链反应(mPCR)检测不同来源菌株志贺样毒素(stx1和stx2)、溶血素(hly)、粘附抹平因子(eaeA)、β-葡糖醛酸糖苷酶(u idA)、O157抗原编码(rfbE)、H7鞭毛抗原编码(fliC)基因。结果:4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性,确认为EHEC O157:H7,其中1株菌株扩增出全部毒力基因,另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因;2株大肠菌rfbE基因检测阳性,确认为O157:H7-大肠菌;其它均为非O157:H7其它大肠菌。结论:PCR技术的应用能对可疑O157:H7大肠菌进行有效鉴定与分析,应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

衢州市2000-2009年肠出血性大肠埃希菌O157∶H7监测

目的了解浙江省衢州市肠出血性大肠埃希菌O157∶H7人的感染、食品污染以及动物和媒介昆虫带菌情况。方法在流行季节采集腹泻患者、动物粪便以及各类食品、苍蝇等样本,MEC肉汤增菌后,用特异性免疫磁珠集菌,以科玛嘉显色平板分离,纯化的菌株进行生化鉴定、血清分型及毒力基因检测。结果 2000-2009年,共检测样本12 292份,检出EHEC O157∶H7 19株,总检出率为0.15%。其中4种宿主动物粪便样本中检出18株,检出率分别为羊2.14%、牛1.29%、猪0.45%、鸭0.19%;食品中从生猪肉中检出1株,检出率0.17%;腹泻患者和苍蝇样本中均未检出。经毒力基因检测,其中16株stx2+hly+eaeA阳性,1株hly+eaeA阳性,其余2株不带毒力基因,带毒率89.47%。结论浙江省衢州市部分动物中产毒的EHEC O157∶H7带菌率较高,表明该地区存在暴发或流行的潜在危险,应加强综合监测。     

2007年浙江省衢州地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染状况

目的:了解2007年浙江省衢州地区产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7在动物中的分布情况及其耐药性、PFGE分型及毒力基因携带状况。方法:按全国O157:H7监测方案于5~10月份肠道传染病高发季节,在衢州地区采集各种动物粪便/肛拭,用免疫磁珠富集后进行O157:H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O、H抗原及志贺样毒素(SLT1和SLT2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,分析分离所得菌株的耐药状况。结果:共监测动物粪便标本300份,分离得产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7菌株16株,分离率为5.33%。16株O157:H7菌株,毒力基因Hly、eaeA、SLT2均阳性,SLT1均阴性。脉冲场凝胶电泳分型显示,16株O157:H7菌株可分2个PFGE基因型,型间差异较小。耐药性分析显示这些菌株对红霉素、利福平的耐药率最高,达100.0%,对其他受试抗生素均敏感。结论:该地区动物中产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7带菌率较高,所分离菌株主要携带SLT2基因,因此推测该地区存在发生产志贺毒素大肠埃希菌O157:H7感染暴发或流行的潜在危险,需增加对动物源性O157:H7的监测力度。     

12株疑似O157：H7大肠菌PER鉴定研究

目的：对12株疑似O157：H7大肠菌采用PCR法进行鉴定。方法：利用单一PCR和多重聚合酶链反应（mPCR）检测不同来源菌株志贺样毒素（stx1和stx2）、溶血素（hly）、粘附抹平因子（eaeA）、β-葡糖醛酸糖苷酶（uidA）、O157抗原编码（血E）、H7鞭毛抗原编码（niC）基因。结果：4株大肠菌rfbE和fliC基因检测为阳性，确认为EHEC O157：H7，其中1株菌株扩增出全部毒力基因，另3株菌株扩增出除stx1外其它全部毒力基因；2株大肠菌rfbE基因检测阳性，确认为O157：H7-大肠菌；其它均为非O157：H7其它大肠菌。结论：PCR技术的应用能对可疑O157：117大肠菌进行有效鉴定与分析，应成为今后病原学鉴定的主要技术手段。     

河南豫东地区产志贺样毒素Ecoli O157∶H7感染病例的流行病学调查研究

[目的 ]探讨河南省局部地区腹泻病人感染及携带大肠杆菌O15 7∶H7的情况 ,观察带菌时间及预后。[方法 ]采用流行病学监测方法发现病人 ,通过病人粪便mEC肉汤增菌 14h、胶体金免疫卡筛选、免疫磁珠法集菌、CHROMAGAR O15 7∶H7显色培养基分离、rfbO15 7、rfbO111、hlyA、stx1、stx2、eaeA引物PCR扩增方法进行毒力因子测定等方法 ,观察、研究感染病人的发病和预后。[结果 ]从 130 3份腹泻病人中共分离出的 38株O15 7∶H7菌株 ,检出率 2 9% ,PCRrfbO15 7扩增均为阳性。其中 2株具有stx2、hlyA和eaeA毒力基因 ,36株为O15 7∶H7不产毒株。[结论 ]我省首次从病人中分离出O15 7∶H7产毒株 ,病人发病后可于第 3～ 8d内检出病原体