应用旋转生物反应器开展软骨组织工程研究

目的：应用旋转生物反应器（RCCS）在体外条件下培养具有一定形状的组织工程化人工软骨,以便为软骨组织工程产品产业化生产奠定基础。方法：将兔关节软骨细胞接种到圆形或方形可降解聚合物材料上,然后在RCCS内进行培养,并以在培养瓶内培养复合体为对照组。在体外培养期间,对复合体培育产物氨基糖胺聚糖（GAG）及DNA含量进行定量测量。经体外培养后,将复合体植入到裸鼠背部皮下,术后不同时间取材,进行大体、组织学等检查。结果：经RCCS培养的复合体在体外培养期间以及体内植入后均有明显软骨形成,而对照组则仅见少量软骨形成。复合体体外培育产物检测结果表明,在RCCS内培育的复合体GAG和DNA含量明显高于对照组。结论：RCCS与以单层生长方式为主的传统细胞培养装置－培养瓶相比,能够提供更适宜的外部环境,从而有利于软骨细胞在支架内形成人工软骨组织。     

基于永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞的工程化软骨形成的实验研究

目的 :探讨hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞 (MSCs)裸鼠体内形成软骨的能力。方法 :通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选并挑选阳性克隆进行扩增培养 ;取兔骨髓 ,密度梯度离心和培养 ,经诱导、扩增后与支架材料 β 磷酸三钙 (β TCP)复合 ,构建细胞 β TCP复合体 ,体外培育 1～ 2d后 ,植入裸鼠体内。通过粘多糖 (GAG)含量和Ⅱ型胶原的表达来检测 3和 6个月复合体软骨形成情况。结果 :两种细胞和 β TCP复合体在裸鼠体内均能形成软骨样组织 ;6个月 ,工程化软骨GAG含量和Ⅱ型胶原的表达均低于正常软骨组织 ,但无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :hTERT转染的永生化软骨细胞和骨髓基质干细胞均具有良好的软骨形成能力 ,在软骨组织工程修复软骨缺损方面具有重要的应用前景。     

兔阴囊原位构建组织工程化睾丸假体的实验研究

目的探讨以HDPE-PGA复合支架接种兔耳软骨细胞后,于兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体的可能性。方法取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备HDPE-PGA复合支架,细胞-支架复合物体外培养2w。摘除单侧兔睾丸后即时将经体外培养的细胞-支架复合物植入阴囊原位,术后3m将兔处死取材。单纯支架植入为对照组。标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、GAG含量检测。结果实验组取材标本经检测具有预制形态与体积,有新生软骨组织产生,软骨组织呈岛状分布,其间有不同程度的纤维组织长入及炎性细胞浸润。对照组无软骨形成。结论兔阴囊原位内构建组织工程化睾丸假体具有预制形态与体积、结构与组织学形态良好。     

软骨细胞诱导骨髓基质细胞构建软骨的体内外比较

目的 应用软骨细胞诱导骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)体外构建软骨,比较其体内植入前后软骨相关生物学特性的差异,探讨共培养构建软骨临床应用的可行性.方法 体外分别培养扩增猪关节软骨细胞和BMSCs,两者按2:8比例混合(软骨细胞:BMSC),以5.0×107/ml的细胞终浓度接种于聚乳酸包埋的聚羟基乙酸支架,体外培养8周后部分标本植入裸鼠皮下,再经体内8周后取材.通过大体观察、糖胺聚糖含量(GAG)测定、生物力学测试、组织学,以及免疫组化等方法对体内植入前后标本的软骨相关生物学特性进行比较.结果 体外培养8周时,所有标本均形成了软骨样组织,但质地较软,组织结构相对较为松散.体内植入8周后,共培养构建软骨能维持良好的软骨外观,而且GAG含量及弹性模量均明显高于体外标本(p＜0.01),组织学及免疫组化显示体内标本的组织结构致密,基质及Ⅱ型胶原显色程度均明显强于体外标本.结论 软骨细胞诱导BMSCs构建的软骨在体内皮下环境中能维持良好的软骨特性,而且植入体内后能继续向成熟软骨发育.     

应用无支架离心管培养技术构建组织工程化关节软骨

目的 探索应用离心管培养技术进行体外构建组织工程化关节软骨组织的可行性,并研究其结构和功能。方法 分离培养人胚胎关节表层软骨细胞,在无支架材料条件下,用离心管培养技术构建关节软骨,通过组织学、生物化学和逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR)技术,对离心管内构建的软骨组织进行形态学和细胞功能状态研究。结果 在体外培养第 2周时,组织切片可见软骨样组织结构;第 3周时软骨发育趋于成熟,经阿新蓝染色基质丰富;第 16周时,组织形态无明显变化,未见钙化。 DNA含量在体外培养第 2周时达最高峰,其硫酸化糖胺多糖 (GAG)含量在第 4周时达最高峰,维持至第 8周。 GAG与 DNA含量之比于第 8周时达最高峰。 RT-PCR检测结果显示,体外培养至第 16周时,Ⅱ 型胶原蛋白 mRNA呈阳性表达,其扩增片段为 160 bp,与正常人的胚胎关节软骨一致。结论 在无支架材料条件下,采用离心管培养技术培养的人胚胎关节表面软骨细胞可以构建组织工程化关节软骨,而且接近正常关节软骨的形态和功能。     

聚羟基丁酸酯载体人工软骨体内培育的实验研究

目的 探讨聚羟基丁酸酶（ＰＨＢ）泡沫材料作为软骨细胞支架材料以及体内培育组织工程化人工软骨的可行性。方法 取４周龄雄性新西兰幼免关节软骨、胶原酶消化,将所获软骨细胞种植到ＰＨＢ泡沫材料上,体外培养１周后,将细胞－支架材料复合体移植到兔背背部下皮,以单纯植入聚羟基丁酸酯泡沫材料及接种软骨细胞组为对照组。分别于术后第４、８、１２周取材,进行大体观察及组织学、免疫组织化学观察。结果 软骨细胞＝支架材料复     

以β-磷酸三钙多孔陶瓷为载体建造组织工程化人工软骨

目的 通过将软骨细胞接种到三维多孔β－磷酸三钙（β－TCP）陶瓷支架材料上,探讨以β－TCP为载体建造组织工程化软骨的可行性。方法 将β－TPC多孔陶瓷加工成圆片状,并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上接种从兔关节软骨分离的软骨细胞,将细胞－陶瓷复合体置于旋转细胞培养系统（RCCS）内,培养1周后,将其移植到裸鼠背部皮下。植入术后4,8,16周取材,进行大体观察、组织学及组织化学等观察。结果 复合体体内移植后,在裸鼠皮下有新生软骨形成,形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。结论 β－TPC多孔陶瓷是软骨细胞较适宜的贴附基质,以其为支架能够在体内建造出具有精确解剖形状的人工软骨。     

胶原-透明质酸-硫酸软骨素复合三维支架体外构建组织工程软骨的实验研究

目的探讨以胶原(collagen,Col)透明质酸(hyaluronic acid,HA)硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)为支架材料构建组织工程软骨的可行性.方法以乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐为交联剂通过冷冻干燥的方法制备Col-HA-CS复合支架及单纯Col支架.通过扫描电镜、HE染色对Col-HA-CS复合支架材料形态进行观察.分离培养幼兔关节软骨细胞,将体外扩增的软骨细胞接种在两种支架上,通过组织学、扫描电镜观察软骨细胞在支架上的生长形态;通过生物化学功能检测细胞-支架复合物中DNA、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)含量;RTPCR方法检测在Col HA CS复合支架上的软骨细胞ColⅡ的表达情况.结果软骨细胞在Col-HA-CS复合支架材料上增殖分化良好,并保持软骨细胞特异的分化ColⅡ表型,培养21 d后已有软骨样组织形成,出现软骨陷窝.DNA和GAG含量测定显示软骨细胞在复合支架上随时间增加逐渐扩增并分泌大量的GAG,含量明显高于单纯Col支架材料,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Col-HA-CS复合支架材料可为软骨细胞生长分化及组织形成提供一个良好的环境,在软骨组织工程的支架材料领域有较广泛的应用前景.     

兔再造阴茎模型内构建组织工程化阴茎假体的实验研究

目的 探讨于家兔再造阴茎模型内构建带内支撑组织工程化阴茎假体的可行性及其特点.方法 取成年兔耳软骨分离培养软骨细胞,制备以医用多孔高密度聚乙烯(HDPE)为内支撑,外裹聚羟基乙酸(PGA)的支架(直径3mm、长20mm柱状HDPE,外裹厚2 mm的PGA),细胞-支架复合物体外培养4周.以兔一侧腹壁浅血管为轴型血管的皮瓣形成再造阴茎模型,将经体外培养的细胞-支架复合物分别植入兔即时再造的阴茎模型内和对侧腹壁皮下,在对侧腹壁下同时植入一单纯支架.将植入体分为A组:细胞-支架复合物植入再造阴茎模型内;B组:细胞-支架复合物植入腹壁下;C组:单纯支架植入腹壁下.术后3个月将兔处死取材,标本行大体观察、组织学、组织化学、免疫组化、糖胺聚糖(GAG)含量及生物力学检测.结果 A组与B组取材标本的体积、外形与植入时相近,外层新生组织与内部HDPE结合紧密,经HE染色、Safranin O染色、Masson trichrome染色和Ⅱ型胶原免疫组化检测证实,新生组织为软骨组织,且分布相对均一完整,纤维组织长人较少,少量炎性细胞浸润;C组无软骨组织形成.A组与B组标本各项检测指标(湿重、GAG含量、抗压强度、弹性模量)差异无统计学意义(P>0.05).结论 自体软骨细胞接种于HDPE-PGA复合支架,经体外培养4周后,植于家兔即时再造阴茎模型内继续培养,可成功地构建出具有预制形态、体积、结构与组织学良好的软骨-HDPE复合体(阴茎假体).     

膨体聚四氟乙烯（ePTFE）内支撑组织工程软骨的构建实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养体外构建ePTFE软骨复合体的可能性。方法：实验组：分离、获取、扩增兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞,二者按7：3比例混和,接种到以膨体聚四氟乙烯（ePTFE）为内支撑外裹聚羟基乙酸（PGA）支架上,体外培养8周后,行大体、组织学、Ⅱ型胶原免疫组织化学和生物化学检测。对照组：利用实验组支架单纯接种骨髓间充质干细胞行体外培养。结果：实验组：体外培养8周后形成形态良好的软骨样组织复合体,组织学可见成熟软骨陷窝、异染基质、Ⅱ型胶原表达阳性。对照组：无软骨形成。结论：兔骨髓间充质干细胞和软骨细胞混合培养,可以在体外构建出特定形状、结构组织学良好的ePTFE软骨复合体。     

应用组织工程方法构建瘢痕疙瘩模型的实验研究

目的 应用组织工程的原理和方法，构建人瘢痕疙瘩(keloid，K)动物模型，探讨采用这一模型进行K临床和实验室研究的可行性。方法 取人体K组织中成纤维细胞(fibroblasts，FB)进行原代培养，将体外培养第6～8代FB，接种到培养液预湿的聚乳酸一乙醇酸共聚物(the copolymers of polylactic acid and polyglycolie acid，PLGA)支架上，形成体外复合体，将复合体转移至旋转式细胞培养系统容器内培养；1周后种植在20只雌性裸鼠皮下，同体两侧对照；第4、8周取材，对获得的K组织进行组织学评价。结果 术后裸鼠全部成活。复合体移植8周后，在裸鼠皮下形成的K保持了其原有的胶原形态，在电镜下可观察到植入物内同时存在纤维细胞和FB，并可见丰富的粗面内质网，FB仍保持合成和分泌胶原的能力，细胞特性保持不变。结论 PLGA与K组织中FB具有较好的亲和性，复合后在裸鼠体内可形成K，值得进一步开发研制，以便为进行K的研究提供更为合适的动物模型。     

组织工程骨软骨复合物的构建与形态学观察

目的探讨采用组织工程技术构建骨软骨复合物的可行性。方法将骨髓基质细胞(BMSCs)成诱导软骨后接种于快速成形的三维支架材料聚乳酸／聚羟乙酸共聚物(PLGA)构建组织工程软骨，经成骨诱导的BMSCs接种于聚乳酸／聚羟乙酸共聚物／磷酸三钙(PLGA／TCP)构建组织工程骨，在体外分别培养2周后，将两种工程化组织及两者以无损伤线缝合形成的组织工程骨软复合体分别植入自体股部肌袋，术后8周取材，行组织学观察。结果术后组织学观察表明。组织工程软骨在体内可形成软骨组织组织工程骨在体内可形成骨组织，两者的复合体在体内可形成骨软骨复合物。结论以骨髓基质细胞为种子细胞、以快速成形的生物降解材料为支架体外构建的组织工程骨软骨复合物，可在体内形成骨软骨组织，有望用于骨软骨缺损的修复。     

以PHBV为支架构建组织工程化软骨

[目的]探讨聚（羟基丁酸酯．羟基戊酸酯）（PHBV）多孔材料作为软骨组织工程支架的可行性以及体内外培养方式对软骨形成的影响。[方法]采用“压片-热处理-粒子析出”技术制备PHBV多孔支架。体外分离培养软骨细胞后接种到PHBV支架体外培养2周，期间扫描电镜观察细胞在支架上的生长情况，然后与单纯PHBV支架同植入裸鼠皮下继续培养4、8周后取材，与体外培养至6、10周的细胞一支架复合物同行组织学观察。[结果]电镜观察示软骨细胞在支架上黏附、增殖良好并能分泌细胞外基质；组织学观察示PHBV浅层有新生软骨组织形成，且皮下培养的软骨组织比体外培养的更为成熟。单纯PHBV支架皮下培养没有软骨组织形成。[结论]PHBV可以作为软骨组织工程支架材料。体内培养较体外更有利于组织工程化软骨的形成。     

残耳软骨细胞种植于聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯共聚物形成组织工程软骨

目的探讨以聚羟基丁酸酯-聚羟基己酸酯(PHB-PHH)共聚物为细胞外支架、以残耳软骨作为种子细胞形成组织工程软骨的可能性。方法取先天性小耳畸形8例患者的残耳软骨，以胶原酶消化后种植于PHBPHH支架，体外培养1周后种植于8只裸鼠一侧背部皮下为实验组，另一侧只植入支架材料作为对照组。于4周、8周后取出标本，做大体观察及HE染色、Masson三色染色检查。结果4周时实验组镜下显示有新生软骨形成，但仍有部分支架材料残留；8周时实验组标本大体观察及HE染色、Masson三色染色检查新生软骨与人耳软骨相似，支架材料已完全吸收。对照组无软骨形成。结论以残耳软骨作为种子细胞，以PHB-PHH共聚物为细胞外支架可以形成组织工程软骨，新生软骨大体观察、组织学检查与人耳软骨相似。     

Precultivation of engineered human nasal cartilage enhances the mechanical properties relevant for use in facial reconstructive surgery

OBJECTIVE: To investigate if precultivation of human engineered nasal cartilage grafts of clinically relevant size would increase the suture retention strength at implantation and the tensile and bending stiffness 2 weeks after implantation. SUMMARY BACKGROUND INFORMATION: To be used for reconstruction of nasal cartilage defects, engineered grafts need to be reliably sutured at implantation and resist to bending/tension forces about 2 weeks after surgery, when fixation is typically removed. METHODS: Nasal septum chondrocytes from 4 donors were expanded for 2 passages and statically loaded on 15 x 5 x 2-mm size nonwoven meshes of esterified hyaluronan (Hyaff-11). Constructs were implanted for 2 weeks in nude mice between muscle fascia and subcutaneous tissue either directly after cell seeding or after 2 or 4 weeks of preculture in chondrogenic medium. Engineered tissues and native nasal cartilage were assessed histologically, biochemically, and biomechanically. RESULTS: Engineered constructs reproducibly developed with culture time into cartilaginous tissues with increasing content of glycosaminoglycans and collagen type II. Suture retention strength was significantly higher (3.6 +/- 2.2-fold) in 2-week precultured constructs than in freshly seeded meshes. Following in vivo implantation, tissues further developed and maintained the original scaffold size and shape. The bending stiffness was significantly higher (1.8 +/- 0.8-fold) if constructs were precultured for 2 weeks than if they were directly implanted, whereas tensile stiffness was close to native cartilage in all groups. CONCLUSION: In our experimental setup, preculture for 2 weeks was necessary to engineer nasal cartilage grafts with enhanced mechanical properties relevant for clinical use in facial reconstructive surgery.     

脂肪来源细胞体外构建组织工程软骨的初步探索

目的 探讨脂肪来源细胞(adipose-derived cells,ADCs)在体外构建特定形态软骨的可行性.方法 脂肪组织由整形外科吸脂术获得.酶消化法分离抽吸物中细胞,体外扩增.以第3代细胞接种PLGA生物支架,在成软骨培养基中体外诱导4周,大体观察、组织学检测构建组织的成软骨能力.结果 大体观察见诱导组能维持圆柱形态.非诱导组失去原有形态,单纯支架组完全塌陷.组织学上诱导组局部检测到软骨陷窝包埋于嗜碱性基质中,Massens's染色和Safranin'O染色示胶原、蛋白多糖呈阳性,免疫组织化学染色示Ⅱ型胶原轻度阳性;非诱导组呈典型的疏松结缔组织结构,组织学特殊染色均呈阴性.结论 脂肪来源细胞虽为多种细胞混合群体,但作为构建特定形态软骨的种子细胞,具有可行性.     

骨髓基质细胞膜片复合聚乳乙醇酸支撑体体外构建管状软骨

目的 研究利用骨髓基质细胞膜片复合聚乳乙醇酸(ploy of lactic-co-glycolic acid,PLGA)支撑体,在生物反应器条件下体外构建管状软骨的可行性.方法 分离兔骨髓基质细胞,高密度连续培养,转化生长因子-1诱导构建成干细胞膜片,制作圆柱状PLGA支撑体,将细胞膜片均匀缠绕在表面.静置孵育14 d,使细胞膜片与PLGA相互贴附后,进入生物反应器动态培养8周后,取出标本.从大体形态、组织学结构、蛋白多糖含量以及生物力学性能等方面评价形成软骨的理化特性.结果 通过此策略构建的软骨外观与天然软骨组织非常相似,保持着良好的管状外形,颜色呈乳白色,有光泽,质地均匀,弹性好,具有中等偏软的硬度.组织学结果显示总体结构呈现软骨样结构,HE染色可见软骨样细胞分布于细胞陷窝之中,周围是均匀的细胞外基质,番红-0染色可见细胞外基质着色为鲜红色,提示蛋白多糖含量丰富,有大量软骨基质物产生.结论 细胞膜片复合支撑体策略能形成管状形态的软骨组织,为气管软骨的再造提供了新的方法,有可能解决气管缺损的临床难题.     

Integration of engineered cartilage.

The structure and function of cartilaginous constructs, engineered in vitro using bovine articular chondrocytes, biodegradable scaffolds and bioreactors, can be modulated by the conditions and duration of tissue cultivation. We hypothesized that the integrative properties of engineered cartilage depend on developmental stage of the construct and the extracellular matrix content of adjacent cartilage, and that some aspects of integration can be studied under controlled in vitro conditions. Disc-shaped constructs (cultured for 5+/-1 days or 5+/-1 weeks) or explants (untreated or trypsin treated cartilage) were sutured into ring-shaped explants (untreated or trypsin treated cartilage) to form composites that were cultured for an additional 1-8 weeks in bioreactors and evaluated biochemically, histologically and mechanically (compressive stiffness of the central disk, adhesive strength of the integration interface). Immature constructs had poorer mechanical properties but integrated better than either more mature constructs or cartilage explants. Integration of immature constructs involved cell proliferation and the progressive formation of cartilaginous tissue, in contrast to the integration of more mature constructs or native cartilage which involved only the secretion of extracellular matrix components. Integration patterns correlated with the adhesive strength of the disc-ring interface, which was markedly higher for immature constructs than for either more mature constructs or cartilage explants. Trypsin treatment of the adjacent cartilage further enhanced the integration of immature constructs.     

A biomechanical analysis of an engineered cell-scaffold implant for cartilage repair

This study evaluated the biomechanical and physical properties of newly formed cartilage engineered from isolated chondrocytes in combination with matrix components. Four groups of constructs were studied. Group A consisted of lyophilized articular cartilage chips mixed with a cell-fibrinogen solution and thrombin to obtain constructs made of fibrin glue, chondrocytes, and cartilage chips. Group B constructs were prepared using fibrin glue and cartilage chips without cells. Group C contained chondrocytes in fibrin glue without chips, and group D comprised constructs of fibrin glue alone. Specimens were implanted in the subcutaneous tissue of nude mice for 9 weeks. At necropsy the specimens were examined grossly, physically, biomechanically, and histologically. The original, preimplantation mass of the constructs was retained only in experimental group A. Histological analysis of specimens in experimental groups A and C demonstrated the presence of newly formed cartilaginous matrix, whereas only fibrotic tissue was observed in control groups B and D. Biomechanical analysis demonstrated higher mean values of equilibrium modulus in the experimental samples of group A with respect to all control groups. This study demonstrated that adding lyophilized cartilage chips to a fibrin glue-engineered cartilage construct maintains the biomechanical properties and the original mass after medium-/long-term in vivo transplantation.