热放疗对舌鳞癌Tca8113细胞及其耐药细胞株耐药性的影响

目的：探讨热放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞耐药性的影响。方法：实时定量逆转录PCR（RT—PCR）检测热放疗对Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞多药耐药基因1（MDR1）、多药耐药相关蛋白1基因（MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π基因（GST-π）表达的影响和检测热放疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果：Tca 8113／CBDEA和Tca 8113细胞热放疗后耐药基因MDR1的表达在4h和24h无明显改变（P〉0．05）。MRP1基因的表达在4h和24h组均有明显下降（P〈0．05），GST-π基因表达在4h组Tca 8113和Tca 8113／CBDEA的表达无明显改变（P〉0．05），在24h组有明显下降（P〈0．05）．热放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显上升。结论：热放疗联合应用抑制了放疗造成的耐药基因表达上升，增加了细胞内的药物浓度，热放疗联用不会促使肿瘤细胞产生MDR。     

载体携带小干扰RNA抑制Tca8113细胞血管内皮生长因子的表达

目的了解小干扰RNA（siRNA）对人舌癌细胞株Tca8113血管内皮生长因子（VEGF）表达的抑制作用。方法构建2对针对血管内皮生长因子的siRNA真核表达载体（Pu-VEGF-siRNA1，Pu-VEGF-siRNA2），经脂质体Lipofectamine2000转染Tca8113细胞，以空载体组作实验对照组，未转染组作空白对照组。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组化、酶联免疫吸附（ELISA）方法分别检测转染后的Tca8113细胞VEGF mRNA及蛋白表达。结果与实验对照组和空白对照相比较，转染Pu-VEGF-siRNA1和Pu-VEGF-siRNA2后Tca8113细胞的VEGF mRNA 和蛋白表达明显下降。结论通过RNA干扰技术能有效抑制舌癌Tca8113细胞VEGF mRNA和蛋白的表达。     

Cyclin D1反义寡核苷酸对Tca8113/CDDP细胞基因转录表达的影响

目的：构建细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的反义寡核苷酸真核表达载体,并检测其转染Tca8113／CDDP细胞系后的表达情况。方法：以Tca8113／CDDP细胞总RNA为模板,应用RT-PCR法扩增cyclinD1全长．通过克隆至pUCm-T载体中,测序完全正确;经IPrG诱导,可正确表达蛋白。上下游分别利用HindIII和EcoRI的酶切位点插入真核表达载体pcDNA3．1,测序鉴定;并构建表达cyclin D1反义寡核苷酸的2个重组载体,通过Lipofectamine将其导入Tca8113／CDDP细胞系中,G418筛选获得阳性稳定表达细胞系：通过RT-PCR、免疫组化检测cyclin D1基因转录和蛋白表达。结果：成功构建pcDNA3．1-cyclin D1真核表达载体,分别命名为pcDNA3．1空载体（Co）、cyclin D1 mRNA 5’端为靶区的反义载体(C5’)、cyclin D1 mRNA 3’端为靶区的反义载体(C3’)、cyclinD1正义载体(CDl)。3’端反义寡核苷酸转染细胞后,cyclin D1 mRNA表达水平降低58．8％,mRNA5’端反义寡核苷酸组无明显抑制。免疫组化结果显示,转导正义寡核苷酸组cyclin D1阳性表达为最高,转导mRNA3’端、mRNA5’端反义寡核苷酸组为弱阳性表达。结论：cyclin D1 mRNA3’端反义寡核苷酸能明显抑制cyclin D1在Tca8113／CDDP中的表达,为进一步研究逆转Tca8113／CDDP耐药性提供了实验工具。     

Tca8113细胞系耐药性的实验研究

目的：建立耐顺铂（CDDP）人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113/CDDP,对其耐药特性进行研究,方法：应用间歇性加药,逐步递增剂量,体外连续透导培养方法,获得Tca8113耐药细胞,采用MTT法,琼脂糖凝胶电泳和免疫组化法对细胞增增时间、裸鼠成瘤性、化疗药敏感性,P-gp和GST－π蛋白表达进行研究。结果：初步建成耐CCDP的人舌鳞癌细胞系（Tca8113／CDDP）,其耐CDDP浓度为10μmol/L。该细胞同时对卫猛（Vm-26)、博来霉素（BLM）、长春地辛、（VDS）、表阿霉素（E－ADM）、泰素（Taxol)等化疗药物产生交叉耐药。连续传代1月后,倍增时间从29．9h降至16．7h,具有裸鼠成瘤性,瘤体倍增加速。CDDP作用Tca8113细胞后,电泳显示有凋亡细胞特有的“梯状”条带,耐药细胞Tca8113／CDDP则无。P－gp（P－糖蛋白）及GST－π表达量升高,表明MDR－1mRNA表达水平增高,结论：CDDP能致Tca8113细胞耐药性。Tca8113／CDDP细胞系具有多药耐药特性,GSH／GST解毒系统可能与Tca8113／CDDP耐药性的产生。     

放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞多药耐药蛋白及耐药性的影响

目的：探讨放疗对舌鳞癌Tca 8113细胞和耐药的Tca 8113／CBDEA细胞耐药性的影响。方法：应用免疫组化SP法检测放疗对P-糖蛋白（P-glycoprotein,P—gP）、多药耐药相关蛋白1（muhidrug resistance associate protein 1,MRP1）和谷胱甘肽硫-转移酶π（glutathione S—tranferase π,GST-π）表达的影响和检测放疗对细胞内阿霉素浓度的影响。结果：Tca 8113／CBDEA细胞在放疗后4hP—gP,MRP1,GST-π耐药蛋白表达无明显上升,24h耐药蛋白的表达明显升高（P〈0．01）,Tca8113细胞的耐药蛋白表达在4h和24h时均有明显上升（P〈0．01）。放疗以后肿瘤细胞内阿霉素（ADM）浓度有明显下降。结论：放疗可引起舌鳞癌细胞的耐药。提醒我们对舌癌患者进行放疗和化疗的方案设计时应考虑此点。     

细胞周期蛋白D1反义寡核苷酸调控联合顺铂抑制口腔鳞癌耐药细胞的研究

目的通过体内外实验探讨细胞周期蛋白（cyclin D1）与舌鳞状细胞癌对顺铂（CDDP）耐药细胞系（Tca8113/CDDP）耐药的相关性.方法通过脂质体将cyclin D1正义、反义寡核苷酸序列分别导入Tca8113/CDDP细胞内.用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测转染细胞系和耐药细胞系体外生长增殖情况及对顺铂的敏感性.将被转染的细胞及Tca8113/CDDP细胞接种于裸鼠皮下,建立移植瘤模型,共18只,每组6只.给予顺铂腹腔注射治疗,观察移植瘤体积变化,绘制生长曲线;称取瘤重,计算抑瘤率;光镜下观察移植瘤组织病理学变化.结果转导mRNA 3＇cyclin D1反义寡核苷酸的Tca8113/CDDP细胞在动物体内外生长明显受到顺铂的抑制;裸鼠皮下移植瘤抑瘤率达74%（P＜0.05）,移植瘤重量较对照组和转导正义寡核苷酸序列组差异均有统计学意义（P＜0.05）;光镜下可见反义寡核苷酸组移植瘤坏死明显.结论cyclin D1基因的反义调控联合顺铂能抑制Tca8113/CDDP细胞的生长能力及体内移植瘤的生长.研究结果提示：抑制cyclin D1可能增加口腔鳞状细胞癌对顺铂的敏感度.     

靶向survivin基因的shRNA真核质粒表达稳定株的筛选和建立

目的:针对survivin基因,构建短发卡状RNA干扰(short hairpin RNA interference,shRNA interference)真核质粒表达载体,并转染到高表达survivin基因的舌鳞癌细胞株Tca8113中,筛选出稳定低表达survivin基因的细胞株.方法:针对survivin基因的mRNA序列设计,并合成2对寡核苷酸序列,插入质粒pSilencerTM-2.1U6-neo中,形成重组质粒(PS1和PS2).用大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体介导转染Tca8113细胞,G418筛选得到稳定表达株,荧光实时定量PCR和Western印迹检测survivin基因在mRNA和蛋白水平的变化.采用SAS8.0软件包对数据进行t检验.结果:2个真核质粒表达载体均构建成功,并筛选出转染成功的细胞.与对照组相比,PS1和PS2转染的Tca8113细胞中的survivin基因在mRNA水平均显著下降,P<0.05;在蛋白水平,PS2转染后显著下降,P<0.01.结论:本研究成功建立针对survivin基因的shRNA质粒载体,并筛选出稳定低表达survivin基因的Tca8113细胞,为口腔鳞癌的基因治疗提供了理论基础.     

Naa10p 表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素敏感性的影响

目的：观察 N-α乙酰基转移酶（Naa10p）表达对舌鳞癌 Tca8113细胞平阳霉素（PYM）敏感性的影响。方法：采用慢病毒体系分别构建干扰及过表达 Naa10p 的 Tca8113细胞株,并设立相应的对照细胞 Tca8113-LV-NC,鉴定干扰和过表达效率,MTS 法检测药物处理后各处理组细胞对 PYM的敏感性。结果：干扰 Naa10p 的 Tca8113-LV-shNaa10p 细胞、过表达Naa10p 的 Tca8113-LV-Naa10p 细胞与对照细胞 Tca8113-LV-NC 对平阳霉素的半数抑制浓度（IC50）分别为（20．772±0．106）μg／ml、（2．157±0．123）μg／ml、（6．301±0．069）μg／ml（组间比较,P ＜0．05）。结论：下调 Naa10p 表达可降低口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性,上调 Naa10p 表达可增强口腔鳞癌细胞 Tca8113对平阳霉素的敏感性。     

siRNA干扰MDR1逆转口腔舌癌耐药性表型的实验研究

目的：探讨MDR1siRNA对人舌癌耐药细胞株TCA8113多药耐药性的影响。方法：以人舌癌耐药细胞株TCA8113/DDP为靶细胞,将针对MDR1基因合成,并已鉴定和测序后的siRNA分子利用脂质体介导转染TCA8113/DDP细胞,采用G418筛选克隆细胞,RT-PCR检测MDR1基因mRNA表达,免疫组织化学法测定P-糖蛋白（P-gp）表达;MTT比色法检测TCA8113/DDP细胞对顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、平阳霉素（PYM）的敏感性。结果：经转染成功的阳性克隆细胞TCA8113/DDP的MDR1mRNA和P-gp的表达均被抑制。TCA8113人舌癌耐药细胞顺铂（DDP）、卡铂（CBP）、平阳霉素（PYM）的IC50分别降至3.43μmol/L,1.72μmol/L和1.05μmol/L（P〈0.01）。结论：稳定转染含编码MDR1siRNA的质粒载体能特异性地阻抑人舌癌多药耐药细胞TCA8113细胞MDR1基因的表达,逆转其对抗癌药物的耐受性。     

Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素协同抑制鳞状细胞癌细胞增殖的研究

目的：研究bcl-xl反义寡核苷酸（ASODN）与博莱霉素（BLM）联用对口腔鳞状细胞癌细胞（Tca8113）增殖的影响及其作用机理。方法：设计合成bcl—xl的ASODN在脂质体的介导下转染Tca8113细胞,设无义寡核苷酸组（NSODN）和空白对照组进行比较。48h后博莱霉素作用于转染后的细胞。以荧光原位末端缺口标记法检测bcl-x1反义寡核苷酸与博莱霉素诱导癌细胞凋亡的作用机理,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：bcl-xl反义寡核苷酸与博莱霉素的作用机理为激活细胞的内源性核酸内切酶,使核小体内DNA断裂出现缺口,产生凋亡。ASODN组、BLM组和ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于NSODN组和空白对照组（P〈0．05）。ASODN＋BLM组的凋亡率明显高于ASODN组和BLM组（P〈0．05）。结论：Bcl-xL反义寡核苷酸与博莱霉素能协同抑制口腔鳞状细胞癌细胞的增殖。     

RB1CC1在人和小鼠口腔癌发生发展中表达的比较研究

目的:比较视网膜母细胞瘤RB1-诱导卷曲蛋白1(RB1CC1)在人和小鼠正常口腔黏膜、上皮异常增生组织及口腔鳞状细胞癌中的表达,并探讨其在口腔癌发生发展过程中的作用。方法:采用免疫组化和RT-PCR检测人及小鼠在正常口腔黏膜、上皮异常增生、高分化鳞癌原发灶组织中RB1CC1蛋白及基因的表达情况。结果:RB1CC1蛋白在人上皮异常增生组、高分化鳞癌组的阳性表达高于正常组(P<0.05);RB1CC1蛋白在鼠正常组、异常增生组、高分化鳞癌组阳性表达逐渐增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。人RB1CC1 mRNA的表达量在异常增生组与高分化鳞癌组无明显差异,正常口腔黏膜组均高于异常增生组与高分化鳞癌组(P＜0.05);小鼠RB1CC1 mRNA的表达量在正常口腔黏膜组与异常增生组、高分化鳞癌组差别无统计学意义。结论:RB1CC1表达在人和小鼠相似, RB1CC1可能参与了口腔鳞癌的早期癌变过程。     

No correlation of five gene polymorphisms with periodontal conditions in a Greek population

BACKGROUND: Various studies have examined possible correlations between a number of cytokine gene polymorphisms and periodontal disease in populations of different origins. The present study sought the correlation between four single-nucleotide polymorphisms (IL1A+3954, IL1B+4845, TNFA-308, COL1A1 Sp1), a variable number of tandem repeats polymorphism (IL1RN intron 2) and periodontal conditions in subjects of Greek origin. METHODS: One hundred and ninety-two healthy subjects, stratified as non-periodontitis and periodontitis (chronic and aggressive) cases, participated in the present study. Genotyping was performed by polymerase chain reaction-based techniques using the primers and conditions described in the literature. The frequencies of genotypes between study groups were compared using Genepop v3.3 genetic software and Instat statistical package. RESULTS: No differences were observed among the groups concerning the distributions of genotypes under investigation. CONCLUSIONS: Carriage rates of the polymorphisms under investigation in systemically healthy subjects of Greek origin are well within the range reported for Caucasians but these polymorphisms cannot discriminate between non-periodontitis and periodontitis (chronic or aggressive) cases.     

唾液腺黏液表皮样癌组织中分化抑制因子-1和血小板反应蛋白-1的表达

目的探讨不同恶性程度的唾液腺黏液表皮样癌组织中分化抑制因子- 1（Id- 1）、血小板反应蛋白- 1（TSP- 1）的表达情况及相互关系。方法以不同恶性程度的唾液腺黏液表皮样癌和正常唾液腺组织为材料,采用免疫组化SP法检测正常唾液腺组织以及高分化、中分化和低分化黏液表皮样癌组织中Id- 1、TSP- 1基因的表达情况。结果Id- 1和TSP- 1在正常唾液腺中的阳性表达率明显低于在黏液表皮样癌组织中的阳性表达率（P值分别为0.000和0.013）。在中分化和低分化黏液表皮样癌组织中Id- 1的蛋白表达率明显高于高分化黏液表皮样癌（P值分别为0.001和0.002）,而Id- 1在中分化和低分化黏液表皮样癌组织中的蛋白表达率差异无统计学意义（P>0.05）。在低分化黏液表皮样癌组织中TSP- 1的蛋白表达率明显低于高分化黏液表皮样癌（P=0.014）,而TSP- 1在中分化和低分化黏液表皮样癌组织中的蛋白表达率差异无统计学意义（P>0.05）,在中分化和高分化黏液表皮样癌组织中的蛋白表达率差异无统计学意义（P>0.05）。TSP- 1的表达与Id- 1呈负相关（r=- 0.394,P=0.002）。结论TSP- 1的表达可能抑制黏液表皮样癌的发生,而Id- 1的表达则可能促进黏液表皮样癌的发生,二者之间呈负相关。     

Immunolocalization of interstitial collagenase (MMP-1) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1)in radicular cysts

To investigate the mechanisms involved in expansion of radicular cysts, monoclonal antibodies against interstitial collagenase (MMP-1) and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1) were used to localize the sites of MMP-1 and TIMP-1 expression in 30 radicular cysts. Positive MMP-1 staining was detected in the lining epithelium and subepithelial fibroblasts, macrophages, endothelial cells and osteoblasts/osteocytes in all specimens. Positive TIMP-1 staining was identified in osteoblasts/osteocytes and endothelial cells of all specimens, and in the lining epithelium and subepithelial fibrous connective tissue wall of five radicular cysts with an intense inflammatory cell infiltrate. The number and distribution of positive cells for MMP-1 or TIMP-1 varied widely among individual specimens, but strong immunostaining was constantly detected at sites with prominent subepithelial inflammation. Results here support the hypothesis that MMP-1 may play an important role in the expansion of radicular cysts. The absence of TIMP-1 expression in lining epithelium and subepithelial fibroblasts and macrophages in most cases studied indicated that an imbalance between MMP-1 and TIMP-1 production may lead to radicular cyst expansion.     

大鼠牙髓炎组织中细胞间粘附分子-1的表达及意义

目的 观察细胞间粘附分子-1(ICAM-1)在鼠实验性牙髓炎中的变化,探讨其在实验性牙髓炎中的作用.方法 建立大鼠实验性牙髓炎模型,用免疫组化法及图像分析技术检测正常牙髓、牙髓炎即刻组、1天组、3天组、5天组、7天组中ICAM-1的表达情况.结果 正常牙髓组织中存在ICAM-1,ICAM-1在实验组比正常组阳性表达增强,光密度值增高,实验组第一天达到高峰,到第七天逐渐减少,总体差异有统计学意义.结论 与正常牙髓组织相比,炎症牙髓组织中ICAM-1表达增强,提示ICAM-1在牙髓炎发展过程中起一定作用.     

FAP-1在5-azaC诱导的HSG细胞凋亡中的作用

目的体外研究FAP-1在5-氮胞苷（5-azacytidine,5-azaC）诱导的HSG（human salivary gland。HSG,人涎腺导管细胞,起源于人颌下腺闫管细胞）细胞凋亡中的作用,为应用5-azaC对涎腺肿瘤进行治疗奠定理论和实验基础。方法HSG细胞转染FAP-1反义寡核苷酸前后分别用5-azaC处理,观察转染前后FAP-1表达的变化,同时观察5-azaC对转染前后细胞凋亡作用是否发生变化。结果在形态上转染后的细胞与转染前无明显区别,转染FAP-1反义寡核苷酸链的HSG细胞FAP-1表达较转染前减弱,转染后HSG细胞对5-azaC比转染前敏感,加入5umol／L5-azaC后,凋亡细胞数增加。结论FAP-1在5-azaC诱导的HSG细胞凋亡中起一定作用。     

口腔扁平苔藓患者外周血单个核细胞中 PD-1和 PD-L1的表达及意义

目的：了解口腔扁平苔藓（OLP）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中 PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA 的表达及意义。方法：分别采用流式细胞术和散射比浊法分析36例 OLP 患者外周血淋巴细胞亚群（CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD19＋、CD16＋＋56＋）状况和检测患者体液免疫指标（lgG、lgA、lgM、C3、C4）。采用荧光定量 PCR 法（qPCR）检测36例 OLP 患者及18例健康对照组 PB-MCs 中 PD-1 mRNA、PD-L1 mRNA 的表达情况并分析其与 OLP 患者免疫功能状况的相关性。结果：OLP 患者外周血中 CD3＋、CD4＋、CD8＋、CD16＋＋56＋（NK）均低于正常值（P ＜0．05）,CD19＋（B）高于正常值（P ＜0．05）;血清补体 C3、C4较正常值降低（P ＜0．05）,免疫球蛋白 lgM较正常值增高（P ＜0．05）。OLP 患者 PBMCs 中 PD-1 mRNA 及 PD-L1 mRNA 的相对表达量均高于对照组（P ＜0．05）,且 PD-1 mRNA 与 PD-L1 mRNA 的相对表达量呈正相关。PD-1 mRNA 的相对表达量与 OLP 患者 CD4＋呈负相关,与 lgG 呈正相关;PD-L1 mRNA 的相对表达量与 CD19＋呈正相关。结论：OLP 患者 PBMCs 中 PD-1、PD-L1 mRNA 的表达上调与 OLP 患者免疫功能状况相关,提示 PD-1／PD-L1通路可能参与 OLP 的免疫发病机制。     

大鼠正畸牙移动中牙周组织内STRO-1动态变化的研究

目的:通过观察大鼠正畸牙移动中牙周组织内STRO-1的动态变化,研究大鼠牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)在正畸牙周组织改建中的作用及表达变化的规律.方法:选用幼年SD大鼠,建立正畸牙移动的模型,分别在加力后1、3、5、7、10、14 d处死动物,制备标本.应用EnVision系统两步法和图像分析进行半定量分析.结果:正常大鼠牙周组织中STRO-1表达较低.STRO-1在加力组牙周膜中的表达与对照组比较,差异有显著性,在正畸牙移动过程中STRO-1阳性显色细胞明显增多.结论:STRO-1的表达强度与牙周改建的活跃程度相关,揭示了在正畸力作用下牙周组织改建的可能机制和牙周膜干细胞的作用.     

慢性牙周炎状态下牙龈卟啉单胞菌rag-1基因的表达变化

目的:分析不同牙周炎症状态下牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonal gingivalis,P.gingivalis)rag-1基因mRNA的表达规律.方法:收集150例慢性牙周炎患者的龈下菌斑,PCR法检测P.gingivalis和rag-1基因.对P.gingivalis rag-1基因阳性的菌斑样本,采用RT-PCR法检测rag-1 mRNA的表达水平,并比较不同炎症状态下的表达差异.应用SPSS11.0软件包对数据进行配对t检验和秩相关检验.结果:轻度组、中度组和重度组的rag-1基因mRNA的相对表达水平分别为1.19±0.06、0.46±0.05和2.22±0.10(P<0.05).结论:rag-1基因的mRNA表达水平随着牙周组织破坏程度及炎症状态的不同而改变.