绿色荧光蛋白标记的人肝癌细胞在Balb／c鼠前房成瘤的观察

目的观察绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）标记的人肝癌细胞（human hepatocellular carcinoma cell，MHCC97L）在Balb／c鼠眼前房生长成瘤及全身转移情况，探讨前房作为肿瘤细胞培养的活体器官，GFP作为活细胞标记追踪肿瘤细胞生长、转移的优势并初步探讨肿瘤转移的机制。方法将携带GFP的逆转录病毒MP71-GFP-PRE转入人肝癌细胞MHCC97L。于手术显微镜下在20只Balb／c小鼠眼的前房中分别接种2止细胞密度为1．0×10^6个／mL的肝癌细胞悬液。术后15，30和45d在荧光显微镜下观察小鼠前房肿瘤生长，冰冻切片在荧光显微镜下观察眼及脑、肝、肺等全身转移情况，并做病理切片HE染色观察肿瘤细胞。结果稳定表达GFP的肝癌细胞基本保持了亲代细胞的特征，在前房的成瘤率为100％，随着时间的推移这些肿瘤团块逐渐增大。术后处死小鼠，在荧光显微镜下未见脑、肝、肺等脏器中有荧光团块或单个荧光点分布。眼球冰冻及病理切片均可见前房、睫状沟、虹膜基质内和玻璃体腔内肿瘤细胞生长。结论前房可以作为有效的培养肿瘤细胞的活体器官。GFP标记瘤细胞后，利用荧光显微镜能在活体观察到肿瘤团块在前房内的生长，以及单个瘤细胞和普通显微镜下无法分辨的微小病灶。     

绿色荧光蛋白标记的视网膜母细胞瘤原位移植瘤模型

目的　应用绿色荧光蛋白 (GFP)基因标记人类视网膜母细胞瘤 (RB)细胞 ,建立新型裸鼠原位移植瘤模型 ,探讨RB的生长和转移特征。方法　利用脂质体将GFP真核表达质粒pEGFP N1转入人类RB细胞 (HXO RB44) ,新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。 30(6 0只眼 )裸鼠每只眼视网膜下腔均注入 2 μl细胞密度为 (4 5～ 5 5 )× 10 8个细胞 /ml的RB细胞悬液。术后利用带荧光的体视镜连续观察肿瘤生长情况 ,于不同时间点处死动物 ,荧光显微镜观察视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况。结果　术后 34～ 37d可观察到肿瘤生长至眼外 ,并可观察到肿瘤沿视神经向颅内转移 ,肿瘤细胞沿视神经鞘、睫状后长动脉浸润生长 ;移植瘤病理组织学表现类似于人类RB肿瘤 ;免疫组化染色肿瘤细胞GFP呈阳性表达。结论　经GFP基因标记的人类RB细胞裸鼠视网膜下腔移植建立的RB移植瘤模型 ,为研究自然状态下RB肿瘤的生长和转移提供了新的工具。     

绿色荧光蛋白标记的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型

目的 建立新型裸鼠脉络膜恶性黑色素 瘤原位移植瘤模型。 方法 利用脂质体将绿色荧光蛋白（GFP）真核表达 质粒pEGFP-N₁转入人脉络膜恶性黑色素瘤细胞（OC-1），新霉素、荧光显微镜及流式细胞仪筛选稳定表达GFP的细胞克隆。将2 μl细胞浓度为4.5×10⁷~5.5×10⁷个/ml的细胞悬液注射到麻醉后的40只裸鼠右眼视网膜下间隙，左眼不注射作为对照眼。手术后利用带荧光的体视显微镜连续观察肿瘤生长情况，分别于肿瘤生长的眼内期、眼外期及衰竭期处死动物，荧光显微镜观察裸鼠视神经、颅底、肺、肝、肾的肿瘤转移情况，并行肿瘤组织的GFP免疫组织化学染色。 结果 手术后10~12 d肿瘤开始生长，血管扩张、扭曲，新生血管形成；手术后20~22 d肿瘤占满玻璃体腔；手术后24~26 d肿瘤生长至眼外；眼外期后，迅速进入衰竭期，衰竭期嗅球、肾、肺、肝脏有转移灶。移植瘤病理组织学表现类似于人脉络膜恶性黑色素瘤；免疫组织化学染色肿瘤细胞GFP染色阳性。 结论 以GFP基因标记的OCM-1经裸鼠视网膜下间隙移植建立的脉络膜恶性黑色素瘤原位移植瘤模型，为研究自然状态下肿瘤的生长和转移提供了一个新的方法。 （中华眼底病杂志，2004，20：245-248）     

建立人眼葡萄膜黑色素瘤裸鼠移植瘤模型的初步探讨

目的研究建立人眼葡萄膜恶性黑色素瘤动物模型的方法,对比不同的移植方法对成瘤率的影响,为葡萄膜恶性黑色素瘤的实验研究提供体内实验平台。方法分别采用原位移植及异位移植的方法,选取BALB／L-nu裸鼠35只,随机分为3组,将原代培养的第三代人眼恶性黑色素瘤细胞制成细胞悬液,分别接种于裸鼠前房(前房组——原位移植)及皮下(皮下A组——异位移植),另以手术切除的新鲜人眼葡萄膜恶性黑色素瘤制作成的完整瘤组织块移植到皮下(皮下B组),在同样条件下饲养,观察其成瘤率和大体及组织病理学形态。结果裂隙灯显微镜下观察可见前房组成瘤率46．6％,14例在接种后第3天即可见前房内黑色片状小肿物,紧贴在角膜内皮及虹膜表面。2个月时肿瘤基本充满前房。皮下A组成瘤率20％,2例于接种1周后可见局部出现黑色斑块,呈椭圆形,轻度隆起。1个月后肿物逐渐增大,接种后60 d长至1．0 cm×1．0 cm,色黑,呈圆形。病理切片检查证实为黑色素瘤。皮下B组接种肿物后,10例中有8例未见肿瘤长大,3个月后自行消退。另2例肿物先扁平,后弥散,不符合肿瘤不断生长的特性,不计人成瘤率。结论将原代培养的人眼葡萄膜黑色素瘤细胞混悬液分别注入裸鼠眼前房及皮下,能建立裸鼠的原位及异位移植瘤模型,成瘤率明显高于组织块皮下移植。其中原位移植瘤模型成瘤率远高于异位移植,且更符合生理特点,有利于眼科操作和裂隙灯显微镜观察,是建立人葡萄膜黑色素瘤裸鼠模型的良好选择。     

兔眼前房视网膜母细胞瘤动物模型的建立

目的 建立一种稳定的视网膜母细胞瘤(Rb)动物模型.方法 38只新西兰大白兔,根据兔眼前房Rb细胞注入量及免疫抑制因素随机分为10组,除正常组(A组)2只(4只眼)外,其余B～J 9组每组各4只(8只眼),兔眼前房注入Rb细胞后每天观察兔眼前房内Rb肿物的生长情况,30 d后处死动物,行组织病理学及免疫组织化学检查,并分析其成瘤率及维持时间等.结果 C、D、F、G、H、I、J组动物前房内均有不同程度的Rb肿物生长,成瘤率为100%;C组与D、F、G组3组和H、I、J组3组之间前房维持时间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).Rb胞浆神经元特异性烯醇酶(NSE)表达较强,S100表达较弱.结论 兔眼前房内注入Rb细胞的密度大于4×107个/mL时会有不同程度的肿物生长;单独应用环孢素A(CsA)滴眼液、环磷酰胺(CTX),或二者联合应用,均能使兔眼前房内肿物在30 d内稳定生长.     

三氧化二砷对人SO-Rb50瘤细胞在大鼠眼内生长及表达NGF/VEGF的影响

目的:了解三氧化二砷(AT0)对人SO-Rb50瘤细胞株在SD幼鼠前房内表达神经生长因子及血管内皮生长因子的影响。方法:出生14d的SD幼鼠10只,将含24μmol/LATO的5×108/LSO-Rb50瘤细胞悬液0.03mL注射到任1眼前房,另1眼前房注射同量不含ATO的瘤细胞悬液作为对照,每日裂隙灯观察前房肿瘤形成的情况;接种后20d,分别取出鼠前房内生长的组织测定其神经生长因子(NGF)、血管内皮生长因子(VEGF)含量,并通过统计学分析ATO的影响。结果:将含24μmol/LATO的瘤细胞悬液注射前房后,前房内出现混浊的时间平均为6d(对照组为2d),明显延长(T=9.487,P<0.01),前房内新生血管形成时间平均为13.8d(对照组为9.7d),也明显延长(T=5.212,P<0.01);无ATO干预组肿瘤组织NGF平均含量为2.1μg/L,ATO干预组为3.1μg/L,ATO干预组肿瘤组织NGF含量增加(T=3.544,P<0.05);无ATO干预组肿瘤组织VEGF平均含量为2.6μg/L,ATO干预组为0.9ng/L,ATO干预组肿瘤组织VEGF含量显著降低(T=27.8,P<0.01)。结论:ATO能够显著延长SO-Rb50瘤细胞悬液注射后前房内出现混浊的时间及新生血管形成时间,促进肿瘤组织的NGF表达,同时抑制肿瘤组织的VEGF表达。     

经绿色荧光蛋白基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp的生物学行为与基因表达

目的 研究经绿色荧光蛋白（GFP）基因修饰的人脉络膜黑色素瘤细胞株OCM-1-gfp在小鼠体内的生长过程、转移规律，以及可能影响肿瘤生长和转移的因素。 方法 用脂质体将GFP基因导入人脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1，建立稳定、高水平表达GFP的克隆;分别接种到Balb/c裸鼠视网膜下和后大腿皮下，建立原位和异位肿瘤模型。眼内肿瘤生长情况用荧光显微镜直接观察，皮下肿瘤大小用游标卡尺测量;采用免疫组织化学方法对肿瘤内13种基因的表达进行检测。 结果 稳定表达GFP的脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1-gfp基本保持了亲代细胞的特征;能在裸鼠体内形成肿瘤并继续生长和转移;在基因表达方面，肿瘤抑制基因p16染色呈阴性，p53染色呈强阳性。其他的肿瘤抑制基因:视网膜母细胞瘤易感基因（Rb）、p21，转录调控因子（E-2F）、核因子κB（NFκB），细胞增生相关基因细胞周期素D1（cyclin D1）、增生细胞核抗原（PCNA），细胞凋亡相关基因bcl-2、bcl-XL/S和bax，以及表皮生长因子（EGF）及其受体（EGFR）呈现不同程度的阳性表达。 结论 GFP为直接观察脉络膜黑色素瘤在体内的生长和转移提供了标记;脉络膜黑色素瘤原位与异位移植瘤模型在成瘤率和生长情况方面无明显差异;由OCM-1-gfp生长形成的肿瘤p16、p53及NFκB、cyclin D1、PCNA及EGF和EGFR等多种基因表达异常。 (中华眼底病杂志, 2006, 22: 170-173)     

视网膜母细胞瘤细胞系裸小鼠异种移植瘤实验研究

利用视网膜母细胞瘤细胞系ＳＯ－Ｒｂ５０的细胞悬浮液，分别接种于裸小鼠右眼前房内及右颈背部皮下组织内，结果前房接种的７只裸小鼠均能形成眼内移植瘤，而皮下接种的７只裸小鼠只有１只形成皮下移植瘤。移植瘤的临床表现、组织形态学及免疫组织化学检查均与人类Ｒｂ相一致。文中分析了实验眼眼球突出的原因，讨论移植瘤瘤细胞分化程度不同的可能原因及建立动物移植瘤模型的重要意义。     

同种异体小鼠眼内移植性黑色素瘤模型的建立

目的 建立同种异体小鼠眼内黑色素瘤 模型，并观察其基本病理特征。 方法 昆明小鼠共36只，分为前房组、玻璃体腔组和足背皮下组，每组各12只。分别接种黑色素瘤B16F10细胞于小鼠右眼前房、右眼玻璃体腔或右足背皮下，然后对肿瘤的发生率、肿瘤眼溃破时间及瘤体的基本病理特征等进行连续32 d的观察，并作统计学分析。最后作小鼠肿瘤相关器官的病理解剖及组织切片观察。 结果 昆明小鼠移植性黑色素瘤的发生率分别为前房组12/12只眼，玻璃体腔组11/11只眼和足背皮下2/12只鼠。前2组的肿瘤发生率明显较高（χ2=17.143, P＝0.000；χ2=16.218, P=0.000）。前房组移植瘤比玻璃体腔组较早溃破眼球 (Log Rank =18.22, P=0.000)，其后肿瘤在眶内生长时均可见有被排斥而脱落的现象。32 d后，玻璃体腔组移植瘤平均直径较足背皮下组大(t=3.322，P=0.003)。在肿瘤切片观察中，眼内肿瘤未见坏死灶，而皮下肿瘤中央可见有大片坏死灶。 结论 该模型的建立方法简便, 重复性好, 在一定程度上可模拟人类眼内黑色素瘤的生物学行为, 为进一步研究其发生与发展机制提供了一种模型。 （中华眼底病杂志，2003，19：333-404）     

银杏叶提取物对幼年大鼠大视网膜神经节细胞保护作用的研究

目的 观察银杏叶提取物（EGb761）对培养幼年大鼠大视网膜神经节细胞（RGC）的保护作用;建立用荧光金逆行上丘标记鉴定体外培养大鼠RGC的方法。方法 12只鼠龄20 d Sprague-Dawley大鼠用荧光金行双侧上丘注射,标记RGC。6 d后摘除眼球,其中一只眼球行视网膜铺片,荧光显微镜下观察标记情况。另一只眼球摘除后分离视网膜,制成细胞悬液,倒置荧光显微镜下观察荧光着染的RGC形态。将细胞悬液分为对照组及浓度分别为0.03%、0.10%、0.30%、1.00%、3.00%的EGb761组,接种后3 h,1、3、5、7 d锥虫蓝染料排斥 法检测RGC的存活情况,同时记录细胞存活率。结果 逆行上丘标记后观察到RGC标记良好,视网膜细胞悬液中大RGC特征明显,离体后迅速死亡,荧光消失。锥虫蓝染料排斥法观察到在视网膜细胞悬液中,这种大RGC死亡迅速。加入不同浓度的EGb761后大RGC存活率明显增加,不同时间点与对照组比较大RGC存活率均有统计学意义（P＜0.01）,且呈明显剂量依赖关系（P＜0.01）。结论 EGb761对体外培养的RGC具有明显的保护作用;荧光金逆行上丘标记鉴定体外培养的RGC方法可行。     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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Effects of Adenosine Agonists on Intraocular Pressure and Aqueous Humor Dynamics in Cynomolgus Monkeys

The effects of single or multiple topical doses of the relatively selective A₁adenosine receptor agonists (R)-phenylisopropyladenosine (R-PIA) and N⁶-cyclohexyladenosine (CHA) on intraocular pressure (IOP), aqueous humor flow (AHF) and outflow facility were investigated in ocular normotensive cynomolgus monkeys. IOP and AHF were determined, under ketamine anesthesia, by Goldmann applanation tonometry and fluorophotometry, respectively. Total outflow facility was determined by anterior chamber perfusion under pentobarbital anesthesia. A single unilateral topical application of R-PIA (20–250 μg) or CHA (20–500 μg) produced ocular hypertension (maximum rise=4.9 or 3.5 mmHg) within 30 min, followed by ocular hypotension (maximum fall=2.1 or 3.6 mmHg) from 2–6 hr. The relatively selective adenosine A₂antagonist 3,7-dimethyl-1-propargylxanthine (DMPX, 320 μg) inhibited the early hypertension, without influencing the hypotension. Neither 100 μg R-PIA nor 500 μg CHA clearly altered AHF. Total outflow facility was increased by 71% 3 hr after 100 μg R-PIA. In conclusion, the early ocular hypertension produced by topical adenosine agonists in cynomolgus monkeys is associated with the activation of adenosine A₂receptors, while the subsequent hypotension appears to be mediated by adenosine A₁receptors and results primarily from increased outflow facility.