β-内酰胺酶分子生物学研究进展

50年前青霉素首次应用于临床,几年后就从链球菌中分离到了青霉素酶,以后随着β-内酰胺抗生素的不断开发和广泛应用,特别是近20年来随着超广谱新品种的大量应用,β-内酰胺酶的种类、底物谱和耐药程度均以惊人的速度在发展,不能不引起格外的重视。现将β-内酰胺酶分子生物学的研究进展综述如下:1 β-内酰胺酶的分类 根据Bush-Jacoby-Medeiros的最新分类法,β-内酰胺酶按照各自的底物和抑制轮廓分为4组,根据各自的核苷酸和氨基酸序列分属于A、B、C、D4个分子类别。是现代抗菌化疗中尚未突破的一个难点,也是针对细菌耐药机制研究开发新的有效抗菌药物的重点     

临床重要的β-内酰胺酶及其研究进展

β 内酰胺酶是细菌 ,尤其是革兰阴性菌对 β 内酰胺类抗生素耐药的重要介质。随着抗菌药物的广泛开发及应用 ,一些具有重要临床意义的新 β 内酰胺酶不断被发现 ,超广谱酶就是其中之一 ,熟悉或了解其特点 ,对指导治疗相应耐药菌株临床感染、研究耐药菌株感染的流行病学特征及规律、探讨分子耐药机制及研发新抗菌药物都有重要意义。1　超广谱 β 内酰胺酶 (Extended Spectrum β Lactam ses,ESBL)　是革兰阴性菌耐药的重要介质 ,以肠杆菌科中的克雷伯菌属及大肠埃希菌产生最为多见 ,也见于变形杆菌属、普罗菲登菌属、肠杆菌属细菌。该类酶…     

浙江省产超广谱β-内酰胺酶菌株SHV型β-内酰胺酶分布

随着三代头孢菌素如头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松和单环酰胺类抗生素在临床上的广泛使用 ,超广谱 β 内酰胺酶 (ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｐｅｃｔｒｕｍ β ｌａｃｔａｍａｓｅｓ ,ＥＳＢＬｓ)在革兰阴性杆菌中产生率不断增加 ,ＥＳＢＬｓ种类也不断增加 ,至 2 0 0 0年 6月 ,已发现近 10 0种ＥＳＢＬｓ亚型〔1〕,其中ＴＥＭ型有 6 7种 ,ＳＨＶ型有 2 4种 ,非ＴＥＭ非ＳＨＶ型有 2 0多种。ＴＥＭ和ＳＨＶ型分别由广谱酶ＴＥＭ 1、ＴＥＭ 2和ＳＨＶ 1编码基因中 1～ 5个位点发生点突变而来。各国各地区流行的ＥＳＢＬｓ亚型各不相同〔2〕。我们对…     

β-内酰胺酶与细菌耐药性

本文以nitrocefin法对213株革兰氏阴性杆菌进行了β-内酰胺酶定性检测,用等电聚焦技术对β-内酰胺酶进行定型,并比较了11种β-内酰胺抗生素对产酶与不产酶菌株的体外抗菌活性,以及不同酶型对细菌耐药性的影响。结果提示:产酶阳性率高达77.62％。产酶与     

SHV型β-内酰胺酶动力学及抑酶效应的研究

采用分光光度法研究革兰氏阴性菌产生的2种SHV型β-内酰胺酶的动力学。分别以L-B作图法求取Km和V_(max),以Dixon作图法求取Ki。结果表明:除SHV-1对第三代头孢菌素头孢噻肟没有水解作用外,SHV型β-内酰胺酶对青霉素类、第一代、第二代、第三代头孢菌素均有不同程度水解作用。头孢噻肟对SHV-2、有较高的亲和力(低Km),但V_(max)均不超过15％。抑酶实验结果证明头孢噻肟对SHV-2、有抑制作用,β-内酰胺酶抑制剂舒巴坦对SHV-1,2均有抑制作用。SHV型酶的最适pH值为6.6～7.4;最适反应温度是34℃～40℃。     

肠杆菌科产超广谱β-内酰胺酶细菌耐药性研究进展

肠杆菌科细菌是临床感染,尤其是医院内感染的常见致病菌,产生β-内酰胺酶是其耐β-内酰胺类抗菌药物的主要机制。近十余年该科细菌中不同种属、特别是克雷伯菌属,大肠埃希菌产生的超广谱β-内酰胺酶(ESBLs),能水解第三代头孢菌素及氨曲南,且常为多重耐药株,已引起临床注意。 根据ESBLs对β-内酰胺酶抑制剂的稳定性分为对β-内酰胺酶抑制剂敏感的ESBL和对其耐药的IRESB两大类,根据其衍生来源分为TEM、SHV型及非TEM、SHV型,ESBLs酶蛋白表型已近70种,几乎都由耐药质粒介导,耐药性极易传播。通过NCCLs推     

非典型β-内酰胺抗生素对β-内酰胺酶稳定性研究

Aztreonam(AZ)、亚胺硫霉素(IMI)属非典型β-内酰胺抗生素。本文以其它青霉素类,头孢类抗生素为对照,观察它们对11种标准β-内酰胺酶的稳定性及它们的抑酶作用。用头孢噻啶(CRD)作底物,用紫外分光光度计测定β-内酰胺酶活性,以及它们对β-内酰胺抗生素的相对水解率。研究结果表明,AZ、IMI与第三代头孢菌素头孢噻甲羧肟、头孢氨噻类似,对11种标准β-内酰胺酶均高度稳定,除酶K-1对头孢氨噻相对水解率达25％外,其它     

若干种β-内酰胺抗生素对β-内酰胺酶稳定性研究

以16种β-内酰胺抗生素对临床分离产酶株(克氏肺炎杆菌2株、大肠杆菌1株、鲍曼不动杆菌1株)和6种标准产酶株(TEM_5、SHV_4、PSE_3、OXA_5、D_(31)、K_1)进行药敏试验及β-内酰胺酶测定。结果显示:1.均对头孢唑啉(CEZ)、头孢哌酮(CPZ)耐药(MIC)分别≥32、64mg/L)。2.质粒介导的标准产酶株对青霉素类及头孢菌素类的相对水解率(RR)均较高,而染色体介导的D_(31)、K_1酶对头孢类水解作用较强。对于β-内酰胺酶的稳定性,美诺培南(MRPN)、亚胺培南(IMP)及头孢三代头孢他定(CTZ)对酶高度稳定;头孢噻肟(CTX)、头孢三嗪(CTRX)、头孢呋辛(CXM)优于CPZ;AMP、     

若干种β-内酰胺抗生素对β-内酰胺酶稳定性研究

以16种β-内酰胺抗生素对临床分离产酶株(克氏肺炎杆菌2株、大肠杆菌1株、鲍曼不动杆     

Pro167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶的动力学特征

目的 对Pr0167位点突变型CTX-M-14超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的动力学特征进行分析与评价.方法 以携带CTX-M-14基因的大肠埃希菌临床株为模板,克隆目的 基因,重组工程菌,并表达CTX-M-14型ESBL.进而采用基于重叠延伸PCR法的定点突变技术,将CTX-M-14型ESBL的167位点Pro(P)分别突变为Gly(G)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T),重组构建P167G、P167Q、P167S和P167T四株突变型的CTX-M-14工程菌.表达与纯化野生型、重组型和突变型CTX-M-14型ESBL,检测其水解β-内酰胺类抗菌素的酶动力学参数(Kcat、Km和Km).结果 对野生型与重组型CTX-M-14型ESBL的酶动力学参数进行配对t检验,结果显示两者Kcat(t=1.796,P=0.123)、Km(t=0.559,P=0.596)、Kcat/Km(t=0.893,P=0.406)间的差异无统计学意义(P>0.1).与重组CTX-M-14型ESBL相比,P167S突变型酶对头孢他啶的Km值大幅降低,为突变前的1/16(8.39/134.85);Kcat和Km值分别为突变前的2.87倍(1.81/0.63)和43.6倍(0.218/0.005);且对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、头孢呋辛、头孢曲松和头孢噻肟的Kcat/Km值都呈现出显著减小的趋势(P<0.05).与重组CTX-M-14 ESBL相比,P167Q和P167G突变型酶对头孢他啶的Kcat值亦大幅减小(P<0.01),而P167T突变型对头孢他啶的酶动力学参数无明显变化.结论 重组型与野生型CTX-M-14 ESBL之间各项酶动力学参数的差异无统计学意义(P>0.1).而P167S位点的突变,不仅增强了CTX-M-14型ESBL对头孢他啶的亲和力,也加快了酶-底物复合物的转换速率.通过对Pr0167位点4种突变型酶的动力学参数比较,初步说明突变型CTX-M ESBL对头孢他啶所具备的高水解活性机制,不能简单地归结于Pro167位点被小侧链氨基酸残基取代而导致酶活性中心空间扩大的解释.

Abstract：

Objective To analyze and evaluate the characteristics of enzyme kinetics of CTX-M-14 type extended-spectrum β-lactamase(ESBL) with Pro167 residue substitution. Methods By molecular cloning and PCR techniques, CTX-M-14 gene was directionally cloned into plasmid pET28a( + ) from a clinical E. coli isolate and formed an expression vector to transform competent E. coli BL21 (DE3 ). Prol67 residue substitutions of P167G, P167Q, P167S and P167T were introduced to CTX-M-14 by site-directed muta-genesis based on overlap extension PCR with the former recombinant plasmid as PCR template, respectively.The wild-type CTX-M-14, recombinant CTX-M-14 protein and its variants were expressed and purified, then their steady-state kinetic parameters (Kcat, Km and Kcat/Km ) against β-lactam antibiotics were determined.Results The kinetic parameters of wild-type and recombinant CTX-M-14 had no statistically significant differences (P>0.1). The 1/Km, Kcat and Kcat/Km values of P167S variant against ceftazidime were 16-fold, 2.87-fold and 43.6-fold higher than those of recombinant CTX-M-14, respectively, and the Kcat/Km value of P167S variant against penicillin, ampicillin, cefazolin, cefuroxime, ceftriaxone, cefotaxime decreased( < 0.05). Compared with the kinetic parameters of recombinant CTX-M-14, the kinetic parameters of P167T variant against ceftazidime had no significant change, but the Kcat values of P167Q and P167G variants decreased dramatically(P<0.01). Conclusion There was no difference between the enzyme activities of wild-type and recombinant CTX-M-14. P167S variant could not only promote the enzyme affinity of CTX-M-14 to ceftazidime but also improve the conversion rate of enzyme-substrate complex in the ceftazidime hydrolysis. The comparison of the kinetic parameters of CTX-M-14 and its variants with Pro167 residue substitution showed that the increased activity of CTX-M ESBL variants against ceftazidime could not be simply explained with the enlarged cavity in active site that may be caused by the replacement of Pro167 residue by smaller amino acids.     

β-内酰胺酶分类及分子基因基础

细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制是产生了β-内酰胺酶，新的抗生素不断问世，助长了更多的β-内酰胺酶产生，本就β-内酰胺酶的最新分类、结构特征及分子基因基础作一介绍。     

耐Aztreonam阴沟杆菌β-内酰胺酶研究

选用4株耐Aztreonam(MIC≥50ug/ml)的β-内酰胺酶明显增高的阴沟杆菌,其中3株为用药物梯度平皿法筛出,另一株为临床直接分离得到。提取细菌β-内酰胺酶,取用紫外分光光度计与超薄层等电聚焦电泳技术,对4株耐药菌的β-内酰胺酶进行分析。研究结果指出,(1)对12种β-内酰胺抗生素的水解轮廓:4种菌药酶对Aztreonam,亚胺硫霉素,头孢噻甲羧肟和头孢氨噻的水解     

耐Aztreonam阴沟杆菌β-内酰胺酶研究

选用4株β-内酰胺酶明显增高的耐Aztreonam(AZ)(MIC≥50μg/ml)阴沟杆菌。采用紫外分光光光度计与超薄层等电聚焦电泳技术,对4株耐菌的β-内酰胺酶从水解底物轮廓、对酶抑制剂敏感性及等电点(PI)三方面进行分析。结果提示:耐药菌     

细菌β-内酰胺酶及外膜蛋白改变与耐药

用试管二倍稀释法,检测β-内酰胺抗生素及非β-内酰胺抗生素共11种对5株耐Aztreonam(AZ)阴沟杆菌及其相应敏感株的MIC。并分离提取细菌β-内酰胺酶及外膜,采用紫外分光光度计及SDS-聚丙烯酰胺凝     

细菌β-内酰胺酶及外膜蛋白改变与耐药

用试管肉汤二倍稀释法,检测β-内酰胺抗生素及非β-内酰胺抗生素共11种对5株耐Aztreonam(AZ)阴沟杆菌和4株相应敏感菌的MIC。采用紫外分光光度计及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测细菌β-内酰胺酶及外膜蛋白,分析它们在细菌耐药性中的作用。研究结果指出,4株耐AZ菌株,β-肉酰胺酶明显升高。对青霉素类和头孢菌素类耐药     

产超广谱β-内酰胺酶细菌的耐药性分析

目的:探讨产ESBLs菌的发生率、耐药特点,为临床治疗提供参考。方法:采用微量肉汤稀释法对139株大肠埃希菌、64株肺炎克雷伯菌和17株产酸克雷伯菌做药敏试验,同时用纸片扩散法确证产ESBLs菌。结果:产ESBLs菌的检出率分别为:大肠埃希菌41.7%(2007年)和46.8%(2008年);肺炎克雷伯菌25%(2007年)和52.3%(2008年);产酸克雷伯菌66.7%(2007年)和50%(2008年),产ESBLs菌耐药率普遍高于非产ESBLs菌(P<0.01或P<0.05)。结论:常规检测和监测产ESBLs菌十分必要,这对指导临床合理用药、有效控制感染的传播意义重大。     

新四代头孢菌素β-内酰胺酶稳定性的研究

目的　研究第四代注射用头孢菌素头孢匹罗对 8株包括质粒介导与染色体介导产酶菌株 β -内酰胺酶的稳定性 ,并与其它 4种头孢菌素进行比较 .方法　采用超声波破碎法提取细菌 β -内酰胺酶 ,紫外分光光度法测定酶对抗生素的水解率 .结果　头孢匹罗对各产酶菌株 β -内酰胺酶的相对水解率 <5 % ,尤其对质粒介导的超广谱 β -内酰胺酶TEM - 3、SHV - 4及染色体介导Ⅰ型 β-内酰胺酶的稳定性明显优于头孢噻肟及其他头孢菌素 .结论　头孢匹罗对 β -内酰胺酶具有高度稳定性     

新四代头孢菌素β-内酰胺酶稳定性的研究

目的研究第四代注射用头孢菌素头孢匹罗对8株包括质粒介导与染色体介导产酶菌株β-内酰胺酶的稳定性,并与其它4种头孢菌素进行比较.方法采用超声波破碎法提取细菌β-内酰胺酶,紫外分光光度法测定酶对抗生素的水解率.结果头孢匹罗对各产酶菌株β-内酰胺酶的相对水解率<5%,尤其对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶TEM-3、SHV-4及染色体介导Ⅰ型β-内酰胺酶的稳定性明显优于头孢噻肟及其他头孢菌素.结论头孢匹罗对β-内酰胺酶具有高度稳定性.     

超广谱β-内酰胺酶基因分型的初步研究

按质粒所携带编码基因同源性的不同 ,将超广谱 β 内酰胺酶 (Ｅｘｔｅｎｄｅｄｓｐｅｃ ｔｒｕｍ β ｌａｃｔａｍａｓｅｓ,ＥＳＢＬｓ)分为 4类 ,即ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＴＥＭ ＳＨＶ混合型和非ＴＥＭ 非ＳＨＶ型 (包括ＰＥＲ、ＴＯＨＯ、ＣＴＸ Ｍ、ＯＸＡ型等 )。本文报告绍兴地区产ＥＳＢＬｓ细菌基因分型的初步结果。临床标本分离、并经纸片扩散法确证为产ＥＳＢＬｓ的细菌 42株 (其中大肠埃希菌 2 6株 ,肺炎克雷伯菌 16株 )。用ＰＣＲ进行酶基因分型。ＰＣＲ扩增引物 ,根据ＴＥＭ 1和ＳＨＶ 1编码基因序列设计 ,ＴＥＭ引物序列分别为…     

检测铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶方法比较

目的：探讨检测金属β-内酰胺酶的可靠方法。方法：收集临床分离耐亚胺培南的铜绿假单胞菌8株及产IMP-1金属争内酰胺酶标准株一株,分别采用纸片增效法和双纸片协同实验检测金属酶表型,比较其结果。结果和结论：纸片增效法容易出现假阳性结果,而纸片协同法是相对可靠的检测金属酶的方法。